Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

El siguiente protocolo tiene como objetivo mostrar el aislamiento de astrocitos primarios de cerebros de ratas cachorros para realizar la privación de oxígeno y glucosa o OGD. La exposición de astrocitos purificados, a un ambiente privado de oxígeno y glucosa es un módulo que nos permite probar la reacción a algunas de las condiciones que se encuentran en los accidentes cerebrovasculares isquémicos. Los cambios metódicos, después de la exposición a la privación de glucosa en oxígeno, se pueden observar y medir utilizando marcadores selectivos de astrocitos como GFAP.

En resumen, estas células aisladas expuestas a condiciones similares a la isquémica se pueden utilizar para probar nuevas partes activadas en condiciones hipóxicas y otros fármacos que protegen contra el accidente cerebrovascular isquémico. En esta parte del protocolo se aislarán astrocitos de cortezas de ratas cachorros. El propósito de este procedimiento es obtener un cultivo primario de células astrocíticas para realizar experimentos de privación de oxígeno y glucosa.

Los materiales para este procedimiento son los siguientes, Esterilizar en autoclave todos los materiales antes de utilizarlos en este procedimiento. Y exponga la capucha a al menos 20 minutos de luces ultravioleta antes de comenzar el protocolo. Para comenzar este procedimiento, pipetee de tres a cinco mililitros de medio DME completo en cada placa.

Se dividirá de la siguiente manera, uno para cada cerebro de ratón, dos para todas las cortezas y tres para todas las cortezas sin las meninges. Decapitar a un cachorro después de desinfectarlo con etanol al 70%. Haga una incisión desde la parte posterior de la cabeza hacia la nariz.

Retire el cráneo con una pinza curvada y raspe suavemente el cerebelo, exponiendo las cortezas. Retire los cerebros expuestos con un par de pinzas y coloque el cerebro en la primera placa de Petri con medios. Repite estos pasos para todos los demás cachorros.

Separe los hemisferios cerebrales dividiéndolos suavemente a lo largo de la fisura de la línea media con el extremo afilado de las pinzas de microdisección. Pelar las cortezas retirando la sustancia blanca y el hipocampo con las pinzas con un movimiento de pellizco, dejándolas atrás. Transfiera las cortezas de la cáscara a la placa de Petri etiquetada como número dos.

Repita el procedimiento para todos los cerebros combinando todas las cortezas disecadas en la placa de Petri. Agite suavemente el plato para distribuir uniformemente los medios entre todas las cortezas. Utilice el microscopio de disección para identificar las meninges que recubren las cortezas peladas.

Las meninges son una capa transparente muy delgada que se puede identificar buscando los pequeños capilares rojos que rodean el tejido. Inspeccione y retire cuidadosamente las meninges que recubren las cortezas y quítelas suavemente de los lóbulos corticales individuales con pinzas finas a ambos lados de cada corteza. Coloque las cortezas limpias en una nueva placa de Petri etiquetada como número tres.

Para la disociación de tejidos con el método estomacal o de licuadora, vierta las cortezas limpias y peladas y los medios de la placa de Petri en una bolsa de licuadora estéril. Y agregue suficiente medio para llevar el volumen total de la bolsa a cinco mililitros. Coloque la bolsa en el estómago 80 dejando aproximadamente dos centímetros de la bolsa visibles por encima de la puerta cerrada.

La disociación celular en este instrumento se realiza después de 2,5 minutos a alta velocidad. Alternativamente, la disociación del tejido se puede realizar cerrando la bolsa estéril y golpeando suavemente el tejido con un vaso de precipitados en la campana hasta que las partículas de tejido se hayan convertido en una suspensión fina. Asegúrese de usar un paño entre la bolsa y el vaso de precipitados para evitar fricciones y romper la bolsa.

Vierta la suspensión de celdas en el centro de la manga con un número de malla 60. Vierta las celdas filtradas en el medio de una malla número 100, lo que le permite filtrar por gravedad. Vierta la suspensión celular filtrada en un tubo cónico de 15 mililitros.

Espolear en el centro la suspensión de la celda a 200 veces G en una espoleta central, preferiblemente con una fresadora de cubeta oscilante durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y deséchelo en un vaso de precipitados. Agregue medios nuevos completos a la paleta de celdas.

Con una pipeta serológica, resuspender y disociar la paleta de células en un máximo de cinco mililitros de medio. Agregue la cantidad deseada de suspensión celular en un matraz y complete con medios. Agregue la paleta resuspendida en el matraz con medio.

Distribuya las células uniformemente por todo el matraz y colóquelas en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Recuerde cambiar los medios cada tres días. La siguiente metodología está destinada a privar a las células de oxígeno y glucosa en un ambiente controlado.

El propósito de este modelo es estudiar la respuesta de los astrocitos en una condición de accidente cerebrovascular similar a la isquémica. Los materiales utilizados para este procedimiento son, Purgar el medio libre de glucosa insertando una pipeta serológica conectada al sistema de gas. Burbujee la solución con la mezcla de gases durante 10 minutos a un caudal de 10 a 15 litros por minuto.

Una vez finalizados los 10 minutos, ajuste el pH del medio OGD a 7,4. Filtre el medio sin glucosa purgado utilizando el sistema de filtro de tubo de 50 mililitros. Es importante hacer siempre un medio OGD fresco para cada experimento.

Esto asegurará que el medio se purgue de oxígeno. Retire los medios de astrocitos y lave con PBS celular dos veces para eliminar la glucosa de las células. Agregue el medio OGD a los pocillos.

Coloque el plato de pocillos múltiples con la tapa abierta dentro de la cámara de hipoxia. Conecte la mezcla de gases a la válvula de entrada y deje abierta la válvula de salida. Enjuague la cámara con la mezcla de gases a 10 a 15 litros por minuto, durante cinco a siete minutos.

Detenga el flujo de gas y primero cierre la abrazadera de la válvula de salida. Luego, cierre la abrazadera en el tubo de la válvula de entrada de gas. Coloque la cámara hipóxica en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante el tiempo deseado en OGD.

Una vez finalizado el tiempo de incubación, aspire el medio OGD y agregue con cuidado DMEM completo a las células para la condición normóxica. Regrese las células a la incubadora de cultivo durante cero 24 y 48 horas de condiciones normóxicas. Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos de cortezas de ratas neonatales.

Después de validar la pureza de los cultivos primarios, se realizaron experimentos con OGD. En este modelo de tipo isquémico, la privación de glucosa y oxígeno indujo un cambio más fológico que fue monitoreado por la inmunofluorescencia utilizando marcadores astrocíticos como GFAP o marcadores de proliferación como PCNA. Una de las ventajas de este modelo es que nos permite estudiar la respuesta de un tipo de célula específica.

Aunque la limitación en esta técnica es la falta de interacción célula a célula debido al aislamiento de los astrocitos. Una de las formas posibles de superar esta limitación, es exponer los astrocitos a medios condicionados de otros tipos de células o de un co-cultivo. En resumen, el método de privación de oxígeno y glucosa en un sistema celular aislado, nos permite probar directamente los efectos de diferentes moléculas neuronales protectoras o neurotóxicas.

Además, es una herramienta válida para estudiar la biología de los astrocitos. Por último, este modelo establece una base sólida para estudiar fármacos en desarrollo en condiciones experimentales utilizando modelos in vivo.