El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

El objetivo general de este procedimiento es detectar agentes producidos por una cepa bacteriana que sean inhibidores de la segunda cepa bacteriana. Este método puede ayudar a responder preguntas en varios campos microbiológicos, pero es particularmente útil en ecología microbiana, en la comprensión de las interacciones bacterianas antagónicas. La principal ventaja de esta técnica es que es barata y fácil de realizar e interpretar.

La demostradora del procedimiento estará a cargo de Aretha, una estudiante en el laboratorio. Para comenzar el experimento, inocule una sola colonia de jeringas P en 3 mililitros de caldo King's Medium B, o KB. Incuba el cultivo durante la noche. A la mañana siguiente, diluya el cultivo de caldo de 1 a 100 en 3 mililitros de caldo KB fresco.

Incubar el cultivo durante tres o cuatro horas agitando a temperatura ambiente. Asegúrese de que el cultivo tenga un aumento notable en la turbidez y luego agregue Mitomicina C. A continuación, incube el cultivo durante la noche agitando a temperatura ambiente. Al día siguiente, se administraron de uno a dos mililitros de cultivos inducidos por mitomicina C en una microcentrífuga de sobremesa.

Retire y esterilice los sobrenadantes del cultivo pasando el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 micrómetros. Agregue cloruro de sodio hasta alcanzar una concentración de un molar y agregue polietilenglicol, o PEG 8000, hasta una concentración final del 10%, al sobrenadante estéril. Invierta repetidamente las muestras hasta que tanto el cloruro de sodio como el PEG se disuelvan por completo.

Incubar las muestras en un baño de hielo durante una hora. A continuación, centrifuga las muestras. Después de girar, decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el tampón pipeteando repetidamente.

Elimine el PEG residual mediante dos extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo. Combine con cloroformo con el pellet resuspendido y agite la mezcla durante 15 segundos. A continuación, centrifugar la mezcla a 20.000 veces G durante cinco minutos.

Transfiera la fase acuosa superior a un tubo de microfuga fresco. Repita esta extracción dos veces, hasta que no se vea ninguna interfaz blanca entre la fase acuosa y la orgánica. Permita que el cloroformo residual se evapore de los sobrenadantes extraídos en una campana extractiva.

Inocular una sola colonia de una cepa de P syringae en tres mililitros de KB e incubar el cultivo durante la noche agitándolo a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, diluya el cultivo de 1 a 100 en KB nuevo. Incubar el cultivo durante tres o cuatro horas agitando a temperatura ambiente. A continuación, prepare agar agua esterilizada esterilizando en autoclave una suspensión de agar en agua ultrapura.

Mantenga el agar blando fundido en un baño de agua a 60 grados centígrados antes de usarlo. Con una pipeta serológica estéril, transfiera tres mililitros de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Regrese el tubo de cultivo al baño de agua para mantenerlo en estado fundido.

Antes de verter la superposición, deje que el agar fundido se enfríe, pero no permita que se solidifique. Es fundamental que el agar se mantenga en un estado caliente y completamente fundido antes de la inoculación. De lo contrario, la superposición tendrá una apariencia granulada y será más difícil de interpretar.

En una campana estéril, inocule 100 microlitros del cultivo de cepa del probador en el agar blando y el vórtice para mezclar. Gire el cultivo a mano durante 10 a 15 segundos, luego viértalo en el fondo de una placa de agar. Incline la placa en todas las direcciones para asegurarse de que el agar blando cubra uniformemente el agar inferior.

Cubra el plato y deje que se solidifique de 20 a 30 minutos. Tenga cuidado de no alterar la placa mientras se solidifica. Una vez solidificado, coloque de dos a cinco microlitros de sobrenadante en la superposición.

Deje que las placas se incuben durante la noche a temperatura ambiente. Observe y registre los resultados a la mañana siguiente. Con este método, dos cepas de P syringae son inhibidas por diferentes bacteriocinas.

La cepa A es sensible a una bacteriocina de alto peso molecular tailocina, pero no es sensible a una bacteriocina alternativa de bajo peso molecular. Por el contrario, la cepa B es insensible a la tailocina, pero es sensible a la bacteriocina de bajo peso molecular. La tailocina se recupera de manera eficiente después de la precipitación de PEG, mientras que las bacteriocinas de menor peso molecular no lo hacen.

La muerte mediada por bacteriófagos se distingue de otros antimicrobianos no replicativos al comparar una serie de dilución. En el caso del aclaramiento mediado por bacteriófagos, la dilución del sobrenadante se resolvió en placas individuales o zonas de aclarado, mientras que el aclaramiento mediado por bacteriocina no se resolvió en dichas placas. Este procedimiento se puede utilizar como un cribado inicial para identificar los agentes inhibidores, y se puede combinar con manipulaciones genéticas posteriores para identificar o confirmar la fuente de esta actividad.