Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Este manuscrito describe un método simple para medir el pH phagosomal y zona, así como el pH citoplasmático de los neutrófilos humanos y de ratón utilizando el indicador radiométrica seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Esto se consigue utilizando células vivas microscopía de fluorescencia confocal y análisis de imágenes.

El objetivo general de esta técnica de microscopía confocal es obtener imágenes del pH y el área de la vacuola fagocítica y el citoplasma de los neutrófilos. Este método permite monitorizar y cuantificar los cambios dinámicos en el pH de la vacuola fagocítica y en el citoplasma, así como en el volumen de la vacuola fagocítica. Estas mediciones cambian con la actividad de la NADPH oxidasa, y pueden utilizarse como marcadores sustitutos de su función y de los flujos de iones a través de la membrana de la vacuola fagocítica.

La principal ventaja de esta técnica es que tanto el fagosoma como el citoplasma se pueden visualizar simultáneamente con un colorante que tiene un amplio rango de pH. Para comenzar este procedimiento, prepare una alícuota de éster de succinimidilo carboxi-S-1 diluyendo 50 microgramos del mismo en 100 microlitros de DMSO de alto grado. Vórtice bien para mezclar.

A continuación, prepare un mililitro de uno por 10 al octavo calor o HK Candida en bicarbonato de sodio de 0,1 molar en un tubo de 15 mililitros. Agregue 100 microlitros de carboxi-S-1 una gota a la vez al HK Candida mientras mezcla en un vórtice a 2, 000 RPM. Después de eso, envuelva el tubo con papel de aluminio y colóquelo en un rodillo a temperatura ambiente durante una hora.

Después de una hora, lavar el HKC-S-1 tres veces por centrifugación a 2.250 veces g durante 10 minutos cada vez. Para los dos primeros lavados, vuelva a suspender el pellet en 15 mililitros de bicarbonato de sodio 0,1 molar. Después del tercer lavado, vuelva a suspenderlo en un mililitro de tampón BSS.

Transfiera la suspensión HKC-S-1 a los tubos de alícuotas de 100 microlitros y guárdelos a menos 20 grados centígrados. Para opsonizar HKC-S-1 para neutrófilos humanos, agregue 100 microlitros de suero IGG humano a 100 microlitros de HKC-S-1 descongelado. Mézclalo en una coctelera de calor a 37 grados centígrados y 1.1000 RPM durante 60 a 90 minutos, y luego en un rodillo, a cuatro grados centígrados durante dos horas.

Después de eso, lavar la muestra tres veces en tampón BSS por centrifugación a 17.000 veces g durante un minuto cada una. Posteriormente, vuelva a suspender la muestra en 100 microlitros de tampón BSS. En el caso de los neutrófilos de sangre periférica humana, se deben tomar 15 mililitros de sangre por venopunción de un donante sano y transferirla a una jeringa de 20 mililitros que contenga 90 microlitros de solución de heparina sódica a 1.000 UI por mililitro.

Con la punta de una pipeta, inyecte 1,5 mililitros de solución de dextrano al 10% en la jeringa. Inviértalo suavemente tres veces y luego déjelo de pie en el banco durante 30 a 60 minutos. Después de 30 a 60 minutos, la sangre debe dividirse aproximadamente por la mitad, con una capa superior de color pajizo y una capa inferior que contiene eritrocitos.

Empuje con cuidado la capa superior a través de una aguja o retírela con la punta de una pipeta, luego transfiérala a un tubo de 15 mililitros y evite sacar la capa roja. Con una pipeta de cinco mililitros, agregue de tres a cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad al fondo del tubo, debajo de la capa de leucitología, para obtener dos capas distintas. A continuación, centrifugar la muestra a 900 veces g durante 10 minutos.

Vierta el sobrenadante y deje la bolita roja. Después de eso, vórtice suavemente para perturbar el pellet. A continuación, agregue siete mililitros de agua destilada esterilizada en autoclave al pellet e inviértalo durante 20 segundos para volver a suspender el pellet.

A continuación, agregue siete mililitros de solución salina 2x e inviértala varias veces para mezclar, lisando los glóbulos rojos restantes, luego centrifugue la muestra a 300 veces g durante cinco minutos. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el tampón BSS a aproximadamente cuatro veces 10 por el sexto por mililitro. En este procedimiento, pretrate una placa de microscopía de ocho pocillos con 200 microlitros de poli-L-lisina en cada pocillo durante 40 a 60 minutos a temperatura ambiente, luego retire la poli-L-lisina y lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de agua destilada.

A continuación, agregue 200 microlitros de la suspensión celular preparada a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Después de eso, prepare una alícuota de éster S-1-AM agregando 100 microlitros de DMSO de alto grado a un tubo y vórtice para mezclar. En un tubo pequeño, agregue 1,7 mililitros de tampón BSS y 20 microlitros de S-1-AM y agite la mezcla.

Luego, lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de tampón BSS y reemplace el tampón con una solución S-1-AM. Tenga cuidado de no alterar la monocapa celular unida al fondo del pozo pipeteando suavemente el líquido por la pared de los pozos. Posteriormente, incubar la muestra a temperatura ambiente durante al menos 25 minutos.

A continuación, lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de tampón BSS. Para probar un inhibidor, prepare una mezcla maestra del medicamento apropiado en tampón BSS y lave los pocillos dos veces con él. A continuación, sonique el HKC-S-1 opsonizado durante aproximadamente tres segundos a cinco micras y agregue 10 microlitros a cada pocillo, luego incube la placa a 37 grados Celsius durante 15 a 20 minutos, preparando las células para obtener imágenes instantáneas de la fagocitosis.

Usando un microscopio confocal, ajuste la longitud de onda del láser para que las células se exciten a 555 nanómetros y la emisión sea detectada por dos detectores a 560 a 600 nanómetros y más de 610 nanómetros. A continuación, observe las celdas con una lente de inmersión en aceite de 63X. Use una imagen de escaneo de mosaico en configuración continua para ver el mosaico central.

Usando la intensidad de fluorescencia y la ganancia de los canales del detector, ajuste el enfoque y la intensidad del láser y la ganancia de los dos canales para optimizar la imagen. Después de eso, divida la imagen usando la configuración para ver ambos canales. Antes del inicio del experimento, compruebe que no hay saturación de la intensidad de fluorescencia en el citoplasma o las vacuolas, que aparecerían como puntos rojos.

Si es así, reduzca la intensidad del láser para que haya un número mínimo de puntos rojos, pero las células y los fagosomas sean lo suficientemente brillantes y claros como para ver. En este procedimiento, abra ImageJ y cargue el archivo de imagen seleccionado para el análisis en la barra de herramientas. Para combinar los dos canales, use Imagen, Color y, a continuación, Crear composición.

Haga clic con el botón derecho para elegir un archivo para almacenar los resultados. A continuación, haga clic en la herramienta Línea en la barra de herramientas y haga doble clic para aumentar el ancho a dos. Dibuja una línea a lo ancho de un fagosoma y luego haz clic derecho para medir el pH.

El pH citoplasmático se puede medir de la misma manera dibujando una línea a través del citoplasma. Después de terminar las mediciones, haga clic con el botón derecho para elegir Guardar archivo. Para medir el área del fagosoma, use el cuarto icono a lo largo de la barra de herramientas para dibujar a mano alzada alrededor del área.

Posteriormente, haga clic con el botón derecho para seleccionar Medir área. Aquí hay una clave visual cualitativa del color aproximado de los fagosomas teñidos con S-1 correspondiente al pH. El color amarillo indica más acidez, mientras que el rojo indica más alcalinidad.

Esta imagen muestra neutrófilos de médula ósea unidos a ratones que carecen del canal Hvcn1 20 minutos después de la fagocitosis. Los fagosomas aparecen muy rojos, alcalinos e hinchados. La flecha roja aquí apunta a una Candida intracelular, mientras que esta flecha apunta a una Candida extracelular.

Esta imagen muestra neutrófilos de médula ósea de ratón de tipo salvaje que han ingerido Candida. Son mucho menos alcalinos que los neutrófilos knockout Hvcn1. Esta imagen muestra neutrófilos de sangre periférica humana en el mismo momento después de la fagocitosis.

Parecen ligeramente más alcalinas que las células de ratón de tipo salvaje, pero los fagosomas aún no son tan grandes y rojos como las células knockout de Hvcn1, y esta imagen muestra neutrófilos humanos que han fagocitado Candida en presencia de cinco micromolares de difenileno yodoio. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cuatro o cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que hay que tener cuidado al aislar los neutrófilos para que no se activen.

Con el fin de determinar si los efectos que se observan en los cambios en el pH vacuolar o citosólico o en el volumen vacuolar se deben a cambios en el estallido respiratorio, entonces este estallido respiratorio se puede medir de otras maneras que miden directamente la producción de radicales libres o el consumo de oxígeno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neutrófilos humanos y luego teñir y obtener imágenes del fagosoma y el citoplasma. No olvide que trabajar con muestras de sangre humana puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y ropa protectora al realizar este procedimiento.