Name: Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a establecer tumores renales ortotópicos en ratones mediante implantación intrarrenal de células Renca para estudiar crecimiento tumoral y metástasis pulmonar. Este modelo preclínico permite evaluar terapias antitumorales en oncología urológica.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (R15CA173657 a AW y R01CA109446 a TSG), el Instituto de Cáncer Simmons (AW), y la Universidad de Minnestoa Climb Fundación 4 Cáncer Renal (TSG). Agradecemos al Dr. Kristin Anderson para obtener ayuda con la inmunofluorescencia.

El siguiente protocolo describe un procedimiento experimental para inducir y control del crecimiento de los tumores renales ortotópicos experimentales y cualquier metástasis espontáneas potenciales. Todos los siguientes procedimientos se realizan de conformidad con las políticas institucionales y procedimientos aprobados con respecto al uso humano de los animales de experimentación. 1. Mantenimiento de líneas celulares <ol><li> Mantener la línea celular de adenocarcinoma renal murino, Renca, en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, y 1 mM de cada uno de no esenciales aminoácidos, L-glutamina , y piruvato de sodio (referido como RPMI completo). Cultivar las células en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. NOTA: Como con cualquier línea celular establecida, se recomienda el uso de bajo número de pases células Renca para la transfección y la posterior implantación de minimizar cualquier fenotípicas o genéticas cambios que podrían ocurrir después de culto a largo plazoUre. <ol><li> Utilice un sistema de transposón para diseñar células Renca para expresar de forma estable la proteína verde fluorescente (GFP) y la luciferasa de luciérnaga. <ol><li> El uso de un catiónico reactivo de transfección a base de liposomas, co-transfectar células Renca con un vector de expresión de la transposasa (pPGK-SB11) y una codificación de transposón vector para la expresión de la luciferasa de luciérnaga, así como un gen que codifica la fusión de GFP y el gen de resistencia a zeocina , ambos bajo el control transcripcional de un promotor bidireccional (pKT2 / Lubig) 19. </li><li> Dos días después, la placa de las células transfectadas a una dilución limitante y permitir que las células se expanden en RPMI completo suplementado con zeocina (300 g / ml). Confirmar la expresión de GFP en cada clon mediante citometría de flujo. Estas células se denominan Renca-GL. NOTA: la clonación de dilución con limitación permitirá que las células seleccionadas que se derivan de una sola célula. </li></ol></li></ol></li><li> Para implantar células Renca intrarenally, preparar células Renca into una suspensión unicelular de 2 x 10 6 células / ml en solución salina equilibrada de Hank (HBSS). <ol><li> Retire células Renca adherentes del matraz de cultivo de tejido utilizando tripsina al 0,25% en HBSS. Después de ~ 5 min, añadir RPMI completo al matraz para neutralizar la tripsina y transferir las células a un tubo de centrífuga para el lavado. Centrifugar las células a 300 relativa fuerza g centrífugo (xg RCF) durante 5 min a 25 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante y resuspender las células en HBSS. Contar las células usando un hemocitómetro y ajustar el volumen con HBSS para dar 2 x 10 6 células / ml. </li><li> Dibujar las células en una jeringa de 1 ml, equipado con una aguja de calibre 18 para evitar que la tensión de cizallamiento sobre las células. Cambie la aguja de calibre 18 con una aguja de calibre 28 antes de la inyección de las células tumorales. Una inyección de 0,1 ml proporciona 2 x 10 5 células en el riñón. </li></ol></li></ol> 2. Surgical Preparación Area <ol><li> Preparar una quirúrgico estérilárea en una cabina de bioseguridad mediante la colocación de un paño quirúrgico estéril sobre una almohadilla de calefacción. Reunir todos los suministros, incluyendo fórceps, bisturí, tijeras, gotas para los ojos, 5% de gasa de povidona yodada antiséptico, y estéril. Autoclave todos los instrumentos antes de su uso. </li><li> Realizar la cirugía usando una técnica de punta aséptico. instrumentos vuelva a esterilizar entre los animales con un esterilizador de cuentas. Use guantes estériles, una bata de laboratorio, y una mascarilla. </li></ol> 3. Preparación de los animales <ol><li> Anestesiar a los ratones con ketamina / xilazina (87,5 mg / kg y 12,5 mg / kg, respectivamente, ip) de acuerdo con las directrices institucionales. Determinar la profundidad anestésica mediante la realización de un dedo del pie-pinch. </li><li> Cuando el animal se considera que no responde, preparar el sitio de la inyección (por ejemplo, flanco izquierdo) en ratones Balb / c por el punteo (con los dedos) o el afeitado (utilizando máquinas de cortar) la piel. </li><li> Mover los ratones de la zona de preparación de la cirugía (por ejemplo, la jaula de la vivienda) a la zona quirúrgica y aplicar pomada veterinario para laojos para evitar la sequedad. Liberally limpiar el sitio de la incisión preparado con 5% de povidona-yodo antiséptico. </li><li> Inyectar clorhidrato de bupivacaína (0,1 ml de una 2,5 mg / ml de solución, sc) en el área donde se realizará la incisión como analgesia preoperatoria. </li><li> Hacer una sola incisión (~ 1.0 - 1.5 cm) en el flanco izquierdo del animal utilizando un escalpelo o tijeras estériles, con cuidado para no penetrar en el peritoneo. Separar la dermis del peritoneo con tijeras estériles. Dab el sitio de la incisión con una gasa de algodón estéril para eliminar la sangre. </li><li> Mantenga pulsado el ratón con las dos manos, el uso de la mano izquierda para sostener la cabeza y la mano derecha para apoyar el flanco. </li><li> Identificar el bazo a través del peritoneo y, con un dedo de la mano derecha, se palpa el ratón desde la parte inferior; el riñón ahora debe ser visible a través del peritoneo. Mantenga un agarre firme del animal para proporcionar tensión a través del peritoneo y el riñón. </li><li> Que una segunda persona inyectar el ce tumorLLS (preparado en la sección 1.2.) a través del peritoneo intacto al centro del riñón usando una jeringa de 1 ml, equipado con una aguja de calibre 28. Entregar lentamente 0,1 ml (2 x 10 5) de las células. Una vez que se inyectan las células, mantener la aguja en su lugar durante 5 - 10 s para reducir el reflujo de células. Es importante tener en cuenta la necesidad de una extrema precaución durante este paso, ya que la persona va a inyectar las células llevando la aguja en las proximidades de los dedos de la persona que sostiene el ratón. </li><li> Retire la aguja y cerrar la incisión con una fina capa de adhesivo tisular de cianoacrilato. </li><li> Colocar al animal en una jaula limpia con una toalla de papel estéril. Permitir que los animales se recuperen en una almohadilla de calefacción. No dejar los animales solos durante el período de recuperación. No devolver los animales a las condiciones de vivienda estándar hasta que estén en posición vertical y esternal. Siga las directrices institucionales en todos los procedimientos que utilizan animales de laboratorio. </li></ol> 4. BioImaging luminiscente <ol><li> Monitorear el crecimiento del tumor por bioluminiscente de imágenes. NOTA: detalles de procedimiento para la realización de imágenes bioluminiscentes se pueden obtener de Lim et al. 20 La señal de luciferasa se puede detectar tan pronto como 24 h después de la implantación de células tumorales. Como no hay tumor externamente visible en este modelo, es esencial para controlar el crecimiento del tumor periódicamente. Dependiendo del experimento diseñado, el crecimiento del tumor ortotópico puede proceder durante distintos períodos de tiempo. Una ventaja de utilizar las células Renca luciferasa que expresan es que el crecimiento del tumor se puede monitorizar varias veces en el mismo animal a intervalos regulares durante la duración del experimento, y un interrogatorio específico de tumor-cojinete y órganos libres de tumor se puede realizar en una punto final definido. <ol><li> Inyectar luciferina (0,1 ml de una solución 15 mg / ml en PBS estéril) ip y permita que circule durante 10 min antes de colocar el ratón en el sistema de imágenes de bioluminiscencia. Coloque el mo<html> utilizar con su lado dorsal, se revolvió ligeramente en su lado, con el fin de tener el riñón inyectado hacia arriba. </li><li> Medir la carga tumoral en fotones de luz emitidos por segundo (flujo de fotones) dentro de una región definida de interés (ROI) utilizando software de análisis de imagen. </li></ol></li><li> La cuantificación de la carga tumoral en órganos individuales. NOTA: La cuantificación se puede realizar en puntos de tiempo definidos en los órganos individuales después de su retirada de los ratones sacrificados. <ol><li> Inyectar los ratones con luciferina, como en el paso 4.1. </li><li> Después de 10 min, la eutanasia a los ratones usando un procedimiento aprobado. </li><li> Diseccionar los órganos de interés (por ejemplo, los riñones y los pulmones; véase la sección 5 a continuación). Transferir el tejido a 35 x 10 mm placas de Petri y colocarlos en el sistema de imágenes de bioluminiscencia. </li><li> Medir la carga tumoral en fotones de luz emitidos por segundo (flujo de fotones) dentro de un ROI definidos utilizando software de análisis de imagen. </li></ol></li></ol><html> e_title &quot;&gt; 5. Cosecha de Órganos <ol><li> En un punto final definido para el experimento individual, la eutanasia a los ratones portadores de tumores de acuerdo con las directrices institucionales preferidos (por ejemplo, CO 2, dislocación cervical, sobredosis de anestesia). Sin embargo, evitar la dislocación cervical si los pulmones deben ser recogidos después de la inflación tinta china. </li><li> Realizar una evaluación bruto del crecimiento del tumor renal primario en el riñón inyectado midiendo el peso del órgano húmedo. <ol><li> Para determinar la masa del tumor (en g), se aisló 21 y pesar el riñón portadores de tumor y el riñón contralateral del mismo ratón, donde la diferencia en peso de los riñones define la masa tumoral. diseccionar cuidadosamente cualquier tejido conectivo extraña de los riñones extirpados antes de medir sus pesos. </li></ol></li><li> Evaluar el grado de metástasis de tumores a los pulmones mediante el inflado de los pulmones con tinta china antes de la escisión y la fijación de inmediato los pulmones en la solución de Feketelass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Cálculo manual de las lesiones metastásicas en la superficie del pulmón a continuación se puede realizar. <ol><li> Hacer una incisión en la línea media con unas tijeras a partir de la mitad del abdomen, a través de la caja torácica, y a través de las glándulas del cuello / salivales. Retirar con cuidado la caja torácica usando tijeras y pinzas, sin poner en peligro el tejido pulmonar. </li><li> Exponer la tráquea mediante la eliminación del tejido conectivo. </li><li> Preparar una jeringa de 3 ml con una aguja de calibre 18 lleno de solución de tinta India 10% en HBSS. </li><li> El uso de pinzas, el hilo cuidadosamente una sutura de seda bajo la tráquea. Esto se emplea para sellar la tráquea, una vez inflado. </li><li> Con cuidado, inserte la aguja hacia abajo de la tráquea y lentamente deprimir la jeringa para inflar los pulmones con la solución de tinta India. Aproximadamente 1 - 1,5 ml de solución de tinta India se inflarán completamente los pulmones. </li><li> Pellizcar la tráquea cerrar atando varios nudos, con la sutura por debajo de la aguja para inhibir el reflujo de la tinta. </li><li> Remove la aguja y cuidadosamente cortar el tejido conectivo para eliminar los pulmones inflados. </li><li> En una campana de humos química, coloque los pulmones en un tubo cónico de 15 ml que contenía 5 ml de la solución de Fekete (35 ml de 95% EtOH, 15 ml de dH 2 O, 5 ml de formaldehído, y 2,5 ml de ácido acético glacial en una botella de vidrio de 100 ml) 23. </li><li> Permitir a los pulmones para fijar / destain durante 24 - 48 h a temperatura ambiente antes del recuento manual de los nódulos tumorales se destiñó. </li><li> Eliminar los pulmones intactos después de la decoloración y diseccionar cuidadosamente los pulmones fijados por lóbulo en una placa de 35 x 10 mm Petri. Contar el número de nódulos tumorales (nódulos blancos) en cada lóbulo bajo un microscopio de disección. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Se presenta un protocolo para un modelo ortotópico de ratón RCC. La implantación de células tumorales de adenocarcinoma renal de ratón en el riñón de ratón proporciona un modelo clínicamente relevante de CRm. Este modelo resulta en un tumor primario en el riñón y la metástasis distante en los pulmones, las cuales son características de RCC avanzado. La descripción presentada en este documento es específico para la línea celular Renca en ratones inmunocompetentes Balb / c. Utilizando este modelo ortotópico, hemos demostr...

Carcinoma de células renales (RCC) es responsable de la mayoría de los neoplasmas malignos de riñón y aproximadamente el 3% de todos los tumores malignos de adultos en todo el mundo 1, 2. Debido a la falta de los síntomas, diagnóstico erróneo, y herramientas de detección suficientes para RCC, casi el 30% de los pacientes presentará con RCC metastásico (CCRm) en el momento del diagnóstico, con un 20-30% adicional de pacientes que evolucionan hacia una etapa metastásica 2. Estos casos dan lugar a ~ 13.500 muertes al año 1, 3. Aunque la detección y el tratamiento del CCR primaria anterior ha mejorado, la tasa de muerte relacionada con el RCC sigue aumentando, lo que sugiere que la enfermedad metastásica es en gran parte responsable de la mortalidad 3. el desarrollo de la terapia para el CCR ha progresado a lo largo de la última década con el descubrimiento y la aplicación de terapias e inmunoterapias dirigidas. Por desgracia, surviv libre de progresiónal y la supervivencia global de los casos avanzados son todavía muy por debajo de 2 años para la mayoría de los pacientes 4, 5, 6. Estas estadísticas justifican la necesidad de seguir investigando en la identificación y desarrollo de tratamientos eficaces para el CCR. Para avanzar de manera adecuada las intervenciones terapéuticas para el cáncer renal metastásico, primero se necesitan modelos preclínicos en traslación-relevantes de la enfermedad. Desarrollo de un modelo relevante y consistente para recapitular la condición humana de CCR avanzado debe abordar varias preguntas clave: 1) es el modelo anatómico relevante; 2) ¿Tiene el progreso del tumor de manera similar a la patología humana; 3) surgen metástasis del tumor primario; y 4) ¿Puede la progresión del tumor primario y metastásico ser monitoreado en el tiempo? Dependiendo del tipo de tratamiento que está siendo investigado, líneas tumorales RCC ratón de células, líneas celulares tumorales de RCC humanas, y RCC xenog humano derivado del pacientebalsas se pueden usar en ratones inmunocompetentes o inmunodeficientes. Se requiere un huésped con un sistema inmunológico intacto y funcional para aquellos estudios que evalúan algún aspecto de la inmunoterapia, necesitando el uso de la línea de células Renca bien descrito derivada de un adenocarcinoma renal espontáneo de ratones Balb / c 7. La mayoría de estudios inyectan células Renca por vía subcutánea (sc), que forma un tumor local fácil de medida, o por vía intravenosa (iv) en ratones Balb / c para producir experimentales de pulmón &quot;metástasis&quot; 8, 9, 10, 11, 12. El uso de un tumor Renca sc-implantado para modelar RCC humano tiene una serie de limitaciones, incluyendo la inervación inexacta de la vasculatura 13, las diferencias en microambiente 14, 15, y una falta de órgano / tumor comunic celularación 13, 16. Además, muchos tumores SC (especialmente Renca) no metastatizan a los órganos distales, inhibiendo el estudio de un evento que es una común clínico característico 17. Para el estudio de cáncer renal metastásico, células Renca pueden ser inyectados iv para establecer la carga tumoral en los pulmones-la ubicación principal de metástasis en pacientes con CCR. El método de inyección iv de iniciar los tumores metastásicos, sin embargo, no permite la investigación de cómo, cuándo, o por qué las células han emigrado desde el órgano primario (es decir, el riñón) al sitio distante. Un modelo tanto con la enfermedad primaria y metastásica evidente en el mismo animal es crucial para estudiar la progresión y el tratamiento de la enfermedad avanzada, especialmente considerando que las metástasis son típicamente la causa de la mortalidad en estos pacientes. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo murino de cáncer renal metastásico que incorpora todas las características señaladas anteriormente. Establecer pr, tumores ortotópicos imary, células Renca se implantan directamente en el riñón del animal a través del peritoneo translúcido. Una pequeña incisión en el flanco izquierdo permite la visualización del bazo (como un punto de referencia) y el riñón izquierdo. Usando una aguja de calibre pequeño, las células tumorales Renca se inyectan directamente en el riñón a través del peritoneo para la implantación ortotópica. En comparación con otros métodos de implantación de células Renca por debajo de la cápsula renal 18, este método de implantación permite un rendimiento más alto, ya que es bastante no invasivo, no requiere sutura, es de una clase baja dolor, y es eficiente en el tiempo cuando experto. Este bien caracterizados los resultados del modelo en la carga reproducible primaria tumor (~ 99% de tasa de take) en el riñón inyectado, así como la carga tumoral metastásico en los pulmones. Las ventajas significativas de este modelo incluyen su naturaleza singénicos, lo que permite investigaciones de inmunoterapia; sus metástasis espontáneas, para estudiar unaenfermedad dvanced; y su implantación ortotópica, para modelar el impacto anatómica sobre la progresión de la enfermedad y el tratamiento. Las terapias dirigidas a la orientación RCC se beneficiarían enormemente de la utilización de este modelo durante el desarrollo preclínico.

<table><tbody><tr><td>Lágrimas artificiales ungüento oftálmico</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Adhesivo tisular</td><td>3M</td><td>CBGBIW011019</td><td></td></tr><tr><td>Solución de betadine (povidona yodada, 5%)</td><td>Purdue Products, L.P.</td><td>NDC 67618-155-32</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Marcaine (inyección de bupivavaína HCl)</td><td>Hospira</td><td>0409-1587-50&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td> Jeringas de <td>rayo</td><td></td><td></td>de sol</tr><tr><td></td><td>BD 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Venture 908291</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>NDC 57319-609-02</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina&nbsp;</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-111</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Sales equilibradas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td></td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin, Sal de Potasio GoldBio</td><td></td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Chartpak Inc</td><td>44201</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de la Bella Durmiente (SB) sistema de transposones</td><td>Neuromics</td><td></td><td></td>SBT0200</tr><tr><td>Renca</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr></tbody></table>

un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre terapias

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

El carcinoma de células renales (CCR) afecta&gt; 60.000 personas en los Estados Unidos cada año, y ~ 30% de los pacientes con CCR tienen múltiples metástasis en el momento del diagnóstico. CCR metastásico (CCRm) es incurable, con una mediana de supervivencia de sólo 18 meses. Intervenciones basadas inmune (por ejemplo, interferón (IFN) y la interleuquina (IL) -2) inducir respuestas duraderas en una fracción de los pacientes CCRM, y los inhibidores de multicinasas (por ejemplo, sunitinib o sorafenib) o anti-VEGF de los receptores de anticuerpos monoclonales (mAb) son en gran medida paliativa, como remisiones completas son raras. Tales deficiencias en las terapias actuales para pacientes mRCC proporcionan el fundamento para el desarrollo de protocolos de tratamiento novedosas. Un componente clave en el ensayo preclínico de nuevas terapias para CRm es un modelo animal adecuado. características beneficiosas que recapitular la condición humana incluyen un tumor primario renal, metástasis de tumores renales, y un sistema inmunológico intacto para investigar cualquier effecto inmune terapia impulsadarespuestas r y la formación de factores inmunosupresores inducida por tumores. Este informe describe un modelo ortotópico de ratón CCRm que tiene todas estas características. Se describe una técnica de implantación intrarrenal usando la línea celular de adenocarcinoma de ratón renal Renca, seguido por la evaluación del crecimiento del tumor en el riñón (sitio primario) y los pulmones (sitio metastásico).

<html> La implantación exitosa de células Renca resultará en el desarrollo de tumores en el riñón y la metástasis a los pulmones de los ratones. Después de la escisión del tumor-cojinete y los riñones contralaterales, se midieron los pesos de los tejidos húmedos (G) para demostrar la carga tumoral basado en el aumento de peso (Figura 1). Tumores Renca se pueden identificar mediante técnicas de inmunohistoquímica a través de citoqueratina 8 y 18 tinción (Figura 2)....

La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer tumores renales ortotópicos en ratones mediante la implantación intrarrenal de células tumorales para el estudio del crecimiento tumoral y de la metástasis, así como de la eficacia de terapias antitumorales. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la oncología urológica, como por ejemplo qué tan eficaz es una terapia novedosa en un modelo preclínico de cáncer de riñón. La principal ventaja de esta técnica es que la implantación tumoral intrarrenal establece un tumor renal primario con capacidad de metástasis pulmonar que imita la patogénesis del carcinoma de células renales clínico.Para preparar las células tumorales Renca, primero desprenda el cultivo celular con tripsina al 0,25 % y HBSS tras lavar con PBS. Neutralice la reacción después de cinco minutos con medio RPMI completo. Transfiera las células a un tubo cónico para centrifugación y re-suspenda el precipitado en HBSS fresco.Después de contar, ajuste el volumen a una concentración de dos veces diez a la seis células por mililitro en HBSS, y aspire las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 18. A continuación, coloque un campo quirúrgico estéril sobre una almohadilla calefactora y confirme el nivel adecuado de sedación mediante la compresión del dedo del pie. Retire el vello del flanco izquierdo del ratón y aplique pomada oftálmica para animales en los ojos.Luego, limpie el sitio de implantación con antiséptico de yodo povidona al 5% y use un escalpelo estéril para hacer una incisión única de uno a un centímetro y medio en el flanco izquierdo, teniendo cuidado de no penetrar el peritoneo. Con tijeras, separe la dermis del peritoneo, presionando suavemente el sitio de la incisión con gasa estéril de algodón para eliminar cualquier sangre. A continuación, sostenga la cabeza con la mano izquierda y apoye el flanco con la mano derecha para localizar el bazo a través del peritoneo.Con un dedo de la mano derecha, palpe al ratón desde abajo. El riñón debería hacerse visible. Manteniendo firmemente al animal para proporcionar tensión sobre el peritoneo y el riñón, pida a un asistente que administre lentamente 0,1 mililitros de las células Renca a través del peritoneo intacto hacia el centro del riñón.Mantenga la aguja en su lugar durante cinco a 10 segundos para reducir el reflujo de las células. Luego, cierre la incisión con una capa fina de adhesivo tisular de cianoacrilato. En el punto final del experimento, use tijeras para realizar una incisión media, comenzando en la región media del abdomen, pasando por la caja torácica, el cuello y las glándulas salivales.Utilizando tijeras y pinzas, retire cuidadosamente las costillas sin dañar el tejido pulmonar y elimine el tejido conectivo para exponer la tráquea. Llene una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 18 con tinta de la India al 10 % y PBS. Luego, use pinzas para pasar cuidadosamente un hilo de seda por debajo de la tráquea y haga un nudo suelto.A continuación, inserte cuidadosamente la aguja en la tráquea e infle lentamente los pulmones con uno a un mililitro y medio de la solución de tinta de India. Apriete el nudo alrededor de la tráquea para evitar el reflujo de la tinta, luego retire la aguja y corte con cuidado el tejido conectivo para extraer los pulmones inflados. Fije los pulmones en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de solución de Fekete en una campana extractora de gases a temperatura ambiente.Después de 24 a 48 horas, retire los pulmones intactos descoloridos y separe cuidadosamente los lóbulos en una placa de Petri de 35 por 10 milímetros. Luego, cuente el número de nódulos tumorales blancos bajo un microscopio estereoscópico. Un implante exitoso de células Renca intrarrenales en ratones da como resultado el desarrollo de tumores en el riñón y metástasis a los pulmones, con animales portadores de tumores que presentan una carga tumoral considerable, medida por el aumento del peso de los riñones con implante tumoral.Como se observó, los tumores Renca pueden identificarse mediante tinción inmunohistoquímica para citokeratina ocho y 18. La implantación de una línea celular Renca que expresa luciferasa permite el seguimiento de la carga tumoral en el riñón y la metástasis pulmonar mediante imágenes bioluminiscentes, lo cual se confirma además mediante la inflación pulmonar con tinta de índigo. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de cinco minutos por ratón si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar identificar claramente el riñón a través del peritoneo para asegurar una implantación tumoral intrarrenal precisa. Tras este procedimiento, se pueden llevar a cabo otros métodos, como pruebas preclínicas de fármacos, para responder preguntas adicionales, tales como ¿en qué medida afecta un fármaco novedoso al crecimiento o a la metástasis de tumores intrarrenales? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la implantación de células tumorales intrarrenales para establecer tumores renales ortotópicos en el ratón.No olvide que trabajar con animales vivos e instrumentos quirúrgicos puede ser peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como seguir las guías institucionales para el manejo de animales y mantener un área quirúrgica y instrumentos estériles mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

JoVE Journal

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Investigación del cáncer

En este video, desarrollamos un modelo ortotópico de ratón de carcinoma de células renales. Este modelo da como resultado tumores primarios reproducibles en el riñón inyectado y tumores metastásicos en el pulmón, lo que permite evaluar la progresión de la enfermedad y el tratamiento.

Generación de un modelo de carcinoma de células renales: un protocolo para desarrollar un modelo murino de CCR ortotópico mediante la implantación intrarrenal de células cancerosas

Este modelo ortotópico de cáncer de próstata humano permite la cuantificación del tamaño del tumor, las células tumorales circulantes, y formación de distinta metástasis al pulmón. Como las células deben escapar del órgano principal, entrar en el torrente sanguíneo, y se implanta en un sitio secundario, este modelo recapitula efectivamente el escenario en los seres humanos.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Modelos de progresión de la enfermedad espontánea carcinoma metastásico de células renales (CCR) pueden ser utilizados para la evaluación de los tratamientos en un entorno clínicamente relevante. Este protocolo demuestra diferentes procedimientos para la implantación de células tumorales de riñón ortotópico, nefrectomía adecuado, y finalmente describe una guía para la necropsia de puntuación visual y bioluminiscente de carga metastásica y la localización.

Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

Un modelo preclínico, murino de metástasis hepáticas realiza a través de una técnica de inyección hemispleen.

A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

La diseminación metastásica del cáncer es la principal causa de muerte por cáncer. Proporcionamos una descripción en profundidad de nuestra metodología de la cirugía de supervivencia para el establecimiento de un sistema de modelo de ratón singénico "-paciente como" ortotópico para el estudio de los mecanismos de la metástasis en tumores de órganos sólidos.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga ortotópico murino en ratones C57BL / 6J hembra y el seguimiento del crecimiento del tumor.

Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección

El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.

Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Un desafío importante del desarrollo de nuevas terapias para el cáncer de pulmón incluye el modelado del microambiente tumoral a medida que la enfermedad regional progresa a la enfermedad metastásica. Aquí, describimos un método simple para establecer un modelo singénico ortotópico de cáncer de pulmón que permite el seguimiento in vivo de la enfermedad a lo largo del tiempo.

Un método mínimamente invasivo para generar un modelo de ratón ortotópico singénico de cáncer de pulmón

Aprende a establecer tumores renales ortotópicos en ratones mediante implantación intrarrenal de células Renca para estudiar crecimiento tumoral y metástasis pulmonar. Este modelo preclínico permite evaluar terapias antitumorales en oncología urológica.

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Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

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