Name: Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende a fabricar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales usando degradación láser guiada por imagen en hidrogeles PEGDA. Esta técnica avanza la ingeniería de tejidos y el modelado de enfermedades in vitro.

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Los autores agradecen al Dr. Jeff Caplan y al Sr. Michael Moore del Centro de Bio-Imagen del Instituto de Biotecnología de Delaware por su apoyo con la microscopía confocal. El acceso a los equipos de microscopía contó con el apoyo de las subvenciones de instrumentación compartida de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (S10 RR0272773 y S10 OD016361) y el Programa Federal de Subvenciones para Investigación y Desarrollo del Estado de Delaware (16A00471). Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Premio al Desarrollo Institucional (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (P20GM103446), la Sociedad Americana del Cáncer (14-251-07-IRG), la Fundación de Investigación de la Universidad de Delaware (14A00778), el Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (CPRIT) (RR140013) y la Biblioteca Nacional de Medicina de los NIH (4 R00 LM011390-02).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Crítico en anulando las funciones estándar del software de microscopio para permitir el uso de máscaras virtuales para, la degradación basada en láser guiada por imagen, la macro microscopio debe ser configurado y manipulado con cuidado. ¿Cómo las interfaces de software microscopio con la macro microscopio a veces puede ser contrario a la intuición, y mucho esfuerzo se ha invertido en la determinación de la configuración óptima en ambos programas para desarrollar este método. Se recomienda un conocimiento general de escaneo láser confocal básica uso del microscopio, especialmente con la &quot;Etapa&quot; y &quot;ventanas&quot; Focus para la búsqueda y el posicionamiento del hidrogel en las x, y, z y dimensiones, antes de intentar la degradación basada en el láser correctamente. Además, la fabricación de un canal de entrada es crítica para el protocolo; especies fluorescentes suspendidos deben ser capaces de entrar en los sistemas de microfluidos para obtener imágenes de éxito y la caracterización de la red. Es importante señalar que este protocolo se aplica a una específica lásermicroscopio confocal de barrido configurado con un láser pulsado de femtosegundo específica, con versiones específicas del software de microscopio y la macro microscopio (ver detalles en la Lista de materiales específicos / Equipo). Hemos descubierto que las nuevas versiones de la macro microscopio carecen de la funcionalidad necesaria de control y necesaria para el control de láser guiada por imagen. Mientras que otras plataformas de microscopio y las fuentes de láser de impulsos se pueden utilizar, este protocolo se aplica específicamente a este sistema y necesitará modificación de acuerdo con la plataforma, fuente de láser, y el software implementado. Los principios que subyacen a lo largo de este protocolo se siguen aplicando, sin embargo. Una modificación potencial de este protocolo consiste en cambiar la composición de hidrogel. Aquí, se utilizó 5% en peso, 3.4 hidrogeles kDa PEGDA, pero la degradación basada en láser (para fines aparte de la generación de la red de microfluidos) ha sido implementado para degradar ambos hidrogeles sintéticos y naturales, incluyendo PEGilado fibrina21,22 fibrinógeno, proteína de seda hidrogeles de 23, 24 y colágeno. El ajuste de la potencia del láser, velocidad de exploración, el espaciamiento entre Z-rebanadas, y el número de repeticiones ayudará a determinar los parámetros óptimos para fabricar redes de microfluidos en otras formulaciones de hidrogel. Una limitación actual de la técnica es el volumen global de hidrogel que puede ser degradado en una cantidad factible de tiempo. Para crear huecos abiertos o características de microfluidos dentro del hidrogel, el láser el tiempo de permanencia debe ser igual o superior a 8,96 mu s / píxel (o una velocidad de barrido de láser de 0,021 m / microsiemens) cuando se utiliza una fluencia del láser de 37,7 nj / m 2. Con estos ajustes, se tarda 1,4 h para degradar los vasos dentro de un volumen 0.014 mm 3 (como se ve en la Figura 1). El uso de un láser de tiempo de permanencia de 4,48 mu s / píxel o por debajo, la energía suministrada no es suficiente para la completa degradación de la formulación de hidrogel utilizado aquí. La implementación de un hidrogel diferentecomposición podría superar esta limitación. El uso de geles fotolábiles que contienen componentes sensibles a la luz 34-36 o hidrogeles que tienen gran multifotónica secciones transversales 21-24 son buenas opciones que permitan el uso de menos energía y daría lugar a una degradación más rápida. Con respecto a las limitaciones dimensionales, las características se han fabricado hasta 1,5 mm de profundidad en el hidrogel 7. El alcanzable profundidad es una función de la distancia de trabajo del objetivo y se puede aumentar usando objetivos distancia de trabajo ultra-largas optimizados para formación de imágenes in vivo. El canal más pequeño medido 7 creado usando un 20X (NA1.0) objetivo de inmersión en agua tenía una anchura de 3,3 m y la profundidad de 8,9 m, la cual está a la par con el tamaño de los canales más pequeños generados en la Figura 1. Mientras que otros laboratorios han utilizado objetivos inferiores NA 21,23,24, anticipamos que las redes de microfluidos con características más pequeñas se pueden generar utilizando altaer objetivos de NA, a expensas de una distancia de trabajo reducida. En última instancia, sin embargo, la resolución de la técnica es una función de la función de dispersión de punto del haz de láser enfocado, las propiedades de exploración láser, la cantidad de energía suministrada por el láser, y las propiedades de absorción de láser del material que está siendo degradado. Además, las propiedades de láser (velocidad, fluencia, el espaciamiento entre las máscaras virtuales, y el número de repeticiones) deben optimizarse basándose en las propiedades de hidrogel (densidad de reticulación, / peso macrómero monómero molecular, por ciento en peso, y el tipo de hidrogel: proteína de base sintética vs. ), ya que estos inherentemente alterar las interacciones con el láser y por lo tanto la resolución final del proceso. A medida que la energía entregada también se ve influida por el objetivo utilizado, se requiere una optimización adicional cuando se cambia entre objetivos. Con respecto a los costos involucrados, se requiere el acceso a un microscopio con un láser de impulsos, y mientras muchos objec diferentetantes se pueden utilizar, los que tienen un alto NA y larga distancia de trabajo (para formación de imágenes in vivo) puede ser costoso. Por encima y más allá del protocolo detallado aquí, las redes de microfluidos generados utilizando esta técnica también se pueden funcionalizar con péptidos de células adhesivo post-canal de fabricación para inducir la adhesión de células endoteliales y la formación del lumen 7. Además, la incorporación de secuencias de péptidos de células degradable en el material a granel 9 antes de canalizar la degradación podría permitir para el estudio de la migración de células en y a través del hidrogel. Para la fluidización continua de la red de microfluidos en el hidrogel, los hidrogeles se pueden fotopolimerizar en dispositivos fluídicos o carcasas más grandes, como se demuestra en las figuras 2 y 3 7. La generación de redes vasculares a través de auto-ensamblaje de origen vascular o angiogénico 8-12 proporciona un enfoque sencillo para inducir VAscularization lo largo de un volumen relativamente grande de hidrogel. Si bien este enfoque resulta en redes de fluidos perfusable, es difícil de controlar directamente el tamaño, tortuosidad, la densidad, y la arquitectura general de la red. Debido a esta limitación, el perfil de flujo y velocidades de cizallamiento en la vasculatura pueden diferir entre los experimentos. Alternativamente, las técnicas de microfabricación 13-16 permiten el control directo sobre la arquitectura de red, pero a menudo están limitados por su incapacidad para generar canales pequeñas, capilares de tamaño o la fabricación de redes densas que imitan la arquitectura vascular in vivo. Mientras que la técnica de degradación de hidrogel basado en láser descrito aquí ha sido recientemente reutilizados para la generación de microfluidos, simultáneamente supera tanto el control de la arquitectura y limitaciones basadas en el tamaño de los métodos de microfabricación existentes al permitir la creación de 3D redes de microfluidos biomiméticos que recapitular la densidad, tortuosidad, rango de tamaño, y Architectur generale de la vasculatura in vivo. Además, múltiples redes de fluidos pueden ser generados en un solo hidrogel, lo que permite el estudio de transporte inter-red 7. Para aplicaciones de ingeniería de tejidos que se esfuerzan por reproducir más de cerca en los procesos de transporte in vivo in vitro, las redes de microfluidos de hidrogel incrustado altamente resueltos descritos aquí son muy adecuados. Anticipamos que este protocolo será útil en el desarrollo de construcciones de tejido que más de reproducir fielmente el transporte in vivo para su uso como dispositivos de detección de drogas y en modelos in vitro de enfermedades.

El sistema vascular, que consiste tanto linfático y vasos cardiovasculares, las formas de las redes de alta densidad que son esenciales para el transporte de nutrientes y oxígeno y para la eliminación de desechos metabólicos. En consecuencia, las células que residen en los tejidos vascularizados son nunca más de 50 a 100 micras de distancia de un recipiente 1. La capacidad para reproducir la arquitectura vascular in vivo in vitro es crítica para modelar con precisión los procesos de transporte en vivo usando construcciones de ingeniería. Con una reciente unidad para desarrollar dispositivos de órgano-on-a-chip 2 para drogas de alto rendimiento de detección 3,4 y 5,6 modelización de enfermedades, métodos para crear redes de microfluidos que recapitular el transporte in vivo -como en hidrogeles sintéticos o naturales están dibujo un interés significativo. Para mejorar la biomimética de microtejidos utilizados en estos dispositivos, hemos desarrollado un método de degradación de hidrogel guiada por imagen, basado en láser que utiliza tres dimensional pilas de imágenes (3D) de la vasculatura nativa como plantillas para generar redes de microfluidos vasculares derivados incrustados en PEGDA hidrogeles 7. Este protocolo describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser comercialmente disponible equipado con un láser de impulsos de femtosegundo para fabricar, redes de microfluidos biomiméticos vasculares derivados de hidrogeles PEGDA a través de, la degradación basada en láser guiada por imagen. Los enfoques actuales para fluidificar hidrogeles incluyen la inducción de origen vascular o 8-10 10-12 técnicas de células endoteliales de autoensamblaje y microfabricación angiogénicos para crear canales pre-definidos para la endotelización 13-16. Si bien las redes autoensambladas recapitulan la densidad y la arquitectura compleja de microvasculatura, a menudo son más permeables que las redes in vivo 11,17,18, que puede ser problemático en el transporte de modelado para aplicaciones de cribado de fármacos. redes de auto-ensambladas consisten en physiologcamente relevante, los vasos capilares de tamaño, pero pueden ser difíciles de integrar en el flujo de fluido a granel debido a las limitaciones en la generación de buques de mayor tamaño de las arteriolas. Como no hay un control directo sobre el conjunto de estas redes, la arquitectura final puede variar de una muestra a otra, por lo que es difícil de producir repetidamente redes con las mismas propiedades de flujo y de transporte de fluidos. Para generar 3D, las redes de microfluidos de hidrogel incrustado con geometría repetible y la arquitectura bien definida, un número de técnicas de microfabricación se han desarrollado, incluyendo el montaje modular 13, la impresión 3D de materiales de sacrificio 16, de montaje y escritura directa 14, y la impresión de omnidireccional 15. La aplicación de estos métodos, la arquitectura de microfluidos, y propiedades de flujo y de transporte, por tanto, de fluidos, se pueden fabricar varias veces a través de muchas construcciones. Una limitación importante de estos enfoques, sin embargo, es la incapacidad para crear microfluidic redes con características capilares de tamaño, de 4 a 10 micras 19. La mayoría de las técnicas de microfabricación a menudo se limitan a las características de 150 a 650 micras de diámetro 13,16. Algunas de las técnicas existentes son capaces de generar redes jerárquicas con canales a través de un rango de diámetro de ancho, 10 a 300 micras para el montaje y escritura directa 14, y 18 a 600 micras para la impresión omnidireccional 15, pero están limitados en su capacidad de generar redes densas o para producir múltiples redes de microfluidos en estrecha proximidad dentro de un mismo constructo 7. Para superar algunas de estas limitaciones, se desarrolló una, técnica de degradación de hidrogel basado en láser guiada por imagen que permite la fabricación repetible de biomimético, redes de microfluidos jerárquicas que recapitular la arquitectura de la microvasculatura en vivo. Para ello, un 790 nm, 140 femtosegundos (fs) de láser pulsado que funciona a 80 MHz es la trama i-escaneadan deseada ubicaciones 3D dentro de un hidrogel, como se define por las imágenes de la vasculatura in vivo. Especulamos que el proceso de degradación opera a través de la descomposición inducida por láser óptico de agua, la formación de plasma resultante, la posterior expansión termoelástica rápido de agua, y la degradación local de la hidrogel como el agua se expande 20. Este mecanismo varía ligeramente de degradación basado en láser de hidrogeles a base de proteínas 21-24. A diferencia de PEGDA, que tiene una sección transversal multifotónica bajo, las proteínas tienen a menudo una sección transversal de multifotónica grande y por lo tanto se degradan a través de una multifotónica absorción inducida por la rotura química 23. Para generar redes de microfluidos guiados por imagen, el obturador de láser se controla por las máscaras virtuales imagen derivada, que consisten en un mosaico de regiones de interés 9 que definen la arquitectura de microfluidos. Con este enfoque, hemos demostrado la capacidad de fabricar 3D microfluidos biomimético vasculares derivadasredes ic, que recapitulan la arquitectura densa y tortuosa de la vasculatura in vivo, a fin de controlar localmente la porosidad de los hidrogeles mediante la alteración de la cantidad de energía suministrada durante la degradación. También hemos sido capaces de generar dos redes independientes de microfluidos que se entrelazan en las proximidades (15 micras), pero nunca se conectan directamente 7. También hemos demostrado la capacidad de endothelialize microcanales láser degradada a través funcionalización degradación post con la secuencia del péptido ligando de integrina, arginina-glicina-ácido aspártico-serina (MFG), para promover la adhesión de las células endoteliales y la formación del lumen 7. Con este protocolo, se hace posible la generación de redes complejas de microfluidos en hidrogeles PEGDA vía, la degradación basada en láser guiada por imagen utilizando un microscopio disponible comercialmente accesibles en muchos campus universitarios. A medida que el proceso de degradación se guía por las máscaras digitales, virtuales, esta fabricatécnica de la es susceptible para el diseño creativo de redes de microfluidos, permitiendo su uso en una amplia variedad de aplicaciones. Anticipamos que el método descrito aquí será más ventajosa en el diseño de dispositivos zaciones y humanos-on-a-chip biomiméticos capaces de replicar los procesos de transporte biológicos importantes en el transporte de drogas de modelado 2. Esta técnica de fabricación también puede ser de interés para la generación de modelos de enfermedades in vitro, incluyendo la metástasis del cáncer 5,6 y modelos de la barrera hematoencefálica 25. Como la degradación de hidrogel basado en láser anteriormente se ha utilizado para crear pistas para la guía de excrecencia neuronal 21-23, la extensión guiada por imagen de esta técnica podría resultar útil en estrategias avanzadas de ingeniería de tejidos para colocar las células en disposiciones espaciales en 3D definidos por el usuario.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2015a</td><td>denominado "software de programación" en el protocolo; consulte la fuente 9 para obtener más información sobre el algoritmo</td></tr><tr><td>FIJI (Fiji is Just Image J)</td>La <td>versión 1.51a de</td> <td>NIH</td><td>denominada "software de procesamiento de imágenes" en el protocolo</td></tr><tr><td>LSM 780 Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>denominado "microscopio confocal de barrido láser" en el protocolo; para hidrogel basado en láser degradación</td></tr><tr><td>Zen 2010B SP1</td><td>Zeiss</td><td>versión 6.0</td><td>denominada "software de microscopio" en el protocolo; para uso en Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Multitime, 2010</td><td>Zeiss</td><td>v16.0</td><td>denominada "macro de microscopio" en el protocolo; para uso en Zeiss LSM-780 (junto con Zen)</td></tr><tr><td>Objetivo W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mm</td><td>Zeiss</td><td>421452-9880-000</td><td>para uso en Zeiss LSM-780</td></tr><tr><td>Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>denominado "láser pulsado de alta potencia" en el protocolo</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina (TEOA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td>inflamable; irritante de la piel y los ojos; trabajo con en una campana extractora</td></tr><tr><td>de sodio hidróxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Tazas de filtración al vacío con 0.2 y micro; m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>10040-460</td><td></td></tr><tr><td>PEGDA</td><td>sintetizada internamente</td><td></td><td>consulte la fuente 33 para los métodos de síntesis; almacene bajo argón</td></tr><tr><td>Eosina Y sal disódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>1-vinil-2-pirrolidinona (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>almacene bajo argón; cancerígeno; trabajo con en una campana extractora</td></tr><tr><td>3M Cinta de doble capa, 9500PC, 6.0 mil</td><td>Thomas Goldkamp</td><td>37728</td><td></td></tr><tr><td>Flexmark 90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>soporte para la manipulación de cinta de doble capa</td></tr><tr><td>Modelo SC Plotter (cortador de adhesivo)</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>utilizado para cortar adhesivo en forma de anillo para conectar cubreobjetos a placas</td>de</tr><tr><td>Petri Placa de Petri de 60 mm con orificio de 20 mm MatTek</td><td>Corporation</td><td>P60-20-F-NON</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de alta intensidad (fuente de luz blanca)</td><td>Fiber-Lite</td><td>4715MS-12WB10</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de potencia</td><td>Newport</td><td>1916-R</td><td>detecta potencia a 524 nm cuando se usa una fuente de luz blanca</td></tr><tr><td>Detector de varilla de perfil delgado</td><td>Newport</td><td>918D-ST</td><td>para usar con medidor de potencia</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>utilizado para hacer moldes de PDMS; consulte la fuente 7 para conocer los métodos</td></tr><tr><td>Cubreobjetos #1.5 Funcionalizados por TMPSA, 40 mm Redondos</td><td>sintetizados internamente</td><td></td><td>consulte la fuente 7 para conocer los métodos</td></tr><tr><td>Dextrano, Fluoresceína, 2.000.000 MW, Aniónico, Lisina Fixable</td><td>Life Technologies</td><td>D7137</td><td>puede utilizar dextrano marcado alternativo; 2.000 kDa no se difunde fácilmente en un hidrogel PEGDA al 5% 3,4 kDa</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL, Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Acrodisc, 0.2 y micro; m Membrana Supor, Félica de Baja Unión a Proteínas</td><td></td><td>PN 4602</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide VI0.4&nbsp; </td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>dispositivos microfluídicos que se pueden utilizar para alojar hidrogeles</td></tr></tbody></table>

guiada por imagen, fabricación basada en láser de redes de microfluidos derivados-vascular

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

Este protocolo detallado describe la aplicación de guiado por imágenes, la degradación del hidrogel basado en láser para la fabricación de redes de microfluidos vasculares derivados incrustados en hidrogeles PEGDA. Aquí, se describe la creación de máscaras virtuales que permitan el control de láser guiada por imagen; la fotopolimerización de un hidrogel PEGDA micromolded, adecuadas para la fabricación de la red de microfluidos y el flujo de cabeza impulsada por la presión; la configuración y el uso de un microscopio confocal de barrido láser disponible en el mercado junto con un femtosegundo pulsada Ti: S láser para inducir la degradación de hidrogel; y la formación de imágenes de las redes de microfluidos fabricados utilizando especies fluorescentes y microscopía confocal. Gran parte del protocolo se centra en la configuración y ejecución del software de microscopio y microscopio macro, ya que estos son pasos cruciales en el uso de un microscopio comercial para fines de fabricación de microfluidos que contienen una serie de complejidades. El componente guiada por imagen de este technique permite la implementación de las pilas de imágenes en 3D o modelos 3D generados por los usuarios, con lo que permite un diseño creativo y de microfluidos para la fabricación de sistemas de microfluidos complejas de prácticamente cualquier configuración. Con un impacto esperado en la ingeniería de tejidos, los métodos descritos en este protocolo podrían ayudar en la fabricación de construcciones avanzadas microtejidos biomiméticos para dispositivos zaciones y humanos-en-un-chip. Al imitar la compleja arquitectura, tortuosidad, el tamaño y la densidad de la vasculatura in vivo, los procesos esenciales de transporte biológicos pueden ser replicados en estas construcciones, dando lugar a más precisa de modelado in vitro de la farmacocinética de las drogas y las enfermedades.

Para demostrar la aplicación de las guiada por imagen, la degradación del hidrogel a base de láser para generar una red de microfluidos 3D, vascular deriva, se utilizó una pila de imágenes en 3D de la vasculatura del cerebro de ratón que fue adquirida a través de microscopía de barrido filo de cuchillo (KESM) 26, 27 . Una región 3D seleccionado del conjunto de datos más grande microvascular se convirtió en una serie de máscaras virtuales para la formación de la red de microfluidos guiada por imagen, como se describió anteriormente. Después de la fabricación, la red de microfluidos resultante se perfundió con una solución de marcado con FITC, 2000 kDa de dextrano y la imagen a través de microscopía confocal. La pila de imágenes de la vasculatura in vivo que define la arquitectura de red (Figura 1 A y C) y la red de microfluidos fabricado (Figura 1B y D) se utilizaron para generar Z-proyecciones (Figura 1A y B) y representaciones en 3D (Figura 1C y re </strong&gt;). La comparación de las imágenes demuestra que guiada por imagen, la degradación del hidrogel basado en láser permite la fabricación de 3D redes de microfluidos biomiméticos que recapitular el tamaño, la tortuosidad, y la arquitectura compleja de la vasculatura in vivo. La técnica es susceptible de fabricación de redes que contienen una amplia gama de diámetros; dentro de la figura 1, se generaron los canales que van desde 3,3 hasta 28,8 m de diámetro. Tenga en cuenta que la estructura rectangular más grande en la parte superior izquierda de la figura 1B y en la esquina izquierda de la figura 1D es el canal de entrada para introducir el flujo en la red. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig1.jpg" /> Figura 1: Vascular-Derivado de microfluidos red. Una serie de máscaras virtuales, derivado de una pila de imágenes de la vasculatura de cerebro de ratón (A y C), se utilizaron para fabricate una red de microfluidos biomimético 3D incrustado en un hidrogel PEGDA (B y D) a través de, la degradación basada en láser guiada por imagen. La red de microfluidos se perfundió con dextrano marcado con FITC 2.000 kDa y fotografiado a través de microscopía confocal. Z-proyecciones (A y B) y representaciones en 3D (C y D) de las dos redes demuestran la capacidad de generar redes de microfluidos que recapitular la densidad, la organización y la arquitectura general de la vasculatura in vivo. La flecha (D) marca la entrada rectangular creada para introducir el dextrano. La barra de escala representa 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Hemos implementado dos métodos, cabezales de presión y bombas de jeringa, para iniciar el fluido fbaja en estas redes de microfluidos integrados. Por ejemplo, un canal rectangular 30 por 30 micras se fabricó para conectar dos pozos en un hidrogel PEGDA micromolded (Figura 2A), con el flujo de fluido conducido a través de un cabezal de presión 7. Generada en el pozo a la izquierda, la carga de presión inducida por el flujo a través del microcanal y en el pozo a la derecha. En la figura 2A, un frente inicial de tetrametilrodamina (TRITC) -etiquetados, 70 kDa dextrano se observó en movimiento a través del canal mediante microscopía de lapso de tiempo. Más tarde, en la Figura 2B, un diámetro de 10 micras de poliestireno fluorescente esfera fluyó desde el pozo a la izquierda, a través del canal, para el bien de la derecha. Con la duración del flujo controlado por el volumen de fluido presente en el micromolded bien en la entrada, y la velocidad de flujo controlada por el gradiente hidrostática generada entre la entrada y salida, así, el flujo de cabeza impulsada por presión en hidrogeles micromolded proporciona un método sencillo para el flujo enproducción, sin la necesidad de un alojamiento externo o una bomba de jeringa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig2.jpg" /> Figura 2: Flujo Presión Head-Driven en un Micromolded PEGDA de hidrogel. PEGDA se micromolded para formar un hidrogel que contiene dos pozos conectados por un microcanal incrustado. Una cabeza de presión se genera en el marcado con TRITC izquierda bien para iniciar el flujo de, 70 kDa dextrano (A1-A3) y una esfera de poliestireno 10 mm (B1-B3) a través de un canal rectangular 30 por 30 m de un pozo a la otro. La barra de escala representa 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Alternativamente, para generar un flujo constante de fluido dentro de las redes de microfluidos, bomba impulsada jeringa fbaja puede ser iniciado por la fotopolimerización del hidrogel en el interior de un dispositivo de microfluidos secundaria con los puertos de entrada y salida para la conexión de la bomba de jeringa. En la Figura 3A, un dispositivo de microfluidos pre-fabricados comercialmente disponible se muestra con una banda de 1 mm de hidrogel fotopolimerizar través de la anchura del dispositivo 7. la degradación basada en láser se implementó para fabricar canales de microfluidos y redes en hidrogeles alojados utilizando el mismo protocolo descrito aquí por autoportante hidrogeles. Flujo generado bomba de jeringa se puede ver en la Figura 3B, donde un canal cilíndrico de diámetro de 20 micras se fabricó en un hidrogel situado en un dispositivo de microfluidos. En este canal 20-m de diámetro, esferas de poliestireno fluorescentes 2-micras individuales se resuelven fácilmente sin flujo de fluido (Figura 3B1), mientras que cuando se aplica a / s caudal de 5 l, las esferas se mueven a través del campo de visión, como se evidencia por las rayas (Figura 3B2 &lt;/ Strong&gt;). Este mismo enfoque se utilizó para inducir el flujo a través de una red 2D, vascular derivados para controlar el flujo de TRITC marcado con, 65 kDa de dextrano a través de la red y la difusión en el hidrogel circundante (Figura 3C). <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55101/55101fig3.jpg" /> Figura 3: Flujo-Driven bomba de jeringa en PEGDA hidrogeles polimerizado en carcasas de microfluidos. A, dispositivo disponible comercialmente pre-fabricados de microfluidos (A) con un microcanal 17 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) alberga un fotopolimerizado 1 x 3,8 x 0,53 mm (x, y, z) PEGDA hidrogel, indicada por el flecha negro. Un canal cilíndrico de diámetro de 20 micras se degradó a través del hidrogel, y esferas de poliestireno-2 micras se bombea a través del dispositivo (B). Las esferas se resuelven claramente y sin flujo de fluido (B1), pero aparecen como rayas a un caudal de 5 mu l / s(B2). En otro hidrogel alojada, una red de origen vascular 2D fue fabricado y marcado con TRITC, 65 kDa dextrano se bombea a través de la red (C). La microscopía de lapso de tiempo se utiliza para controlar el dextrano fluorescente ya que llena los canales y se difunde en el hidrogel circundantes. Las flechas blancas en (B) y (C) indican la dirección del flujo de fluido. La barra de calibración en (C) indica la intensidad del dextrano fluorescente. Las barras de escala representan 20 micras de (B1) y (B2) y 50 micras de (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55101/55101fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe la implementación de la degradación de hidrogel basada en láser guiada por imágenes para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incrustadas en hidrogeles de diacrilato de poli(etilenglicol) (PEGDA). Estos sistemas microfluídicos biomiméticos pueden ser útiles para aplicaciones de ingeniería de tejidos, generación de modelos de enfermedades in vitro y fabricación de dispositivos avanzados "en un chip".

Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

El objetivo general de este protocolo es describir cómo utilizar un microscopio confocal equipado con un láser de pulsos femtosegundo para generar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales derivadas de vasos sanguíneos, embebidas en hidrogeles de diacrilato de polietileno, mediante degradación láser guiada por imagen. Una ventaja significativa de esta técnica es la capacidad de generar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales que reproducen con precisión la densidad, tortuosidad, rango de tamaños y arquitectura general de la vasculatura in vivo en construcciones sintéticas. Este enfoque de fabricación microfluídica mejorará nuestra capacidad para generar construcciones de tejidos ingenierizados más similares al entorno in vivo, modelos biomiméticos de enfermedades y dispositivos ultradensos en un chip.La demostración visual de este método es fundamental porque la configuración y ejecución adecuadas del software del microscopio no son intuitivas, pero son cruciales para formar las redes microfluídicas deseadas. Muchos de los pasos preparatorios se describen en el protocolo escrito, incluyendo la generación de máscaras virtuales, la configuración del microscopio y la carga de las máscaras virtuales en el software del microscopio. Para fotopolimerizar el hidrogel de PEGDA, primero fije un anillo de adhesivo doble cara a una placa de Petri de 60 milímetros que tenga un orificio de 20 milímetros recortado en la base.A continuación, en una campana extractora, agregue un mililitro de HBS con TEOA a un tubo centrífugo ámbar de dos mililitros cubierto con papel de aluminio. Luego, agregue 10 microlitros de sal de disodio de Eosina Y 1 mM al tubo. Ahora, aspire un pequeño volumen de NVP en un vaso de precipitados de vidrio utilizando una pipeta de vidrio.De este volumen, tome 3,5 microlitros de NVP y transfiéralos a la mezcla. A continuación, agregue 10 miligramos de PEGDA de 3,4 kilodalton a un segundo tubo cubierto con papel de aluminio. Luego, agregue 0,2 mililitros de la mezcla para obtener una solución prepolimérica de PEGDA al 5% peso por volumen.Ahora, agite la solución de prepolímero en vórtex hasta que el PEGDA se disuelva completamente. Luego, pipetee 60 microlitros sobre un molde de PDMS sin introducir burbujas. A continuación, coloque centrado un cubreobjetos de vidrio acrilatado de 40 milímetros número 1.5 sobre la solución, apoyado en los espaciadores de PDMS.Luego, coloque el ensamblaje bajo una fuente de luz blanca calibrada para entregar 95 milivatios. Polimerice el polímero durante tres minutos. A continuación, haga fluir agua destilada entre el molde y la lámina de cubierta para separar el hidrogel del PDMS y enjuague el hidrogel.Luego, seque cuidadosamente los bordes del cubreobjetos sin absorber agua del hidrogel. Ahora, adhiera el cubreobjetos a la placa de Petri preparada. Un poco de presión ayuda.Luego, sumerja el hidrogel en agua destilada. Configure el microscopio confocal de barrido láser según se describe en el protocolo escrito e inicie la configuración para la visualización del hidrogel. A continuación, coloque el hidrogel y la placa de Petri en el inserto del portaobjetos y colóquelo sobre la platina.A continuación, llene la placa de Petri con al menos cinco mililitros de agua destilada y baje el objetivo de inmersión en agua hasta situarlo justo encima del hidrogel sin que haga contacto con él. Ahora, haga clic en vivo para encender la línea láser de argón. Luego, enfoque el hidrogel hasta que la señal de Eosina Y pueda verse en la cara superior del hidrogel.Para ayudar a encontrar el hidrogel, intente aumentar temporalmente el porcentaje de potencia o el tamaño del diafragma. Marque las posiciones de la parte superior e inferior del hidrogel, y de la base del pocillo. Luego, use el joystick para moverse transversalmente y localizar los bordes del pocillo.En la ventana de enfoque, baje el plano de enfoque 150 micrones dentro del hidrogel utilizando la flecha hacia abajo junto al cuadro de posición Z. El siguiente paso es crítico. Ponga a cero la ubicación en X e Y en la ventana de la platina, luego elimine todas las demás ubicaciones marcadas y marque únicamente la ubicación puesta a cero.Ahora, para iniciar el proceso de formación de un canal de entrada, primero capture una imagen y luego, utilizando el botón de rectángulo en la ventana de regiones, delimite la región que será la entrada a la red vascular. A continuación, pase a la configuración de formación del canal. Los detalles se proporcionan en el protocolo escrito.Una vez allí, en una ventana de corte Z, haga clic en los botones centrales en la parte superior y sobre el desplazamiento para centrar el corte Z en la posición actual. Luego, dependiendo del tamaño que deba tener la entrada, establezca el número de cortes con un intervalo de uno. Ahora, verifique que la velocidad esté ajustada a tres y que el porcentaje de potencia esté fijado al 100 %.Luego, continúe con el guardado de la configuración y haga clic en el botón para iniciar el experimento. Para visualizar el hidrogel durante la degradación del canal, aumente el control maestro de ganancia en la ventana de canales si la región en el campo de visión es negra, o disminúyalo si la región es blanca. Después de la degradación, asegúrese de que se haya formado la entrada volviendo a la configuración de visualización del hidrogel y haciendo clic en directo.Primero, en la ventana de regiones, cargue cualquier archivo ovl de la pila Z de máscaras virtuales y haga clic en el botón de flecha para ver las ROI en el campo de visión. Luego, haga clic en directo para escanear la configuración de visualización del hidrogel y use el joystick o la ventana de la platina para posicionar el hidrogel de modo que la entrada se conecte al lugar correcto dentro de la red vascular. A continuación, baje el plano de enfoque a la primera posición en el macroscopio, que se encuentra 50 micrones por debajo de la ubicación Z centrada anterior, utilizando el tamaño de paso en la ventana de enfoque y haciendo clic en la flecha hacia abajo.Nuevamente, es fundamental volver a cero las posiciones X e Y, eliminar todas las demás posiciones marcadas y marcar solo esta posición como el nuevo punto cero. Asegúrese de guardar esta nueva configuración. Ahora, en la configuración de formación de canales, seleccione únicamente las ventanas de series temporales y de blanqueo.A continuación, abra la macro y seleccione la pestaña de guardado. Seleccione la receta creada previamente y haga clic en aplicar. Asegúrese de no hacer clic en almacenar, o la receta se sobrescribirá.Después de verificar la configuración, guarde nuevamente la configuración de formación de canales y luego haga clic en actualizar en la macroscopía del microscopio. Haga clic en no para no sobrescribir la lista de ubicaciones actual y, a continuación, haga clic en iniciar en la macroscopía del microscopio para comenzar la receta. Una vez completado el proceso de degradación, utilice la configuración de visualización del hidrogel con una potencia láser más baja para permitir la visualización del dextrano marcado con FITC, que tiene una señal más intensa que la señal nativa de Eosina Y del hidrogel.Antes de introducir el dextrano marcado con fluorescencia, retire con una mecha algo de agua del pozo en el hidrogel. Luego, agregue mediante pipeta 10 microlitros de dextrano marcado con FITC filtrado. El procedimiento descrito se utilizó para convertir un volumen grande de imágenes microvasculares en una serie de máscaras virtuales para la formación de redes microfluídicas guiadas por imagen.La red microfluídica resultante se comparó con la vasculatura in vivo de la cual se derivó. La degradación del hidrogel guiada por imagen mediante láser permitió la fabricación de redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales que reproducen el tamaño, la tortuosidad y la arquitectura compleja de la vasculatura in vivo. Se utilizaron tanto cabezales de presión como bombas de jeringa para iniciar el flujo de fluido en estas redes microfluídicas embebidas.Se observó que dextrano marcado con fluorescencia de 70 kilodalton y microesferas de poliestireno de 10 micrones se desplazaban de izquierda a derecha mediante un flujo inducido por presión hidrostática. Alternativamente, se inició un flujo impulsado por bomba de jeringa mediante la fotopolimerización de un hidrogel dentro de un dispositivo microfluídico secundario. Utilizando el mismo protocolo descrito aquí, se implementó posteriormente una degradación basada en láser para fabricar una red derivada vascular en 2D dentro de un hidrogel alojado, para el flujo impulsado por bomba de jeringa y la perfusión de dextrano de 65 kilodalton.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar un microscopio confocal de barrido láser equipado con un láser de pulsos femtosegundo para generar redes microfluídicas biomiméticas mediante la degradación del hidrogel guiada por imágenes láser. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos o tres horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los parámetros del láser, incluyendo la potencia, la longitud de onda y la velocidad de barrido, deben ajustarse y optimizarse según la formulación del hidrogel que se esté degradando.Gracias y buena suerte con sus experimentos.

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Siembra celular escalonada en andamios teselados para estudiar la brotación de los vasos sanguíneos

En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Los colgajos diseñados requieren una red vascular funcional incorporada. En este protocolo, presentamos un método de fabricación de un colgajo de tejido impreso en 3D que contiene una red vascular jerárquica y sus anastomosis microquirúrgicas directas a la arteria femoral de rata.

Fabricación de colgajos vasculares de ingeniería utilizando tecnologías de impresión 3D

Este protocolo presenta un modelo de tumor en un chip fisiológicamente relevante para realizar investigaciones básicas y traslacionales de alto rendimiento sobre el cáncer humano, avanzando en la detección de fármacos, el modelado de enfermedades y los enfoques de medicina personalizada con una descripción de los procedimientos de carga, mantenimiento y evaluación.

Establecimiento de un modelo fisiológico de microtumor vascularizado humano para la investigación del cáncer

Aquí presentamos un protocolo para construir un sistema de órgano en chip (OOC) diseñado para imitar la neumonectomía. Este sistema investiga la posible correlación entre el deterioro del glicocáliz y las complicaciones después de la neumonectomía.

Modelado del glicocálix endotelial después de la neumonectomía en un chip fluídico 3D: un enfoque para fabricar un sistema de órgano en chip basado en el sistema vascular

Aprende a fabricar redes microfluídicas biomiméticas tridimensionales usando degradación láser guiada por imagen en hidrogeles PEGDA. Esta técnica avanza la ingeniería de tejidos y el modelado de enfermedades in vitro.

Guiada por imagen, fabricación basada en láser de Redes de microfluidos derivados-vascular

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