La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones.

El objetivo general de este experimento es activar fisiológicamente la autofagia en ratones mediante una carrera forzada o voluntaria, y luego medir los niveles de autofagia en tejidos específicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la autofagia, en particular, cómo la autofagia y la acción contribuyen a los efectos beneficiosos mediados por el ejercicio aeróbico. La principal ventaja de esta técnica es que el ejercicio físico es un balanceo aeróbico rápido entre la autofagia in vivo utilizando ratones.

Para este experimento, comience con ratones C57 black six de ocho a doce semanas de edad, que albergan un gen trans para detectar la autofagia inducida por el ejercicio in vivo, conocida como GFP-LC3. Para obtener más información sobre el uso de cintas de correr en ratones, consulte la siguiente publicación de JoVE. Ajuste el estímulo eléctrico de la cinta de correr a baja intensidad.

En sus dos primeras sesiones, aclimate a los ratones a una cinta de correr abierta cuesta arriba de diez grados. El primer día, ejercita a los ratones durante cinco minutos con la cinta de correr funcionando a ocho metros por minuto. El segundo día, haga correr a los ratones durante diez minutos, inicialmente a ocho metros por minuto, y después de cinco minutos, aumente la velocidad a diez metros por minuto.

Al tercer día, haga funcionar a los ratones durante 90 minutos completos. Ponga en marcha la cinta de correr a diez metros por minuto y anime a los ratones a correr con suaves empujones para evitar repetidos golpes en los pies. Es fundamental observar y manipular a los ratones para que no reciban demasiadas descargas eléctricas durante la carrera de 90 minutos.

A lo largo de la carrera, usa tus dedos para animar a los ratones a permanecer en la cinta de correr. Después de 40 minutos, 6aumente la velocidad en un metro por minuto. Después de 50 minutos, vuelva a aumentar la velocidad en un metro por minuto.

Después de 60 minutos, aumente la velocidad en otro metro por minuto. Después de 70 minutos, comience a aumentar la velocidad cada cinco minutos para que los últimos cinco minutos de la carrera de 90 minutos sean de 17 metros por minuto. Una vez finalizado el ensayo, eutanasia inmediata a los ratones para la recolección de tejido si lo desea.

Para esta prueba, aloje a los ratones individualmente. Utilice la misma cepa que se describió anteriormente. Prepare una rueda para correr de mouse de 11,4 centímetros de diámetro con un odómetro de bicicleta adjunto.

Cada rotación debe medir 358 milímetros de recorrido. Mueva el ratón a la jaula que contiene la rueda y deje que el ratón lo use libremente durante dos semanas. Cada 24 horas, registre la distancia recorrida por el ratón desde el odómetro.

Después de las dos semanas, recoja los tejidos para analizarlos según sea necesario. Para medir el flujo autfágico, trate a los ratones con el inhibidor de la autofagia, la cloroquina, durante tres días. Disuelva la cloroquina en PBS a cinco miligramos por mililitro e inyecte en ratones por vía intraperitoneal a una dosis de 50 microgramos por gramo.

Administre a los ratones una inyección diaria durante tres días consecutivos y extraiga pañuelos tres horas después de la última inyección. Para los ratones ejercitados en la cinta de correr, comience la carrera de 90 minutos 90 minutos después de la inyección al tercer día para que la carrera termine tres horas después de la inyección. A continuación, sacrificar a los ratones e inmediatamente cosechar sus tejidos.

Prepárese para profusar a un animal dentro de los 90 minutos posteriores a su ejercicio preparando el fijador. Cargue una jeringa de 30 mililitros con 15 a 20 mililitros de paraformaldehído al cuatro por ciento recién hecho y conecte la jeringa con una aguja de catéter de calibre 20. Conecte la bomba de jeringa cargada y ajústela a 90 mililitros por hora de flujo continuo.

Con el animal sobre una superficie de trabajo limpia, en posición supina, corte la cavidad torácica a través del diafragma para exponer el corazón. Ahora, inserte la aguja del catéter en el ventrículo derecho. A continuación, haga una pequeña incisión en el hígado para drenar la sangre y poner en marcha la bomba.

Inyecte el fijador hasta que el pulmón y el hígado se pongan completamente pálidos. Por lo general, 15 mililitros de fijador serán suficientes. Después de la profusión, retire la aguja y recoja los tejidos de interés.

Para recolectar el músculo esquelético, disecciona el vasto lateral. Tire brevemente de la piel de la pierna hacia atrás para exponer los músculos y localizar el cuádriceps femoral. Luego, disecciona el vasto lateral, que es el músculo externo unido a la parte superior del hueso femoral.

Para una mayor fijación y deshidratación, coloque los tejidos recolectados en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, transfiera los pañuelos a un 15 por ciento de sacarosa PBS y déjelos en remojo a cuatro grados centígrados durante la noche o hasta que se hayan asentado en la solución. Luego, transfiera los tejidos a 30 por ciento de sacarosa PBS a cuatro grados centígrados durante toda la noche o más.

Mantenga los pañuelos en la oscuridad tanto como sea posible durante estos baños. A continuación, coloque los pañuelos en un medio de inclusión como OCT y córtelos en trozos más pequeños si es necesario. Luego, deje que se aclimaten durante unos minutos en una pequeña placa de Petri.

Después, transfiéralos a criomoldes con suficiente OCT para cubrir. En los moldes, oriente las superficies de corte hacia el fondo y evite formar burbujas. Luego, congele las muestras en un enfriador de espuma cubierto lleno de hielo seco hasta que la OCT se vuelva blanca.

Ahora, envuelva las muestras individuales en láminas etiquetadas, séllelas en una bolsa de plástico y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta que puedan ser procesadas. Utilizando LC3 marcado con GFP como sistema reportero, se observó la inducción de la autofagia en ratones ejercitados como se describe. Después de la estimulación de la autofagia, LC3 se translocó del citosol al autofagosoma en estructuras puntuadas.

Los ratones ejercitados tenían muchos más puntos GFP-LC3 tanto en el músculo esquelético como en la corteza cerebral en comparación con los ratones en estado de reposo. El análisis de Western blot utilizando un anticuerpo LC3 mostró que el ejercicio indujo significativamente la generación de LC3-II conjugativo de lípidos, lo que sugiere que hubo una mayor conversión de LC3-I citosólica en LC3-II. A continuación, se midió la degradación del receptor de carga autófico, p62.

90 minutos de actividad en la cinta rodante causaron una mayor degradación de P62 en el músculo esquelético que la condición de reposo. Este efecto fue rescatado por una inyección con cloroquina antes del ejercicio. Dado que la cloroquina es un inhibidor de la degradación lisosomal, estos datos indican que el fenómeno observado se debe a un flujo autofagogénico elevado y no a un bloqueo en la degradación de los autofagosomas.

Tras su desarrollo, esta técnica tuvo precursores en el campo de la autofagia para explorar los efectos sobre el mecanismo del ejercicio en la degradación del metabolismo y los comportamientos animales. Al intentar este procedimiento, es importante monitorear a los ratones mientras corren. Siguiendo este procedimiento, se encuentran los métodos como la microscopía eléctrica.

La microscopía animal se puede realizar para responder preguntas adicionales como el ejercicio en vías de autofagia seleccionadas, como la mitofagia y la lipofagia.