Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

El objetivo general de este procedimiento es establecer tumores renales ortotópicos de ratón mediante la implantación intrarrenal de células tumorales para el estudio del crecimiento tumoral y la metástasis y la eficacia de las terapias antitumorales. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la oncología urológica, como la eficacia de una nueva terapia en un modelo preclínico de cáncer de riñón. La principal ventaja de esta técnica es que el implante de tumor intrarrenal establece un tumor renal primario con metástasis pulmonar que imita la patogenia clínica del carcinoma de células renales.

Para preparar las células tumorales de Renca, primero se desprende el cultivo celular con tripsina al 0,25% y HBSS después de enjuagar con PBS. Neutraliza la reacción después de cinco minutos con Complete RPMI Medium. Transfiera las células a un tubo cónico para su centrifugación y vuelva a suspender el pellet en HBSS fresco.

Después de contar, ajuste el volumen a dos veces diez a la concentración de seis células por mililitro en HBSS, y extraiga las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 18. A continuación, coloque un paño quirúrgico estéril sobre una almohadilla térmica y confirme el nivel adecuado de sedación mediante un pellizco en los dedos de los pies. Retira el pelo del flanco izquierdo del ratón y aplica ungüento veterinario en los ojos.

A continuación, frote el lugar de la implantación con un antiséptico de povidona yodada al 5% y utilice un bisturí estéril para hacer una sola incisión de uno a un centímetro y medio en el flanco izquierdo, teniendo cuidado de no penetrar en el peritoneo. Con unas tijeras, separe la dermis del peritoneo, frotando el sitio de la incisión con una gasa de algodón estéril para eliminar la sangre. A continuación, agarre la cabeza con la mano izquierda y apoye el flanco con la mano derecha para localizar el bazo a través del peritoneo.

Con un dedo de la mano derecha, palpa el ratón desde abajo. El riñón debe hacerse visible. Manteniendo un agarre firme del animal para proporcionar tensión a través del peritoneo y el riñón, haga que un asistente administre lentamente 0,1 mililitros de células Renca a través del peritoneo intacto hacia el centro del riñón.

Sostenga la aguja en su lugar durante cinco a 10 segundos para reducir el reflujo de las células. Luego, cierre la incisión con una capa delgada de adhesivo tisular de cianoacrilato. En el punto final experimental, use tijeras para hacer una incisión en la línea media, comenzando en la mitad del abdomen a través de la caja torácica, el cuello y las glándulas salivales.

Con tijeras y fórceps, retire con cuidado las costillas sin comprometer el tejido pulmonar y retire el tejido conectivo para exponer la tráquea. Llene una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 18 con 10% de tinta china y PBS. Luego, use pinzas para enhebrar cuidadosamente una sutura de seda debajo de la tráquea y luego haga un nudo suelto.

A continuación, inserte con cuidado la aguja en la tráquea e infle lentamente los pulmones con uno a un mililitro y medio de la solución de tinta china. Tira del nudo con fuerza alrededor de la tráquea para inhibir el reflujo de la tinta, luego retira la aguja y corta con cuidado el tejido conectivo para eliminar los pulmones inflados. Fije los pulmones en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de la solución de Fekete en una campana de gases químicos a temperatura ambiente.

Después de 24 a 48 horas, retire los pulmones intactos y sin manchas y separe cuidadosamente los lóbulos en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Luego, cuente el número de nódulos tumorales blancos con un microscopio de disección. Una implantación exitosa de células Renca intrarrenales en ratones da como resultado el desarrollo de tumores en el riñón y metástasis en los pulmones con animales portadores de tumores que demuestran una carga tumoral robusta medida por el aumento de peso de los riñones implantados en el tumor.

Como se ha observado, los tumores Renca se pueden identificar mediante tinción inmunohistoquímica para citoqueratina 8 y 18. La implantación de una línea celular de Renca que expresa luciferasa permite el seguimiento de la carga tumoral en el riñón y la metástasis en el pulmón mediante imágenes bioluminiscentes, como lo confirma la inflación pulmonar de la India. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en menos de cinco minutos por ratón si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar identificar claramente el riñón a través del peritoneo para garantizar una implantación precisa del tumor intrarrenal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las pruebas preclínicas de medicamentos, para responder preguntas adicionales, como ¿hasta qué punto el nuevo medicamento afecta el crecimiento o la metástasis de los tumores intrarrenales? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la implantación de células tumorales intrarrenales para establecer tumores renales ortotópicos en el ratón.

No olvide que trabajar con animales vivos e instrumentos quirúrgicos puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como seguir las pautas institucionales de manejo de animales y mantener un área quirúrgica e instrumentos estériles mientras se realiza este procedimiento.