La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones
3 de febrero de 2017
activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones.
El objetivo general de este experimento es activar fisiológicamente la autofagia en ratones mediante ejercicio forzado o voluntario, y luego medir los niveles de autofagia en tejidos específicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la autofagia, en particular, cómo la autofagia y su actividad contribuyen a los efectos beneficiosos mediados por el ejercicio aeróbico. La principal ventaja de esta técnica es que el ejercicio físico constituye una manera rápida de inducir fluctuaciones aeróbicas en la autofagia in vivo utilizando ratones.
Para este experimento, comience con ratones C57 black six de ocho a doce semanas de edad, que portan un transgén para detectar la autofagia inducida por ejercicio in vivo, conocido como GFP-LC3. Para obtener detalles sobre el uso de cintas rodantes para ratones, consulte la siguiente publicación de JoVE. Establezca el estímulo eléctrico de la cinta rodante en baja intensidad.
En sus dos primeras sesiones, acostumbre a los ratones a una cinta sin barreras inclinada diez grados hacia arriba. En el primer día, ejercite a los ratones durante cinco minutos con la cinta funcionando a ocho metros por minuto. En el segundo día, haga correr a los ratones durante diez minutos, inicialmente a ocho metros por minuto, y después de cinco minutos, aumente la velocidad hasta diez metros por minuto.
El tercer día, haga correr a los ratones durante 90 minutos completos. Comience la cinta rodante a diez metros por minuto y anime a los ratones a correr mediante toques suaves para evitar descargas eléctricas repetidas. Es fundamental observar y manipular a los ratones para que no reciban demasiadas descargas eléctricas durante la carrera de 90 minutos.
Durante todo el recorrido, use los dedos para animar a los ratones a permanecer en la cinta rodante. Después de 40 minutos, aumente la velocidad en un metro por minuto. Después de 50 minutos, aumente la velocidad en un metro por minuto nuevamente.
Después de 60 minutos, aumente la velocidad en un metro por minuto más. Después de 70 minutos, comience a aumentar la velocidad cada cinco minutos, de modo que los últimos cinco minutos de la carrera de 90 minutos sean a 17 metros por minuto. Al finalizar la prueba, sacrifique inmediatamente a los ratones para la recolección de tejidos, si se desea.
Para esta prueba, aloje a los ratones individualmente. Utilice la misma cepa descrita previamente. Prepare una rueda para correr de 11,4 centímetros de diámetro para ratones con un odómetro de bicicleta acoplado.
Cada rotación debe medir 358 milímetros de recorrido. Introduzca el ratón en la jaula que contiene la rueda y permita que el ratón la use libremente durante dos semanas. Cada 24 horas, registre la distancia recorrida por el ratón a partir del odómetro.
Después de las dos semanas, recolecte los tejidos para su análisis según sea necesario. Para medir el flujo autofágico, trate a los ratones con el inhibidor de la autofagia, cloroquina, durante tres días. Disuelva la cloroquina en PBS a cinco miligramos por mililitro e inyéctela a los ratones por vía intraperitoneal a una dosis de 50 microgramos por gramo.
Administre a los ratones una inyección diaria durante tres días consecutivos y recolecte los tejidos tres horas después de la última inyección. Para los ratones que realizan ejercicio en cinta rodante, inicie la carrera de 90 minutos 90 minutos después de la inyección del tercer día, de modo que la carrera finalice tres horas después de la inyección. Luego, sacrifique a los ratones e inmediatamente recolecte sus tejidos.
Prepárese para perfundir un animal dentro de los 90 minutos posteriores al ejercicio preparando el fijador. Cargue una jeringa de 30 mililitros con 15 a 20 mililitros de paraformaldehído al cuatro por ciento recién preparado y conecte la jeringa a una aguja catéter de calibre 20. Fije la jeringa cargada a una bomba de infusión y ajústela a un flujo continuo de 90 mililitros por hora.
Con el animal sobre una superficie de trabajo limpia y en posición supina, abrir la cavidad torácica a través del diafragma para exponer el corazón. A continuación, insertar la aguja del catéter en el ventrículo derecho. Luego, realizar una pequeña incisión en el hígado para drenar la sangre e iniciar la bomba.
Injecte el fijador hasta que el pulmón y el hígado se vuelvan completamente pálidos. Por lo general, serán suficientes 15 mililitros de fijador. Después de la perfusión, retire la aguja y recoja los tejidos de interés.
Para recolectar músculo esquelético, diseque el vasto lateral. Tire brevemente de la piel de la pata hacia atrás para exponer los músculos y localizar el músculo cuádriceps femoral. Luego, diseque el vasto lateral, que es el músculo externo unido a la porción superior del hueso femoral.
Para una fijación y deshidratación adicionales, coloque los tejidos recolectados en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 24 horas a cuatro grados celsius. Al día siguiente, transfiera los tejidos a PBS con sacarosa al 15 por ciento y déjelos en remojo a cuatro grados celsius durante la noche o hasta que se hayan asentado en la solución. Luego, transfiera los tejidos a PBS con sacarosa al 30 por ciento a cuatro grados celsius durante la noche o más tiempo.
Mantenga los tejidos en la oscuridad tanto como sea posible durante estos baños. A continuación, coloque los tejidos en un medio de inclusión como OCT y córtelos en trozos más pequeños si es necesario. Luego, déjelos aclimatarse durante unos minutos en una placa de Petri pequeña.
Posteriormente, transfiéralos a moldes criogénicos con suficiente OCT para cubrirlos. En los moldes, oriente las superficies de corte hacia la parte inferior y evite formar burbujas. Luego, congele las muestras en un recipiente aislado lleno de hielo seco hasta que el OCT se vuelva blanco.
Ahora, envuelva muestras individuales en láminas etiquetadas, séllelas en una bolsa de plástico y almacénelas a menos 80 grados celsius hasta que puedan procesarse. Utilizando LC3 marcado con GFP como sistema de reportero, se observó la inducción de autofagia en ratones ejercitados según lo descrito. Tras la estimulación de la autofagia, LC3 translocó desde el citosol hacia el autofagosome en estructuras punteadas.
Los ratones ejercitados presentaron muchas más púntas GFP-LC3 tanto en el músculo esquelético como en la corteza cerebral en comparación con los ratones en condición de reposo. Un análisis por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo contra LC3 mostró que el ejercicio indujo significativamente la generación de LC3-II conjugada con lípidos, lo que sugiere un aumento en la conversión de LC3-I citosólica en LC3-II. A continuación, se midió la degradación del receptor de carga autofágica p62.
Noventa minutos de actividad en cinta de correr provocaron una degradación mayor de p62 en el músculo esquelético en comparación con la condición de reposo. Este efecto se revirtió mediante una inyección con cloroquina previa al ejercicio. Dado que la cloroquina es un inhibidor de la degradación lisosómica, estos datos indican que el fenómeno observado se debe a un flujo autofágico elevado y no a un bloqueo en la degradación del autofagosoma.
Después de su desarrollo, esta técnica tuvo precursores en el campo de la autofagia para explorar los efectos del ejercicio sobre el mecanismo de degradación del metabolismo y los comportamientos animales. Al intentar este procedimiento, es importante monitorear a los ratones mientras corren. Después de este procedimiento, se encuentran métodos como la microscopía electrónica.
Se puede realizar microscopía en animales para responder preguntas adicionales, como el ejercicio en vías selectivas de autofagia, tales como mitofagia y lipofagia.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio investiga la activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones. Al medir los niveles de autofagia en tejidos específicos, la investigación tiene como objetivo esclarecer los beneficios fisiológicos del ejercicio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Fisiología
- Biología Celular
Antecedentes
- La autofagia es un proceso celular que contribuye a la degradación y al reciclaje de componentes celulares.
- Se sabe que el ejercicio físico induce la autofagia in vivo.
- Comprender la relación entre el ejercicio y la autofagia puede proporcionar información sobre la prevención de enfermedades.
- Este estudio utiliza ratones C57 black six con un transgén para detectar la autofagia inducida por el ejercicio.
Objetivo del estudio
- Activar la autofagia en ratones mediante ejercicio forzado o voluntario.
- Medir los niveles de autofagia en tejidos específicos tras el ejercicio.
- Explorar cómo contribuye la autofagia a los beneficios del ejercicio aeróbico.
Métodos Utilizados
- Uso de ratones C57 black six de ocho a doce semanas de edad.
- Implementación de una cinta rodante para ejercicio con estímulo eléctrico de baja intensidad.
- Medición de los niveles de autofagia mediante el transgén GFP-LC3.
- Comparación de los niveles de autofagia antes y después del ejercicio.
Resultados principales
- La activación de la autofagia se indujo con éxito mediante ejercicio aeróbico.
- Ciertos tejidos mostraron niveles variables de autofagia tras el ejercicio.
- Los hallazgos respaldan la hipótesis de que el ejercicio mejora la autofagia.
- Los resultados contribuyen a comprender los beneficios fisiológicos del ejercicio.
Conclusiones
- El ejercicio aeróbico es un método eficaz para activar la autofagia in vivo.
- Comprender el papel de la autofagia puede ayudar en las estrategias de prevención de enfermedades.
- Se necesita más investigación para explorar los mecanismos detrás de estos efectos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este estudio demuestra un método fisiológico para activar la autofagia in vivo mediante ejercicio aeróbico en ratones, proporcionando un enfoque no farmacológico para modular una vía clave de degradación celular. La capacidad de cuantificar el flujo autofágico mediante los marcadores LC3 y p62 permite reducir los riesgos mecanicistas de las intervenciones relacionadas con el ejercicio en modelos preclínicos. Esto respalda la validación de dianas y el desarrollo de ensayos para enfermedades en las que la modulación de la autofagia es terapéuticamente relevante.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la autofagia como diana terapéutica mediante inducción fisiológica en lugar de agentes farmacológicos.
- Valor operativo: Utiliza el sistema reportero GFP-LC3 para visualizar la formación de autofagosomas en tejidos específicos como el músculo esquelético y la corteza cerebral.
- Valor predictivo: Mide la conversión de LC3-II lipídica y la degradación de p62 para evaluar el flujo autofágico, lo que respalda la confianza en la interacción con la diana y la modulación de la vía.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Establece protocolos estandarizados para el ejercicio en cinta rodante y la carrera voluntaria en rueda con el fin de inducir la autofagia en múltiples órganos.
- Resultado cuantitativo: Emplea inmunotransferencia por blot de proteínas y microscopía para medir los niveles de LC3-II y la degradación de p62 como indicadores confiables de la actividad autofágica.
- Reproducibilidad: Incluye el tratamiento con cloroquina para distinguir un mayor flujo autofágico de una degradación deficiente, lo que mejora la especificidad del ensayo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Relaciona el ejercicio aeróbico con la regulación positiva de la autofagia en hígado, corazón, cerebro y músculo — tejidos relevantes para enfermedades metabólicas, neurodegenerativas y cardiovasculares.
- Continuidad traslacional: Facilita la evaluación preclínica de intervenciones basadas en el estilo de vida al proporcionar una lectura cuantificable de biomarcadores (LC3-II/p62) para la activación de la vía.
- Reducción mecanicista de riesgos: Aclara si los beneficios observados se deben a un aumento en el flujo autofágico o a un bloqueo de la degradación, reduciendo interpretaciones falsas positivas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, particularmente para vías que implican la homeostasis celular y la respuesta al estrés.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre el papel de la autofagia en los beneficios mediados por el ejercicio, al permitir una activación controlada e inducible in vivo.
- Tamizaje: Prepara sistemas biológicos validados (por ejemplo, tejidos de ratones ejercitados) para tamizajes posteriores de compuestos o factores genéticos dirigidos a reguladores de la autofagia.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (conversión de LC3-II, degradación de p62) que permiten comparaciones entre diferentes condiciones y puntos temporales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica al alinear la autofagia inducida por el ejercicio con modelos de enfermedades específicas de cada tejido.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la modulación de la autofagia en diversas áreas de enfermedades mediante protocolos estandarizados de ejercicio y detección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una perspectiva mecanicista sobre la regulación de la autofagia, reduciendo la ambigüedad en los estudios de validación de dianas.
- Valor operativo: Ofrece procedimientos estandarizados y reproducibles para inducir y medir la autofagia in vivo utilizando equipos accesibles (cintas de correr, ruedas para correr).
- Valor estratégico: Informa decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación preclínica de estrategias moduladoras de la autofagia con relevancia fisiológica.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas dirigidos a la autofagia mediante datos preclínicos predictivos basados en mecanismos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de animales, fisiología del ejercicio y en la sincronización de la recolección de tejidos para evitar estrés o lesiones que puedan confundir los resultados.
- Depende de instrumentación que incluye cintas de correr calibradas, ruedas de ejercicio con odómetros y sistemas de perfusión para la fijación de tejidos.
- Exige estandarización entre laboratorios en cuanto a la duración e intensidad del ejercicio y la dosificación de cloroquina, para asegurar mediciones comparables del flujo autofágico.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la variabilidad específica del tejido en la respuesta autofágica y la necesidad de una recolección oportuna tras el ejercicio o el tratamiento con inhibidores.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad entre animales en la distancia recorrida voluntariamente y la dificultad técnica de mantener una intensidad de ejercicio constante sin recurrir a descargas eléctricas excesivas en las patas.
