Name: El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a detectar compuestos inhibidores bacterianos mediante la técnica de superposición en agar blando usando cepas de P. syringae. Este método económico facilita el estudio de interacciones microbianas antagonistas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por la subvención competitiva de la Iniciativa de Investigación en Agricultura y Alimentación 2015-67012-22773 del Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA a K.L.H.

1. Preparación del sobrenadante someterse a ensayo de Actividad <ol><li> Preparar una solución madre de 0,5 mg / ml de mitomicina C por disolución de la cantidad apropiada en estéril M MgSO 4 tampón 0.1 (por ejemplo, / 2 ml de tampón de 1 mg de mitomicina C). Stock de almacén a 4 ° C en un recipiente protegido de la luz (mitomicina C es sensible a la luz). </li><li> Inocular una sola colonia de P. syringae en 3 ml de medio B de King (KB) de caldo de 14. Incubar durante la noche con agitación (200 rpm) a temperatura ambiente (21-25 ° C). </li><li> A la mañana siguiente, diluir el caldo de cultivo 1/100 en 3 ml de caldo de KB fresco. Incubar durante 3-4 horas con agitación a temperatura ambiente. Añadir mitomicina C (0,5 g / ml, concentración final). Incubar el cultivo durante la noche con agitación a temperatura ambiente. NOTA: La mitomicina C causa roturas de ADN de cadena doble, estimulando así la respuesta SOS de la célula, dando lugar a la producción tanto de bacteriófago y bacteriocinas. </li><li> Pellet 1-2 ml de mitomicina C inducida cultivos por centrifugación a 20.000 xg durante 5 min en una microcentrífuga de mesa de trabajo. </li><li> Retirar y esterilizar los sobrenadantes de cultivo, ya sea haciendo pasar el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro 0,22 micras o por tratamiento del sobrenadante con cloroformo (100 cloroformo l por 1 ml de sobrenadante). <ol><li> Si se utiliza cloroformo y agitar la mezcla durante 15 segundos y dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. NOTA: cloroformo mata eficazmente células mediante la solubilización de sus membranas. El beneficio del uso de cloroformo durante la esterilización del filtro es que es más barato y más fácil de aumentar la escala de si el procesamiento de muchos (&gt; 20) muestras a la vez. Puede haber una posibilidad de que una actividad de eliminación dada se pierde después del tratamiento cloroformo como resultado de la partición en la fase orgánica. </li><li> Retire la fase acuosa superior utilizando una pipeta de 1 ml a un nuevo máximo, estériles 1,5 ó 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no transferir cualquiera de la capa inferior de cloroformo (es mejor para eliminar menos de la fase acuosa para evitar arrastre). </li><li> Incubar el sobrenadante se transfirió destapado en una campana de ventilación para permitir que el cloroformo residual se evapore (varias horas). sobrenadantes se almacenan a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Separación y concentración de alto peso molecular compuestos bactericidas por Polietilenglicol Precipitación (PEG) <ol><li> Al sobrenadante estéril, añadir NaCl y PEG 8000 hasta 1 M y 10% concentraciones finales, respectivamente. Repetidamente invertir la muestra hasta que tanto el NaCl y PEG se haya disuelto por completo. Incubar las muestras en un baño de hielo durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Un pellet debe formar en la parte inferior del tubo de centrífuga. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en el volumen deseado (por ejemplo, un décimo o un centésimo del sobrenadante original, volume) de tampón (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) mediante pipeteo repetido. </li><li> Eliminar PEG residual por dos extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo. <ol><li> Combinar con cloroformo precipitado resuspendido y agitar durante 10 segundos y 15 segundos, a continuación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga. Repetir esta extracción hasta que no interfase blanca entre la fase acuosa y orgánica es visible (por lo general 2 extracciones en total). Permitir cloroformo residual se evapore a partir de sobrenadantes extraídos en una campana de humos. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de superposición y sobrenadantes para la Actividad <ol><li> Se inocula una sola colonia de una cepa de P. syringae a ensayar para la sensibilidad en 3 ml de KB, se incuba durante la noche con agitación a temperatura ambiente. </li><li> A la mañana siguiente, volver a diluir la cultura 1/100 en KB fresco. Incubar 3-4 horas con agitación a temperatu de la habitaciónre. </li><li> Preparar agar agua esterilizada en autoclave una suspensión 0,35-0,7% de agar en agua ultrapura (v / w). NOTA: Un balance de agar agua blanda se puede fundir en el microondas y reutilizarse varias veces, superposición fresca no tiene que estar preparado para cada experimento. Si se vuelve a utilizar agar agua, es fundamental para asegurar que se derrita por completo tras el microondas. Si no, el recubrimiento tendrá una textura granulada en solidificación que hará difícil interpretación. Si esto ocurre, fundir el agar durante varios minutos más largos en el microondas de hecho previamente. </li><li> Mantener el agar blando fundido en un baño de agua C 60 ° antes de su uso. Con una pipeta serológica estéril, la transferencia de 3 ml de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Vuelva a colocar el tubo de cultivo de baño de agua para mantener en un estado fundido. </li><li> Para verter la superposición, deje que el agar fundido se enfríe (que debe sentirse tibia, no caliente al tacto), pero no permita que se solidifique. </li><li> En una campana estéril, inocular 100 l dela cultura cepa de ensayo en el agar suave y agitar para mezclar. Girar la cultura con la mano durante 10-15 segundos, luego se vierte en una parte inferior de agar (agar KB). Inclinar la placa en todas las direcciones para asegurar el agar blando cubre uniformemente el agar inferior. NOTA: Este medio puede ser cualquier parte inferior (1,5% de agar) medio solidificado en la que la cepa de ensayo crece vigorosamente. Para un diámetro del plato estándar de Petri de 100 mm, use ~ 20 ml fundieron medio. El agar parte inferior se puede preparar varias semanas antes de tiempo (si se mantiene a 4 ° C sin secado) o pueden ser preparados el mismo día. Si se prepara el mismo día de la realización de la superposición, lo mejor es hacerlo antes de la etapa 3.4. </li><li> Cubrir la placa y dejar que se solidifique 20-30 min. Tenga cuidado de no molestar a la placa, mientras que la solidificación. </li><li> Una vez solidificado, Colocar 2,5 l de sobrenadante (generada en las secciones 1 y 2, más arriba) sobre la superposición. Permitir a las placas para incuban durante la noche a temperatura ambiente. Observar y registrar los resultados de la mañana siguiente. NOTA:puede ser útil para realizar y detectar a partir de una dilución en serie del sobrenadante. Esto permitirá a los investigadores distinguir entre el bacteriófago y la actividad de compensación bacteriocina. En este caso, se recomienda llevar a cabo 1: 5 o diluciones 1:10. </li></ol>

<ol><li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+of+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li>
<li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth%27s+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li>
<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li>
<li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li>
<li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colicin+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+and+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li>
<li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+Microbial+Invasions%3A+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li>
<li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li>
<li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li>
<li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li>
<li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+of+Plant-Associated+Bacteria%22%5BJournal%5D)">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li>
<li>Panec, M., Katz, D. S. Plaque Assay Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols">Microbelibrary.org at http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3073-plaque-assay-protocols</a> (2013).</li>
<li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Inst+Pasteur%22%5BJournal%5D)">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652(1936).</li>
<li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li>
<li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeng%2C+NCK+%22Bacteriocins%22">Bacteriocins</a>. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li>
<li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La técnica de superposición de agar blando se describe aquí se ha aplicado ampliamente para muchas décadas por los investigadores interesados ​​en bacteriófagos o bacteriocinas. Los principales beneficios de este enfoque son que es simple, barato y relativamente fácil de interpretar. Mediante la combinación de la superposición en agar blando con precipitación con PEG y de dilución en serie, los agentes antimicrobianos se pueden separar en altas frente a agentes de bajo peso molecular, y replicativas vs. no replicativo agentes (es decir, bacteriófago vs. tailocin, respectivamente). Finalmente, la incorporación de manipulación dirigida genética (supresión y complementación) de bacteriocina putativo o loci profago puede establecer firmemente la identidad de un compuesto antagonista dado. Recientemente, hemos utilizado este método para describir un nuevo derivado del bacteriófago bacteriocina frecuente entre las cepas de Pseudomonas syringae 9. Los medios de cultivo y condiciones indicados en el presente trabajo protocolo bien para Pseudomonas SYringae y probablemente sería suficiente para otras bacterias Gram-negativas que crecen vigorosamente bajo estas condiciones. Sin embargo, los investigadores que usan este método se desea optimizar el tiempo, medio de cultivo, el método de inducción, y la temperatura de incubación para su sistema. Los parámetros críticos incluyen la inducción de la producción de cultivo, mientras que en la fase de crecimiento logarítmica, así como la siembra de la superposición en agar blando con suficiente cultivo en fase logarítmica para asegurar una distribución uniforme de bacterias, pero no excesiva cultura, que oscurecer posibles zonas de compensación. Hay muchos bacteriocinas que no son inducidas como parte de la respuesta SOS, sino que son inducidos a través de sistemas de detección de quórum basados en péptidos (en particular, las bacteriocinas Gram-positivas 15), por lo tanto, un investigador puede querer evaluar a varios métodos de inducción diferentes (por ejemplo, modificar el contenido de nutrientes del medio inductor, o permitir que para la incubación ampliada de la cepa productora). Cuando usasesta técnica, la superposición en agar blando debe ser fundido a fondo y se mantiene a 55-60 ° C antes de la adición de la cepa de la siembra. Hemos tenido varios experimentos en los que el agar blando no se funde completamente (aunque visualmente que parecía ser) y dio lugar a una superposición con un aspecto granulado. Los resultados de una superposición de granulado pueden todavía ser generalmente interpretable, sin embargo, esto depende de la fuerza de la inhibición (inhibición más débil será más difícil de observar). A, variable de confusión final a considerar cuando se utiliza esta técnica es que se permite que la temperatura del agar fundido suficiente tiempo para enfriarse antes de la inoculación con la cepa de la siembra, con el fin de evitar la muerte de la cepa de la siembra. Para evitar este problema, nos aseguramos el agar blando es cálido, pero no caliente, para tocar. En esta línea, también hemos observado que si nos damos un tiempo inadecuado para un cultivo de siembra para aclimatarse a la agar fundido, antes de verter la superposición, que se recuperan generalmente pobre g bacterianarecimiento, que hace que la interpretación de la inhibición específica difícil o imposible de interpretar. Esto es por qué permitimos 10-15 segundos adicionales de incubación entre la vórtex y vertiendo la superposición. El equilibrio entre el mantenimiento de la agar en un estado completamente fundido (más caliente es mejor) pero no letal para la cepa de siembra (más caliente no es mejor) es uno que probablemente tendrá que ser determinado por un investigador a través de ensayo y error. Si se utiliza una etapa de precipitación con PEG, sería beneficioso incluir un control negativo donde un medio de caldo estéril se procesa de forma idéntica al sobrenadante del cultivo. Esto asegurará que la muerte de actividad no es el resultado de PEG residual o cloroformo en el sobrenadante de la muestra. Como ambos bacteriófagos y bacteriocinas tienden a ser altamente específico, no es raro encontrar ninguna actividad de eliminación aparente con una combinación dada de cepas. Esto puede resultar de una variedad de re-cepa específicasistance mecanismos, uno de ellos que la cepa de ensayo o bien carece o tiene una versión no reconocida de los receptores necesarios para la orientación de una bacteriocina o bacteriófago dado. Un método alternativo, el método de detección de bacteriocina ha sido descrito por Kawai et al. , Pero adolece de inconvenientes y no ha sido ampliamente adoptado 16. Específicamente, esta técnica requiere la observación de muestras de caldo a intervalos de tiempo que pueden ser una carga, y no permite que para la discriminación entre las actividades de matanza-bacteriófagos derivados y derivados de bacteriocina. Las principales limitaciones de esta técnica es que no es muy adecuado para los organismos que no crecen robustamente (y por lo tanto se verá privada de zonas de compensación fácilmente discernibles) o que prophages puerto o bacteriocinas que no se producen robusta en condiciones de laboratorio. La adaptación de esta técnica para detectar las bacteriocinas producidas en muestras ambientales que tanto ampliar la utilidadde esta técnica y facilitar una mayor comprensión de la función de las bacteriocinas dentro de un ambiente natural.

Recientemente, ha habido un interés significativo en la profundización de nuestra comprensión de la ecología microbiana (en particular las microbiomas de varios ambientes), así como nuevos compuestos antibacterianos para utilizar en la lucha contra los patógenos resistentes a los antibióticos 1,2. Un tema de la interconexión entre estos intereses es la comprensión de las interacciones antagónicas entre las cepas bacterianas en su ambiente natural. Existen numerosas formas en que las bacterias antagonizan competidores 3. Las bacteriocinas, un grupo diverso de compuestos proteicos, antibacterianos, durante mucho tiempo han sido estudiados por su papel en la mediación de antagonismo interbacterial, con dos de las especies más estudiadas son Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 4,5 6, importantes patógenos humanos. Además de bacteriocinas, prophages inducidos también pueden actuar como agentes anticompetitor, lo que permite una cepa de invadir en un nicho que ya está colonizada 7. Pseudomonas syringae es un patógeno de la planta conocida para producir una gran variedad de agentes antimicrobianos, incluyendo bacteriocinas sola proteína 8, bacteriocinas de la cola de bacteriófagos derivados de 9 (denominados tailocins), así como metabolitos secundarios no proteínicos 10. Recientemente ha habido interés en la comprensión de cómo estos antimicrobianos influyen en la ecología de este organismo, así como la forma en que se pueden aprovechar para el control de enfermedades de las plantas 11. Un método ampliamente utilizado para el estudio de ambas bacteriocinas y bacteriófago es la técnica de superposición en agar blando. Este método fue descrito por primera vez por Gratia en 1936 para ayudar en la enumeración de bacteriófago 12,13. Aquí se describe la aplicación del método de superposición en agar blando, en combinación con la manipulación genética dirigida y precipitación con polietilenglicol (PEG), para distinguir entre los tres agentes antimicrobianos diferentes (un bacteriófago, un bact de alto peso moleculareriocin, y una bacteriocina de bajo peso molecular) producida por una única cepa bacteriana. El beneficio de este enfoque es que es relativamente simple y barato, por lo que, a pesar de ser decididamente &#39;baja tecnología&#39;, todavía se utiliza ampliamente.

<table><tbody><tr><td>Mitomicina C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogénico. use EPP adecuado (es decir, guantes, protección ocular y mascarilla), especialmente cuando prepare la solución madre.</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Tóxico agudo, peligro respiratorio. Use el equipo de protección personal adecuado (guante y protector ocular), manipule los recipientes abiertos dentro de una campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Polietilenglicol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Agar de grado bacteriológico</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de la técnica de superposición soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

La técnica de superposición de agar blando se desarrolló originalmente hace más de 70 años y ha sido ampliamente utilizado en varios campos de investigación microbiológica, incluyendo el trabajo con los bacteriófagos y bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicos. Este enfoque es relativamente barato, con requisitos mínimos de recursos. Esta técnica consiste en la detección de sobrenadante de una cepa donante (potencialmente albergar un compuesto (s) tóxico) sobre una capa de agar blando solidificada que se siembra con una cepa de prueba bacteriana (potencialmente sensible al compuesto tóxico (s)). Hemos utilizado esta técnica para seleccionar una biblioteca de cepas de Pseudomonas syringae para matar intraespecífica. Mediante la combinación de este método con una etapa de precipitación y deleciones de genes específicos, múltiples compuestos tóxicos producidos por la misma cepa se pueden diferenciar. Los dos agentes antagónicos comúnmente recuperados usando esta técnica son bacteriófagos y bacteriocinas. Estos dos agentes se pueden distinguir empleandodos pruebas adicionales simples. Realización de una dilución en serie en un sobrenadante que contenía bacteriófago se traducirá en placas individuales haciéndose menos en número con mayor dilución, mientras que la dilución en serie de un sobrenadante que contiene bacteriocina resultará una zona de compensación que se hace uniforme más turbia con mayor dilución. Además, un bacteriófago producirá una zona de compensación cuando manchado sobre una capa de agar blando fresco sembrado con la misma cepa, mientras que una bacteriocina no producirá una zona de compensación cuando se transfiere a un césped de agar blando fresco, debido a la dilución de la bacteriocina.

La combinación de la capa de agar blando y precipitación con PEG se puede utilizar para identificar y caracterizar los diferentes agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La figura 1 muestra dos cepas de P. syringae (A y B) que se inhibe por tercera cepa de la misma especie. Las dos cepas, sin embargo, son inhibidas por diferentes bacteriocinas. La zona de intercambio de información sobre la cepa A presenta un borde afilado, mientras que la zona de intercambio de información sobre la cepa B es más grande, y presenta un borde no cortante. Las manipulaciones genéticas dentro de la cepa que produce que inactivan específicamente ya sea la tailocin (tailocin deficiente) o de bajo peso molecular bacteriocina de confirmación (bacteriocina deficiente) que las cepas A y B son sensibles a bacteriocinas distintos. La Figura 2 muestra que la matanza bacteriófago mediada se puede distinguir de otros antimicrobianos no replicativos mediante la comparación de una serie de dilución. Debido a que ambas bacteriocinas yprofago puede ser inducida por el tratamiento con mitomicina C, las actividades de estos dos agentes pueden se parecen mucho unos a otros (en particular si el fago activado es abundante). En el caso de la compensación bacteriófago mediada, la dilución del sobrenadante resolverá en placas individuales (zonas de compensación), mientras que de facilitación bacteriocina mediada no resolverá en tales placas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figura 1: distinción fenotípica de múltiples agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La cepa A es sensible a una bacteriocina de alto peso molecular (tailocin), pero no un peso molecular bajo alternativa bacteriocina, como se evidencia por la falta de limpieza de la cepa deficiente en tailocin, pero no la cepa deficiente de bacteriocina. Por el contrario, la cepa B es insensible a la tailocin, pero es sensible a la bacteriocina de bajo peso molecular. El tailocin es efficiently recuperada tras la precipitación con PEG, mientras que las bacteriocinas de bajo peso molecular no lo son. WT = tipo salvaje. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figura 2: Distinguir entre los antimicrobianos y bacteriófagos no replicativa. (A) La dilución de un título elevado de bacteriófagos resultados en placas individuales que se convierten en menos numerosos (parte superior de alto título, bajo el título de abajo). (B) La dilución de los resultados de bacteriocinas en menos uniformemente claro que no se resuelve en placas individuales. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Describimos un método sencillo para el cribado de cultivos bacterianos para la producción de compuestos inhibidores hacia otras bacterias.

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar agentes producidos por una cepa bacteriana que resulten inhibitorios frente a una segunda cepa bacteriana. Este método puede ayudar a responder preguntas en diversos campos de la microbiología, pero es especialmente útil en ecología microbiana, para comprender las interacciones bacterianas antagonistas. La principal ventaja de esta técnica es que es económica, fácil de realizar e interpretar.La estudiante del laboratorio Aretha demostrará el procedimiento. Para comenzar el experimento, inocule una colonia individual de P syringae en 3 mililitros de caldo Medio B de King, o KB. Incube la cultura durante la noche. A la mañana siguiente, diluya la cultura de caldo en una proporción de 1 a 100 en 3 mililitros de caldo KB fresco.Incube la cultura durante tres a cuatro horas con agitación a temperatura ambiente. Asegúrese de que la cultura presente un aumento notable en turbidez y luego agregue Mitomicina C. A continuación, incube la cultura durante la noche con agitación a temperatura ambiente. Al día siguiente, haga un pellet de uno a dos mililitros de cultivos inducidos con Mitomicina C en una microcentrífuga de banco.Retire y esterilice los sobrenadantes de cultivo pasando el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micrómetros de tamaño de poro. Añada cloruro de sodio hasta alcanzar una concentración de un molar, y añada polietilenglicol, o PEG 8000, hasta una concentración final del 10 %, al sobrenadante estéril. Invierta repetidamente las muestras hasta que el cloruro de sodio y el PEG se disuelvan completamente.Incube las muestras en un baño de hielo durante una hora. A continuación, centrifugue las muestras. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado en tampón pipeteando repetidamente.Elimine el PEG residual mediante dos extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo. Combine el cloroformo con el pellet re-suspendido y vortexee la mezcla durante 15 segundos. Luego, centrifugue la mezcla a 20.000 × g durante cinco minutos.Transfiera la fase acuosa superior a un tubo microc&eacute;ntrifugo nuevo. Repita esta extracci&oacute;n dos veces, hasta que no sea visible ninguna interfase blanca entre la fase acuosa y la org&aacute;nica. Permita que el cloroformo residual se evapore de los sobrenadantes extra&iacute;dos en una campana extractora.Inocular una colonia individual de una cepa de P. syringae en tres mililitros de KB, e incubar el cultivo durante la noche con agitación a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, diluir el cultivo 1 a 100 en KB fresco. Incubar el cultivo durante tres a cuatro horas con agitación a temperatura ambiente. A continuación, preparar agar de agua esterilizado autoclavando una suspensión de agar en agua ultra pura.Mantenga el agar blando fundido en un baño de agua a 60 grados Celsius antes de su uso. Utilizando una pipeta serológica estéril, transfiera tres mililitros de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Devuelva el tubo de cultivo al baño de agua para mantenerlo en estado fundido.Antes de verter la capa superior, permita que el agar fundido se enfríe, pero no permita que se solidifique. Es fundamental que el agar se mantenga en un estado caliente y completamente líquido antes de la inoculación. De lo contrario, la capa superior tendrá una apariencia granulosa y será más difícil de interpretar.En una cabina estéril, inocule 100 microlitros de la cultura de la cepa indicadora en el agar blando y vortex para mezclar. Gire la cultura manualmente durante 10 a 15 segundos, luego viértala sobre el fondo de una placa de agar. Incline la placa en todas las direcciones para asegurar que el agar blando cubra uniformemente el agar del fondo.Cubra la placa y déjela solidificar durante 20 a 30 minutos. Tenga cuidado de no mover la placa durante la solidificación. Una vez solidificada, aplique dos a cinco microlitros del sobrenadante sobre la capa superior.Deje que las placas incuben durante la noche a temperatura ambiente. Observe y registre los resultados a la mañana siguiente. Mediante este método, dos cepas de P syringae son inhibidas por bacteriocinas diferentes.La cepa A es sensible a una Tailocina, bacteriocina de alto peso molecular, pero no es sensible a una bacteriocina alternativa de bajo peso molecular. Por el contrario, la cepa B es insensible a la Tailocina, pero es sensible a la bacteriocina de bajo peso molecular. La Tailocina se recupera eficientemente tras la precipitación con PEG, mientras que las bacteriocinas de menor peso molecular no se recuperan.La eliminación mediada por bacteriófagos se distingue de otros antimicrobianos no replicativos mediante la comparación de una serie de diluciones. En el caso de la eliminación mediada por bacteriófagos, la dilución del sobrenadante dio lugar a placas individuales o zonas de clarificación, mientras que la eliminación mediada por bacteriocinas no se resolvió en tales placas. Este procedimiento puede utilizarse como una prueba inicial para identificar agentes inhibitorios y puede combinarse con manipulaciones genéticas posteriores para identificar o confirmar el origen de esta actividad.

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Cuando se trabaja con medios y reactivos utilizados para los microorganismos de cultivo, una técnica aséptica debe ser practicada para asegurar la contaminación se minimiza. Una variedad de métodos de enchapado se utilizan habitualmente para aislar, propagar, o bacterias enumerar y fagos, todos los cuales incorporan procedimientos que mantienen la esterilidad de materiales experimentales.

Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

Fuente: Rugjee, K. N., et al. Establecimiento de una configuración de alto rendimiento para el cribado de moléculas pequeñas que modulan la señalización de c-di-GMP en Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).Este video demuestra la detección de moduladores cíclicos de di-GMP utilizando bacterias modificadas genéticamente que expresan proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor sensible a c-di-GMP. La fluorescencia se mide en una placa de pocillos múltiples que contiene...

Cribado de moduladores cíclicos de di-GMP utilizando bacterias que expresan una proteína indicadora fluorescente 

Fuente: Hockett, K. L. y Baltrus, D. A. Uso de la técnica de superposición de agar blando para detectar compuestos inhibidores producidos por bacterias. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo muestra el procedimiento para detectar la muerte mediada por bacteriocina detectando sobrenadante de una cepa donante inducida por antibióticos sobre una capa de agar blando que contiene una cepa de prueba. Las zonas claras formadas tras la incubación indican inhibición bacteriana.

Ensayo de superposición de agar blando para detectar la muerte mediada por bacteriocina en Pseudomonas syringae

Este video muestra el ensayo de inhibición del crecimiento diferido, utilizado para investigar cómo los compuestos antimicrobianos producidos por un tipo de bacteria afectan a otra cepa bacteriana competidora.

Un ensayo de inhibición del crecimiento diferido para evaluar el efecto de los compuestos antimicrobianos derivados de bacterias

La competencia en Streptococcus pneumoniae está mediada por bacteriocinas, pequeños péptidos antimicrobianos con actividad inhibitoria hacia el neumococo y otras especies relacionadas. Aquí describimos un ensayo de superposición bacteriana optimizado que permite la caracterización de la actividad de la bacteriocina y el espectro inhibitorio, la inmunidad específica de la bacteriocina y la detección de péptidos de detección de quórum secretados.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

En este artículo se describe el ensayo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para examinar grandes bibliotecas de moléculas pequeñas por su potencial capacidad para manipular los niveles celulares de cíclico di-GMP en Pseudomonas aeruginosa, que proporciona una nueva y poderosa herramienta para el descubrimiento de fármacos antibacterianos y ensayar los compuestos.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

El ensayo de inhibición del crecimiento diferido se puede utilizar para evaluar el efecto de la competencia de un aislado bacteriano sobre otro. La inhibición se cuantifica midiendo la zona de aclaramiento alrededor del aislado productor de inhibidores, o se evalúa cualitativamente determinando el grado visible de inhibición.

Crecimiento diferida Ensayo de inhibición para cuantificar el efecto de antimicrobianos de bacterias derivadas de la Competencia

Este estudio presenta el desarrollo de metodologías reproducibles para estudiar los inhibidores de biopelículas y sus efectos sobre la multicelularidad de Bacillus subtilis.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

Combinaciones de fármacos sinérgicos son difíciles y lleva mucho tiempo identificar empíricamente. Aquí, describimos un método para identificar y validar sinérgicas pequeñas moléculas.

Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición2

En este documento de método, presentamos una estrategia de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos, como los osmolitos, que tienen un impacto significativo en la persistencia bacteriana.

Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

Aprende a detectar compuestos inhibidores bacterianos mediante la técnica de superposición en agar blando usando cepas de P. syringae. Este método económico facilita el estudio de interacciones microbianas antagonistas.

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

Explorar más videos