Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

El objetivo general de esta técnica de microscopía confocal es obtener imágenes del pH y del área de la vacuola fagocítica del neutrófilo y del citoplasma. Este método permite el monitoreo y la cuantificación de los cambios dinámicos en el pH dentro de la vacuola fagocítica y del citoplasma, así como también del volumen de la vacuola fagocítica. Estas mediciones varían según la actividad de la NADPH oxidasa y pueden utilizarse como marcadores sustitutos de su función y de los flujos iónicos a través de la membrana de la vacuola fagocítica.

La principal ventaja de esta técnica es que tanto el fagosoma como el citoplasma pueden visualizarse simultáneamente con un colorante que tiene un amplio rango de pH. Para comenzar este procedimiento, prepare una alícuota de carboxy-S-1 succinimidil éster diluyendo 50 microgramos de este en 100 microlitros de DMSO de alta pureza. Agite bien mediante vortex para mezclar.

A continuación, prepare un mililitro de Candida muerta por calor o HK a una concentración de una vez 10 a la octava en bicarbonato de sodio 0,1 molar en un tubo de 15 mililitros. Añada 100 microlitros de carboxi-S-1, una gota a la vez, a la Candida HK mientras mezcla en un vórtex a 2.000 RPM. Después, envuelva el tubo con papel de aluminio y colóquelo en un rodillo a temperatura ambiente durante una hora.

Después de una hora, lave las HKC-S-1 tres veces mediante centrifugación a 2.250 ×g durante 10 minutos cada vez. Para los dos primeros lavados, re-suspenda el precipitado en 15 mililitros de bicarbonato de sodio 0,1 molar. Después del tercer lavado, re-suspenda el precipitado en un mililitro de tampón BSS.

Transfiera la suspensión de HKC-S-1 a los tubos en alícuotas de 100 microlitros y almacénelos a menos 20 grados Celsius. Para opsonizar HKC-S-1 para neutrófilos humanos, agregue 100 microlitros de suero humano IGG a 100 microlitros de HKC-S-1 descongelado. Mezcle en un agitador térmico a 37 grados Celsius y 1.1000 RPM durante 60 a 90 minutos, y luego en un rotaforo, a cuatro grados Celsius durante dos horas.

Después de eso, lave la muestra tres veces en tampón BSS mediante centrifugación a 17.000 × g durante un minuto cada vez. Posteriormente, re-suspenda la muestra en 100 microlitros de tampón BSS. Para neutrófilos periféricos humanos, obtenga 15 mililitros de sangre mediante punción venosa de un donante sano y transfiérala a una jeringa de 20 mililitros que contenga 90 microlitros de solución de heparina sódica a 1.000 UI por mililitro.

Utilizando una punta de pipeta, inyecte 1,5 mililitros de solución de dextrano al 10 % en la jeringa. Inviértala suavemente tres veces y luego déjela en posición vertical sobre la bancada durante 30 a 60 minutos. Después de 30 a 60 minutos, la sangre debería separarse aproximadamente por la mitad, con una capa superior de color amarillo pálido (capa de buffy coat) y una capa inferior que contiene eritrocitos.

Empuje cuidadosamente la capa superior a través de una aguja o retírela con la punta de una pipeta, luego transfiérala a un tubo de 15 mililitros y evite extraer la capa roja. Utilizando una pipeta de cinco mililitros, agregue de tres a cuatro mililitros de medio de gradiente de densidad en la parte inferior del tubo, debajo de la capa de capa leucocitaria, para obtener dos capas distintas. Posteriormente, centrifugue la muestra a 900 ×g durante 10 minutos.

Vierta el sobrenadante y deje atrás el precipitado rojo. A continuación, agite suavemente con vórtex para deshacer el precipitado. Después, añada siete mililitros de agua destilada autoclavada al precipitado e invierta la mezcla durante 20 segundos para resuspender el precipitado.

A continuación, agregue siete mililitros de solución salina 2x e invierta varias veces para mezclar, lisando así los glóbulos rojos restantes; luego, centrifugue la muestra a 300 × g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y re-suspenda el sedimento en tampón BSS hasta aproximadamente cuatro veces 10 a la sexta por mililitro. En este procedimiento, pretrate una placa de microscopía de ocho pocillos con 200 microlitros de poli-L-lisina en cada pocillo durante 40 a 60 minutos a temperatura ambiente, luego retire la poli-L-lisina y lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de agua destilada.

A continuación, agregue 200 microlitros de la suspensión celular preparada a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Después, prepare una alícuota de éster S-1-AM agregando 100 microlitros de DMSO de alta pureza a un tubo y mezcle mediante vortex. En un tubo pequeño, agregue 1,7 mililitros de tampón BSS y 20 microlitros de S-1-AM y mezcle la solución mediante vortex.

Posteriormente, lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de tampón BSS y reemplace el tampón con la solución S-1-AM. Tenga cuidado de no perturbar la monocapa celular adherida al fondo del pocillo, pipeteando suavemente el líquido por la pared de los pocillos. A continuación, incube la muestra a temperatura ambiente durante al menos 25 minutos.

A continuación, lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de tampón BSS. Para probar un inhibidor, prepare una mezcla maestra del fármaco adecuado en tampón BSS y lave los pocillos dos veces con esta mezcla. A continuación, someta el HKC-S-1 opsonizado a sonicación durante aproximadamente tres segundos a cinco micrones y añada 10 microlitros del mismo a cada pocillo; luego incube la placa a 37 grados Celsius durante 15 a 20 minutos, preparando así las células para ser observadas mediante imágenes que muestren instantáneas de la fagocitosis.

Utilizando un microscopio confocal, ajuste la longitud de onda del láser de modo que las células se exciten a 555 nanómetros y la emisión se detecte mediante dos detectores entre 560 y 600 nanómetros, y por encima de 610 nanómetros. A continuación, observe las células utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63X. Utilice una imagen de escaneo de mosaico en modo continuo para visualizar el mosaico central.

Utilizando la intensidad de fluorescencia y la ganancia de los canales del detector, ajuste el enfoque y la intensidad del láser y la ganancia de los dos canales para optimizar la imagen. Después, divida la imagen utilizando los ajustes para ver ambos canales. Antes de comenzar el experimento, verifique que no haya saturación de la intensidad de fluorescencia en el citoplasma o en las vacuolas, lo cual aparecería como puntos rojos.

Si es así, reduzca la intensidad del láser de manera que haya un número mínimo de puntos rojos, pero que las células y los fagocitos sean lo suficientemente brillantes y nítidos como para verlos. En este procedimiento, abra ImageJ y cargue el archivo de imagen seleccionado para el análisis en la barra de herramientas. Para combinar los dos canales, utilice Imagen, Color y luego Hacer Compuesta.

Haga clic con el botón derecho para seleccionar un archivo donde almacenar los resultados. A continuación, haga clic en la herramienta de línea en la barra de herramientas y haga doble clic para aumentar el ancho a dos. Trace una línea a través del ancho de un fagosome y luego haga clic con el botón derecho para medir el pH.

El pH citoplasmático se puede medir de la misma manera trazando una línea a través del citoplasma. Después de finalizar las mediciones, haga clic derecho para seleccionar Guardar archivo. Para medir el área del fagosoma, utilice el cuarto icono de la barra de herramientas para dibujar a mano alzada alrededor del área.

Posteriormente, haga clic derecho para seleccionar Medir área. A continuación se muestra una clave visual cualitativa del color aproximado de los fagosomeas teñidos con S-1 que corresponden al pH. El color amarillo indica mayor acidez, mientras que el rojo indica mayor alcalinidad.

Esta imagen muestra neutrófilos de médula ósea en ratones que carecen del canal Hvcn1, 20 minutos después de la fagocitosis. Los fagosomas aparecen muy rojos, alcalinos e hinchados. La flecha roja señala aquí una Candida intracelular, mientras que esta flecha señala una Candida extracelular.

Esta imagen muestra neutrófilos de médula ósea de ratón de tipo silvestre que han ingerido Candida. Son mucho menos alcalinos que los neutrófilos de ratón con deleción de Hvcn1. Esta imagen muestra neutrófilos de sangre periférica humana en el mismo punto temporal después de la fagocitosis.

Ellas parecen ligeramente más alcalinas que las células de tipo silvestre de ratón, pero los fagocitos aún no son tan grandes ni rojos como las células con eliminación de Hvcn1, y esta imagen muestra neutrófilos humanos que han fagocitado Candida en presencia de cinco micromoles por litro de yoduro de difenileno. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente de cuatro a cinco horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado al aislar los neutrófilos para que no se activen.

Con el fin de determinar si los efectos que se observan en los cambios del pH vacuolar o citosólico o en el volumen vacuolar se deben a alteraciones en el estallido respiratorio, entonces este estallido respiratorio puede medirse mediante otros métodos que midan directamente la producción de radicales libres o el consumo de oxígeno. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neutrófilos humanos, teñirlos e imaginar el fagosoma y el citoplasma. No olvide que trabajar con muestras de sangre humana puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y ropa protectora al realizar este procedimiento.