Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares
17 de enero de 2017
Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.
El objetivo general de este método para hacer hidrogeles personalizados es estudiar las células y las condiciones de cultivo que replican la complejidad de la matriz extracelular pulmonar. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo pulmenario, como por ejemplo, cómo interactúan las células pulmonares con la MEC en condiciones sanas y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que los hidrogeles de ECM pulmonar se pueden adaptar a su aplicación en cultivo 2D o 3D.
Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la complejidad de las técnicas de descelularización, que a veces requieren varias personas y atención al detalle para optimizar la cantidad de tejido viable. Para este protocolo, tenga un pulmón porcino listo para la descelularización. Los detalles sobre su preparación se pueden encontrar en el protocolo de texto.
Una vez que el pulmón esté preparado, use una bomba manual que esté canulada para adaptarse a la arteria pulmonar. Primero, perfunde alrededor de un litro de agua en la vasculatura y luego 1,5 litros en la tráquea. Haga esto tres veces, aumentando el volumen de agua perfundida a medida que se eliminan los desechos celulares.
A continuación, perfunde el tejido con Triton X-100, también con la bomba manual. Luego, sumerja el tejido en un baño de solución Triton X-100 a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, enjuague la vasculatura y la tráquea tres veces con agua destilada.
Después de los enjuagues, use la bomba manual para perfundir el tejido con desoxicolato. Y luego sumergir el tejido en desoxicolato durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, enjuague el pañuelo tres veces con agua destilada, como antes.
Después de los enjuagues, use la bomba manual para perfundir el tejido con cloruro de sodio filtrado. A continuación, sumerja el tejido en cloruro de sodio filtrado durante una hora a cuatro grados centígrados. Después del baño, perfundir la vasculatura y la tráquea tres veces con agua destilada para enjuagar.
Después de los enjuagues, perfunda el tejido con una solución de DNasa y luego sumérjalo en una solución de DNasa durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de una hora, perfunda la vasculatura y la tráquea cinco veces usando PBS, no agua. Ahora, solo usando tejido blanco opaco, disecciona todos los túbulos que tengan dos milímetros de diámetro o más.
Se encuentran principalmente alrededor del hilio y las porciones mediales de los pulmones. Deje intactas las zonas respiratorias, que en su mayoría se encuentran en la periferia. Después de extirpar los túbulos, diseccione el tejido en secciones de una pulgada o más pequeñas.
La orientación de estos bloques no es importante. Después de drenar los bloques de tejido, transfiéralos a un tubo cónico de 50 mililitros y congélelos a 80 grados centígrados. Se pueden reservar algunos bloques para que la histología confirme la eliminación de las células y los desechos.
Para procesar el tejido pulmonar en polvo descelularizado, vuelva a colocar la cubierta del tubo de tejido congelado con un papel de filtro y asegúrelo con una banda elástica. Luego, liofilice el tejido hasta que todo el exceso de líquido desaparezca usando un liofilizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, almacene el pañuelo a 80 grados centígrados hasta que se pueda moler.
Para preparar el molino, primero cárguelo con nitrógeno líquido, dejando espacio para el tubo del molino. A continuación, del tubo del molino, retire la barra magnética del molino y cubra la parte inferior del tubo con pañuelos de papel. Luego, vuelva a colocar la barra del molino y empaque sin apretar más pañuelo para llenar el tubo.
Luego, cierre el tubo del molino, colóquelo en el congelador/molino y llene el molino con nitrógeno líquido hasta su capacidad máxima. Ahora, haga funcionar el molino durante aproximadamente cinco minutos con una tasa de impactación de aproximadamente 600 por minuto. Luego, almacene el polvo descelularizado a 80 grados centígrados, hasta que lo necesite.
Para hacer el material de pre-gel, agregue polvo de tejido descelularizado y pepsina a un tubo cónico. A continuación, añada ácido clorhídrico 0,01 molar al tubo, para obtener una concentración final de 1% de polvo de tejido descelularizado y 0,01% de pepsina. Mantenga esta solución bajo agitación constante a temperatura ambiente durante 48 horas para digerir los tejidos.
Después de 48 horas, ponga la solución en hielo durante cinco minutos. Ahora ajuste el pH de la solución a 7.4 usando hidróxido de sodio frío de 0.1 molar, y luego lleve la concentración de PBS de la solución a 1X agregando 10X PBS. Tenemos cierta experiencia con la alteración de los tiempos y el pH del pre-gel.
Hay cierta flexibilidad en el rango que se puede usar, pero las propiedades pueden cambiar drásticamente si el procedimiento se altera de manera menor. La solución no se considera pregel y se puede usar para recubrir placas no tratadas para formar hidrogeles para formar células, para formar hidrogeles para formar células, o se puede modificar aún más antes de formar hidrogeles para aumentar la rigidez de los hidrogeles. Para cultivar células en un recubrimiento de gel microporoso bidimensional, agregue 20 microlitros de solución de pregel a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos no tratada de 96 pocillos.
Luego, refrigere el plato durante la noche a cuatro grados centígrados para que las proteínas se absorban en el plato. Al día siguiente, aspire la solución de pregel y enjuague los pocillos con PBS. A continuación, añada 3.200 células a cada pocillo y rellene el volumen de medios de cada pocillo a 100 microlitros.
A continuación, se pueden incubar las placas. Para un cultivo celular tridimensional con células dentro del gel microporoso, vuelva a suspender las células de interés a un millón por mililitro en una solución de pregel. A continuación, dispense rápidamente 16 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para formar un cultivo celular en 3D de unas 500 micras de grosor.
El gel se formará en 30 minutos una vez incubado a 37 grados centígrados. Después de que se formen los geles, agregue medios a los pocillos hasta las marcas de 100 microlitros. Para un cultivo celular tridimensional con células en la parte superior del gel microporoso, agregue los 100 microlitros de la solución de pregel a los pocillos de una placa de 96 pocillos sin tratar.
Luego, incube la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos para la gelificación. Una vez formados los geles, se añaden 3.200 células en medios de 100 microlitros encima de los hidrogeles y se procede a incubar la placa. Los hidrogeles se produjeron a partir de pulmones normales de cerdo, rata y ratón utilizando el método descrito.
Las pruebas reológicas confirmaron que más del 90% de la gelificación se produce en los primeros minutos después de alcanzar los 37 grados centígrados. Los hidrogeles formados fueron estables durante largos períodos en PBS, pero la unión celular y la proliferación pueden cambiar con el tiempo. La solución de pre-gel se probó como codificación para mejorar la adhesión celular.
La unión y proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana se midió mediante un MTTSA. Se observaron mejoras al recubrir los pozos con ECM. En la fabricación de geles 3D, la adición de Genipin aumentó la reticulación del hidrogel.
Utilizando barridos de frecuencia en un reómetro, la rigidez del hidrogel se correlacionó directamente con la concentración de genipina, siendo la mediana y la concentración más relevante del 0,01%Al probar los geles más rígidos, se midió que la proliferación celular era mayor mediante un MTTSA en los geles con mayor reticulación. Una vez dominada, la descelularización se puede realizar en ocho horas durante cuatro días. La solución de pregel se puede hacer en una hora durante dos días, y la formación de gel se puede lograr en dos horas durante dos días.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como AFM, western blots, tinción e inmunohistoquímica para responder a preguntas adicionales, como el módulo elástico, la composición de la proteína y la respuesta celular al material.
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Descripción general
Este método describe la creación de un andamio para cultivo celular tridimensional utilizando matriz extracelular pulmonar. El proceso implica la descelularización de tejido pulmonar intacto para producir hidrogeles que facilitan el crecimiento celular en tres dimensiones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Cultivo celular
- Investigación de la matriz extracelular
- Biología pulmonar
Antecedentes
- Este método pretende replicar la complejidad de la matriz extracelular pulmonar.
- Aborda cómo las células pulmonares interactúan con la MEC en diversas condiciones.
- La técnica permite la personalización de hidrogeles para aplicaciones específicas.
- La descelularización requiere una atención cuidadosa al detalle y puede necesitar varias personas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar hidrogeles que imiten la MEC pulmonar con fines de investigación.
- Investigar el comportamiento celular en condiciones pulmonares sanas y patológicas.
- Proporcionar un método confiable para estudiar las interacciones de las células pulmonares.
Métodos Utilizados
- Descelularización de tejido pulmonar porcino.
- Preparación de hidrogeles a partir de la matriz extracelular.
- Cultivo celular en entornos 2D y 3D.
- Optimización de la viabilidad del tejido durante el proceso.
Resultados principales
- Creación exitosa de hidrogeles de matriz extracelular pulmonar personalizables.
- Mejor comprensión de las interacciones de las células pulmonares con la matriz extracelular.
- Se demostró el potencial de aplicación en diversos contextos de investigación.
- Se identificaron desafíos en el proceso de descelularización.
Conclusiones
- El método proporciona una herramienta valiosa para la investigación pulmonar.
- Los hidrogeles pueden adaptarse a necesidades experimentales específicas.
- Estudios futuros pueden explorar las implicaciones de la MEC en la salud pulmonar.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la creación de hidrogeles de matriz extracelular pulmonar ajustables que replican la complejidad del tejido pulmonar para estudios in vitro. Apoya la desactivación mecanicista de riesgos en la validación de objetivos al proporcionar un sistema relevante para la enfermedad para estudiar las interacciones célula-MEC en condiciones sanas y patológicas. La rigidez ajustable y el formato personalizable aumentan la confianza predictiva en la selección de modelos preclínicos y en los flujos de trabajo de desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la modelización de las interacciones de las células pulmonares con la MEC nativa.
- Valor operativo: Proporciona un sistema biológico reproducible para la aclaración de vías y la validación funcional de dianas.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante cultivos tridimensionales relevantes para la enfermedad que mejoran la concordancia de biomarcadores traslacionales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera hidrogeles estandarizados con resultados cuantificables para el cribado fiable de compuestos.
- Valor operativo: Permite la estandarización y escalabilidad del ensayo mediante una temperatura y rigidez de gelificación ajustables.
- Potencial de reutilización: Forma recubrimientos o andamios tridimensionales compatibles con placas de alto rendimiento y análisis posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando matriz extracelular pulmonar fisiológicamente relevante.
- Reducción de riesgos: Aumenta la confianza predictiva mediante la correlación de la rigidez del hidrogel (mediante entrecruzamiento con genipina) con los resultados de proliferación celular.
- Ayuda para la toma de decisiones: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante cambios medibles en la adhesión y migración celular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la biología inicial hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar una plataforma de cultivo 3D ajustable que modela el microentorno específico del pulmón.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir el cultivo celular en matriz extracelular derivada de pulmón bajo condiciones controladas.
- Selección: Proporciona hidrogeles listos para ensayos con gelificación reproducible y espesor cuantificable para una evaluación consistente de compuestos.
- Análisis: Genera resultados medibles como la cinética de formación del gel, rigidez y proliferación celular para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos mediante la modelización de sistemas relevantes a enfermedades y lecturas compatibles con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de hidrogeles reutilizable adaptable a modelos de roedores y porcinos para la estandarización entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en los estudios de células pulmonares y matriz extracelular (ECM).
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante pasos definidos de descelularización, digestión y gelificación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de los efectos de compuestos en una matriz fisiológicamente relevante.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo mediante hidrogeles ajustables que modelan la rigidez de la ECM modificada por la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la descelularización de tejidos y la preparación de hidrogeles para garantizar la viabilidad y la consistencia.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo liofilizador, criomolinillo y reómetro, para el control del proceso y la caracterización.
- Necesita la estandarización entre equipos de la formulación de hidrogeles y los protocolos de almacenamiento para obtener resultados reproducibles.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método en pulmones de diferentes especies o modelos de enfermedad.
- Presenta limitaciones prácticas, como el tiempo de procesamiento de varios días y la sensibilidad frente a alteraciones del procedimiento que afectan la resistencia del gel.
