Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular

El objetivo general de este protocolo es describir cómo utilizar un microscopio confocal equipado con un láser de pulso de femtosegundo para generar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales derivadas de vasculares incrustadas en hidrogeles de diacrilato de polietilenglicol utilizando la degradación basada en láser guiada por imágenes. Una ventaja significativa de esta técnica es la capacidad de generar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales que recapitulan con precisión la densidad, la tortuosidad, el rango de tamaños y la arquitectura general de la vasculatura in vivo en construcciones sintéticas. Este enfoque de fabricación microfluídica mejorará nuestra capacidad para generar más in vivo, como construcciones de ingeniería de tejidos, modelos de enfermedades biomiméticas y dispositivos de ultra alta densidad en un chip.

La demostración visual de este método es fundamental porque la configuración e implementación adecuadas del software del microscopio no son intuitivas, pero son cruciales para formar las redes microfluídicas deseadas. Muchos de los pasos preparatorios se tratan en el protocolo de texto, incluida la generación de las máscaras virtuales, la configuración del microscopio y la carga de las máscaras virtuales en el software del microscopio. Para fotopolimerizar el hidrogel PEGDA, primero coloque un anillo de adhesivo de doble cara en una placa de Petri de 60 milímetros que tiene un orificio de 20 milímetros cortado en la parte inferior.

A continuación, en una campana extractora, agregue un mililitro de HBS con TEOA a un tubo de centrífuga ámbar de dos mililitros cubierto con papel de aluminio. A continuación, añade al tubo 10 microlitros de un milimolar de sal disódica Eosina Y. Ahora, pipetee un pequeño volumen de NVP en un vaso de precipitados de vidrio con una pipeta de vidrio.

De este volumen, tome 3,5 microlitros de NVP y transfiéralo a la mezcla. A continuación, agregue 10 miligramos de 3,4 kilodalton PEGDA a un segundo tubo cubierto con papel de aluminio. A continuación, añada 0,2 mililitros de la mezcla para hacer una solución de prepolímero PEGDA del 5% en peso por volumen.

Ahora, agite la solución de prepolímero hasta que el PEGDA se disuelva por completo. A continuación, pipetear 60 microlitros en un molde de PDMS sin introducir ninguna burbuja. Ahora, centre un cubreobjetos de vidrio acrílico de 40 milímetros con número 1.5 sobre la solución en los espaciadores PDMS.

A continuación, coloque el conjunto bajo una fuente de luz blanca calibrada para suministrar 95 milivatios. Cura el polímero durante tres minutos. A continuación, haga fluir agua destilada entre el molde y el cubreobjetos para separar el hidrogel del PDMS y enjuague el hidrogel.

A continuación, seque con cuidado los bordes del cubreobjetos sin absorber el agua del hidrogel. Ahora, adhiera el cubreobjetos a la placa de Petri preparada. Un poco de presión ayuda.

A continuación, sumerge el hidrogel en agua destilada. Configure el microscopio confocal de barrido láser como se describe en el protocolo de texto e inicie la configuración de visualización de hidrogel. A continuación, coloque el hidrogel y la placa de Petri en el inserto del escenario y colóquelo en el escenario.

A continuación, llene la placa de Petri con al menos cinco mililitros de agua destilada y baje el objetivo de inmersión en agua justo por encima del hidrogel sin entrar en contacto con él. Ahora, haga clic en vivo para encender la línea láser de argón. Luego, concéntrese en el hidrogel hasta que se pueda ver la señal Eosin Y en la parte superior del hidrogel.

Para ayudar a encontrar el hidrogel, intente aumentar temporalmente el porcentaje de potencia o el tamaño del agujero de alfiler. Marque las ubicaciones de la parte superior e inferior del hidrogel, y del fondo del pozo. Luego use el joystick para moverse transversalmente y encontrar los bordes del pozo.

En la ventana de enfoque, baje el plano de enfoque 150 micras dentro del hidrogel usando la flecha hacia abajo junto al cuadro de posición Z. El siguiente paso es fundamental. Ponga a cero las ubicaciones X e Y en la ventana del escenario y, a continuación, elimine todas las demás ubicaciones marcadas y marque solo la ubicación puesta a cero.

Ahora, para comenzar el proceso de formación de un canal de entrada, primero tome una imagen y luego, usando el botón rectangular en la ventana de regiones, delinee la región que será la entrada a la red vascular. A continuación, pase a la configuración de formación de canales. Los detalles se proporcionan en el protocolo de texto.

Una vez allí, en una ventana de pila Z, haga clic en los botones centrales en la parte superior y encima del desplazamiento para centrar la pila Z en la posición actual. Luego, dependiendo de qué tan grande deba ser la entrada, establezca el número de cortes con un intervalo de uno. Ahora, verifique que la velocidad esté configurada en tres y que el porcentaje de potencia esté configurado en 100.

A continuación, proceda a guardar la configuración y haga clic en el botón Iniciar experimento. Para visualizar el hidrogel durante la degradación del canal, aumente el maestro de ganancia en la ventana de canales si la región en el campo de visión es negra, o disminuya el maestro de ganancia si la región es blanca. Después de la degradación, asegúrese de que se formó la entrada volviendo a la configuración de visualización de hidrogel y haciendo clic en vivo.

Primero, en la ventana de regiones, cargue cualquier archivo ovl de la pila Z de máscaras virtuales y haga clic en el botón de flecha para ver los ROI en el campo de visión. A continuación, haga clic en vivo para escanear la configuración de visualización del hidrogel y utilice el joystick o la ventana de la etapa para colocar el hidrogel de modo que la entrada se conecte a la ubicación correcta dentro de la red vascular. A continuación, suelte el plano de enfoque a la primera posición en la macro del microscopio, que está 50 micras por debajo de la ubicación Z centrada anterior, utilizando el tamaño de paso en la ventana de enfoque y haciendo clic en la flecha hacia abajo.

Una vez más, ahora es fundamental volver a poner a cero las ubicaciones X e Y, eliminar todas las demás ubicaciones marcadas y marcar solo esta ubicación como el nuevo punto cero. Asegúrese de guardar esta nueva configuración. Ahora, en la configuración de formación de canales, seleccione solo las series temporales y las ventanas de blanqueo.

A continuación, abra la macro y seleccione la pestaña de guardar, seleccione la receta hecha anteriormente y haga clic en aplicar. Asegúrese de no hacer clic en almacenar, o la receta se sobrescribirá.

Después de verificar los ajustes, guarde de nuevo la configuración de formación de canales y, a continuación, haga clic en actualizar en la macro del microscopio. Haga clic en no para sobrescribir la lista de ubicaciones actual y, a continuación, haga clic en iniciar en la macro del microscopio para comenzar la receta. Una vez completado el proceso de degradación, utilice la configuración de visualización de hidrogel a una potencia láser más baja para permitir la visualización del dextrano marcado con FITC, que tiene una señal más brillante que la señal Eosina Y nativa del hidrogel.

Antes de introducir el dextrano marcado con fluorescencia, absorba un poco de agua del pozo en el hidrogel. A continuación, pipetee 10 microlitros de dextrano filtrado marcado con FITC. El procedimiento descrito se utilizó para convertir un gran volumen de imágenes microvasculares en una serie de máscaras virtuales para la formación de redes microfluídicas guiadas por imágenes.

La red microfluídica resultante se comparó con la vasculatura in vivo de la que se derivaba. La degradación de hidrogel basada en láser guiada por imágenes permitió la fabricación de redes microfluídicas biomiméticas en 3D que recapitulan el tamaño, la tortuosidad y la compleja arquitectura de la vasculatura in vivo. Se utilizaron cabezales de presión y bombas de jeringa para iniciar el flujo de fluido en estas redes microfluídicas integradas.

Se observaron perlas de dextrano de 70 kilodalton y poliestireno de 10 micras marcadas con fluorescencia que se movían de izquierda a derecha mediante un flujo inducido por una cabeza de presión. Alternativamente, el flujo impulsado por la bomba de jeringa se inició mediante la fotopolimerización de un hidrogel dentro de un dispositivo microfluídico secundario. Utilizando el mismo protocolo descrito aquí, se implementó la degradación basada en láser para fabricar una red derivada vascular 2D en un hidrogel alojado para el flujo impulsado por la bomba de jeringa y la profusión de 65 kilodalton dextrano.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar un microscopio confocal de barrido láser equipado con un láser de pulso de femtosegundo para generar redes microfluídicas biomiméticas utilizando la degradación de hidrogel basada en láser guiada por imágenes. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos o tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los parámetros del láser, incluida la potencia, la longitud de onda y la velocidad de escaneo, deben ajustarse y optimizarse en función de la formulación del hidrogel que se degrade.

Gracias y buena suerte con tus experimentos.