Name: Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a capturar proteínas de unión al cap en células humanas bajo hipoxia usando un análogo m7GTP unido a agarosa. Este método identifica factores regulados por oxígeno implicados en la iniciación de la traducción.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y el Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.

1. Preparativos para el cultivo celular <ol><li> Comprar acciones disponibles en el mercado de las células humanas. NOTA: Este protocolo utiliza el carcinoma colorrectal y HCT116 células humanas primarias epiteliales tubulares renales proximales (HRPTEC). </li><li> Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HCT116: de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) media / alta de glucosa suplementado con 7,5% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). </li><li> Hacer 500 ml de medio para el cultivo de HRPTEC: medio celular epitelial suplementado con 5% FBS, 1% de suplemento de crecimiento de células epiteliales, y 1% P / S. </li><li> Preparar 500 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS): NaCl 140 mM, KCl 3 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave durante 40 minutos a 121 ° C. </li></ol> 2. Inicio de cultivo de células <ol><li> aspirar cuidadosamente el medio de un plato confluente 80-90% sin molestar tél células. </li><li> Alícuotas de 3-5 ml de PBS 1x por placa de cultivo, agite con cuidado cada matraz para recubrir la superficie del plato, y con cuidado aspirar el PBS 1x. Repita este procedimiento para un segundo lavado 1x PBS. </li><li> Alícuota 3 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) en cada placa de cultivo y suavemente roca para cubrir uniformemente las células con tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> La transferencia de las células separadas en un tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifuga a 4.000 g durante 90 seg. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de DMEM completo. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro. Calcula cuántos apirógeno y poliestireno de 100 mm de cultivo celular platos se requiere para alcanzar una densidad inicial de siembra de aproximadamente 2.500-5.000 células por cm2. </li><li> Pre-caliente medio de cultivo celular completo realizado en los pasos 1.2 o 1.3 en un baño de agua a 37 ° C durante 30-45 minutos. </li><li> Descontaminar la botella medio y vial de células con 70% de etanol. A partir de este punto en adelante todolas operaciones deben llevarse a cabo de forma aséptica. </li><li> Alícuota de 6 ml de DMEM completo en tantas placas de cultivo celular de 100 mm necesarios para utilizar todo el volumen de las células congeladas dentro de la densidad de siembra mencionado en el paso 2.6. </li><li> Transferir el volumen de suspensión celular calculada en el paso 2.6 para cada una de las placas de 100 mm de cultivo. Roca cada placa manualmente para distribuir uniformemente las células sobre la superficie de la placa. </li><li> Coloque la cabeza de serie placa de cultivo celular 100 mm en la incubadora a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2. Permitir que las células se incuban al menos 24 horas antes de que los próximos pasos. </li></ol> 3. El subcultivo <ol><li> Ver cada placa de cultivo de células bajo un microscopio para determinar el porcentaje de confluencia celular (% de células que cubren el área del plato). Volver a las células de la incubadora y medio completo de pre-calentamiento y 1x PBS. Proceder al siguiente paso si las células son 80-100% de confluencia. </li><li> aspirar con cuidado el medio gastado sin perturbar elcélulas en cada placa de cultivo. </li><li> Alícuotas de 3-5 ml de PBS 1x por placa de cultivo, agite con cuidado cada matraz para recubrir la superficie del plato, y con cuidado aspirar el PBS 1x. Repita este procedimiento para un segundo lavado 1x PBS. </li><li> Alícuota de 3 ml de 0,05% tripsina-EDTA en cada placa de cultivo y cuidado de roca para cubrir uniformemente las células con tripsina-EDTA. Se incuba a 37 ° C durante 2-3 min. </li><li> Durante esta incubación, se requiere alícuota de 10 ml de medio completo en placas de cultivo como muchos para obtener la densidad de células de 2.500-5.000 células por cm 2. </li><li> Cuando las células se han separado de la placa, añadir rápidamente 3 ml de inhibidor de tripsina 1x definido y agitar suavemente el plato para 1 min para asegurar que toda la tripsina-EDTA ha sido neutralizado. </li><li> La transferencia de las células separadas en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y dejar de lado. Añadir 3 ml de 1x PBS al plato para recoger las células restantes, y la transferencia de que para el mismo tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación 150 xgdurante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 3 ml de medio completo. </li><li> Recuento de células utilizando un hemocitómetro y sembrar placas de cultivo de 150 mm que contenían 15 ml de medio completo para obtener una densidad celular de 2.500-5.000 células por cm 2. Use dos de 150 mm para cada ensayo de fijación de límites máximos. NOTA: la difusión de oxígeno a las células a través de medios líquidos depende en el volumen 36. Se recomienda mantener el volumen de los medios de comunicación consistentes entre los experimentos si se utilizan células adherentes o células en suspensión. Los medios pueden ser pre-condicionadas (se incubaron en la estación de trabajo durante 24 horas como se comenta en la discusión) para evitar estas variabilidades en la difusión. </li><li> Colocar las cápsulas cabeza de serie de la cultura en la incubadora a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%. Permitir que las células se incuban al menos 24 horas antes de proceder a los pasos siguientes. </li></ol> 4. La exposición Physioxic <ol><li> Ver las células bajo el microscopio. para best resultados, aseguran que las células son 70-80% de confluencia para una exposición de 24 horas, el 50-60% de confluencia para una exposición de 48 horas, y el 40-50% de confluencia para una exposición de 72 horas. </li><li> Colocar las células en una estación de trabajo hipoxia durante el tiempo deseado (24, 48, o 72 hr dependiendo del experimento). </li><li> Ajuste la estación de trabajo al physioxia apropiado. NOTA: Por ejemplo, un ajuste de 3% de O2 estaría acompañada de 5% de CO2 y 92% de N2. NOTA: Si se desean las fluctuaciones de oxígeno dentro de un rango dinámico más de una línea de tiempo específico, el programa de la programación en el instrumento o ajustar manualmente los ajustes de oxígeno en los intervalos deseados. </li><li> Ajuste la humedad relativa al 60%. La atmósfera de trabajo es muy secas, no obstante, los medios de comunicación y se evapore notablemente durante los experimentos de largo (&gt; 48 h). Mantenga una reserva de medios de comunicación en un frasco de cultivo de células dentro de la estación de trabajo (de modo que los medios de comunicación se equilibra con la atmósfera estación de trabajo) para reponer los medios de comunicación en la dis cultivo celularél es. NOTA: Cualquier solución que interactuar con las células antes de la lisis (por ejemplo, PBS y tripsina-EDTA) se debe preacondicionarse durante 24 h antes de su uso dentro de la estación de trabajo hipoxia de modo que el oxígeno disuelto se equilibra con el oxígeno atmosférico 36. </li><li> Mantener las células dentro de la estación de trabajo hasta que la lisis. </li></ol> 5. Los tampones se preparan para el análisis del cabo de unión <ol><li> Preparar tamponada con Tris 1x solución salina (TBS). <ol><li> En 800 ml de H2O destilada, se disuelven 8,76 g de NaCl y 6,05 g de Tris Base. </li><li> Se lleva la solución a un pH final de 7,4 usando HCl 1 M. </li><li> Llevar el volumen final a 1 L con dH 2 O. </li></ol></li><li> Preparar tampón de lisis no desnaturalizante. Preparar lisis amortiguar el día del ensayo de unión de topes. Hacer buffer de lisis adicional para lavar las perlas de agarosa en blanco y el γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa vinculados-C10 (pasos 7.9 y 7.13). <ol><li> En 7 ml de H2O destilada, añadir 160 l de NaCl 5 Ml, NaF mM 160 l 1 M Tris-HCl pH 7,4, 40 l 200, 40 l 1 M MgCl 2, y ortovanadato de sodio 40 l 1 mM. </li><li> Añadir 40 l de Igepal a la solución de 7 ml. Cortar la punta de la pipeta para ayudar a recuperar Igepal ya que es extremadamente viscoso. </li><li> Mezclar pipeteando arriba y abajo, o vórtice, la solución de 7 ml hasta que todo el Igepal se ha disuelto. </li><li> Elevar el volumen final de la solución a 8 ml y mantener en hielo. </li></ol></li><li> Preparar 4x dodecil sulfato de sodio (SDS) -PAGE tampón de muestra. <ol><li> En un vaso de precipitados, se combinan 16 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 12,64 ml de glicerol, y 8 ml de ditiotreitol (DTT). </li><li> Añadir 3,2 g de SDS y 0,16 g de azul de bromofenol. Permitir que el polvo se disuelva completamente mediante la mezcla con una barra de agitación magnética. </li><li> Alícuota de 1,5 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Lisis Celular <ol><li> Preparar la desnaturalización no tampón de lisis y mantener en hielo el día de THe cap-ensayo de unión. </li><li> 1x PBS pre-calentamiento y tripsina en un baño de agua a 37 ° durante 30 minutos. </li><li> Alícuotas de 980 l de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada ensayo de fijación de límites máximos que se realizan. </li><li> Añadir 10 l de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo fluoruro y 10 l de 100x cóctel inhibidor de proteasa a los 980 l de tampón de lisis. Mantener en hielo. </li><li> Desechar los medios de comunicación de cada plato de 150 mm en un contenedor de residuos dentro de la estación de trabajo de la hipoxia. </li><li> Se lavan las células con 3-4 ml de PBS 1x cálida y desechar todo el líquido. </li><li> Añadir 1 ml de tibia 0,05% de tripsina-EDTA a cada placa y dejar reposar durante 2 minutos o hasta que las células ya no se adhieren a la placa. </li><li> Con una pipeta, transferir las células de una placa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita según sea necesario de manera que cada placa de células se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado. </li><li> Centrifugar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a 6.000 xg durante 90 seg to sedimentar las células. </li><li> Aspirar el tripsina usando una pipeta sin perturbar el sedimento. Si el sedimento es perturbado, volver a centrifugar el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 6000 xg durante 90 seg. </li><li> Se lavan las células con PBS 1x caliente suavemente pipeteando 200 l de PBS en el tubo justo por encima de la pastilla. Re-centrifugadora si se altera el sedimento. </li><li> Aspirar el PBS sin perturbar el sedimento. </li><li> Pipeta 500 l de 1 ml de solución tampón de lisis preparados en el primer precipitado celular. Resuspender el precipitado en su totalidad por pipeteando arriba y abajo. </li><li> Se combinan las células resuspendidas con el segundo sedimento celular y resuspender el segundo precipitado pipeteando arriba y abajo. Repita este proceso hasta que todos los gránulos se han combinado y se resuspendieron para cada muestra. </li><li> Combinar el lisado con los restantes 500 l de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Extraer muestras de la estación de trabajo de la hipoxia. NOTA: Después de la adición de tampón de lisis, unaetapas posteriores ll se han de realizar en el aire ambiente como la estación de trabajo hipoxia se establece en 37 ° C y los pasos siguientes se van a realizar en frío (4 ° C o en hielo). </li><li> Lisar las células utilizando agitación suave mediante la rotación de las muestras a 4 ° C durante 1,5-2 horas. </li><li> Centrifugar las células lisadas a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares. </li><li> Transferir el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar el sedimento. </li><li> Reservar una parte (5 a 10%) del sobrenadante a ser utilizado como todo un control de entrada de lisado de células para el futuro análisis de transferencia Western. </li></ol> 7. Ensayo de unión a Cap- <ol><li> Para cada muestra, la transferencia de 50 l de la suspensión de control de cuentas de agarosa en blanco y 50 l de la suspensión de perlas vinculado-C10 γ-aminofenil-m 7 GTP de agarosa para separar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga. Con unas tijeras para retirar la punta de la pipeta para facilitar la recogida de la suspensión de perlas. </li><li> Se precipitan los talones By centrifugación de la suspensión a 500 x g durante 30 seg. </li><li> Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y volver a suspender las perlas en 500 l de TBS. </li><li> Repita los pasos 7.2 y 7.3. Sedimentar las perlas a 500 xg durante 30 segundos y retirar el sobrenadante. </li><li> Transferir el sobrenadante que contiene el lisado de la etapa 6.19 al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las perlas de agarosa en blanco. NOTA: Las perlas de agarosa en blanco actúan como una etapa de pre-compensación para eliminar las proteínas del lisado que interactúan de forma no específica con la perla. </li><li> Incubar durante 10 min a 4 ° C con agitación suave. </li><li> Sedimentar las perlas de agarosa en blanco por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir el lisado al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10-linked. </li><li> Se lavan las perlas de agarosa en blanco resuspendiendo las perlas en 500 l de tampón de lisis, la granulación las perlas por centrifugación a 500 xg durante 30 seg, y descartar el supernatante. Repita esto cuatro veces para un total de cinco lavados. </li><li> Volver a suspender las perlas de agarosa en blanco en tampón de muestra 1x SDS-PAGE, y hervir los granos por 90 segundos a 95 ° C. Almacenar a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot para observar si la proteína de interés se une de forma no específica a la perla. </li><li> Incubar el lisado con las perlas de enlaces-C10 γ-aminofenil-m 7 GTP de agarosa con agitación suave durante 1 hora a 4 ° C para capturar proteínas de unión a la tapa. </li><li> Sedimentar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. Descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado repitiendo el paso 7.9. </li><li> Volver a suspender las perlas en 600 l de tampón de lisis. </li><li> Añadir GTP a una concentración final de 1 mM. </li><li> Se incuban las γ-amino-fenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado + 1 mM de GTP con agitación suave durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Estese disociar las proteínas que interactúan de forma no específica con m 7 GTP (es decir, también interactuar con GTP no metilado). </li><li> Sedimentar las γ-aminofenil-m 7 GTP perlas de agarosa C10 ligado por centrifugación a 500 xg durante 30 seg. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 200 l de tampón de muestra 4x SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol). Almacenar la muestra de control de GTP a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot 37. Lavar las perlas repitiendo el paso 7.9. </li><li> Resuspender las perlas en tampón 1x de muestra de SDS-PAGE (50 mM Tris-HCl, 100 mM de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol), y hierven a 95 ° C durante 90 seg. Almacenar la fracción m 7 GTP a -20 ° C para el futuro análisis de Western blot 37. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El análisis de proteínas de unión a la tapa-en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas pueden permitir la identificación de nuevos factores de iniciación de traducción regulada de oxígeno. La afinidad de estos factores para la tapa 5 &#39;del mRNA u otras proteínas de tapa asociada se puede medir por la fuerza de su asociación a la m 7 GTP ligada perlas de agarosa. Una advertencia de esta técnica es que mide el potencial de unión de topes de proteínas post-lisis, pero se realiza en con...

Control de la traducción está emergiendo como un paso igualmente importante para la regulación transcripcional de la expresión génica, especialmente durante los períodos de estrés celular 1. Un punto central de control de la traducción está en la etapa limitante de la velocidad de iniciación, donde los primeros pasos de la síntesis de proteínas implican la unión del factor de iniciación eucariota 4E (eIF4E) a la 7-metilguanosina (m 7 GTP) 5 &#39;cap de mRNAs 2 . eIF4E es parte de un complejo trimérico llamado eIF4F que incluye eIF4A, una helicasa de ARN, y eIF4G, una proteína de andamiaje necesario para la contratación de otros factores de traducción y los ribosomas 40S 3. En condiciones fisiológicas normales, la gran mayoría de los ARNm se traducen a través de un mecanismo dependiente de la cubierta, pero en períodos de estrés celular aproximadamente el 10% de los ARNm humanos contiene 5 &#39;UTRs que podrían permitir la traducción independiente de caperuza intiation 1,4. traducción dependiente de la cubierta ha sido históricamente sinónimoous con eIF4F, sin embargo, las variaciones de tensión específica de eIF4F se han convertido en un tema de tendencia 5-8. Diversos estreses celulares causan actividad de eIF4E a ser reprimida a través del objetivo de mamíferos de la rapamicina complejo 1 (mTORC1). Esta quinasa se deteriora bajo tensión, lo que resulta en el aumento de la actividad de uno de sus objetivos, la proteína de unión a 4E (4E-BP). No fosforilada 4E-BP se une a eIF4E y bloquea su capacidad para interactuar con eIF4G haciendo que la represión de la traducción dependiente de cap-9,10. Curiosamente, un homólogo de eIF4E llamado eIF4E2 (o 4EHP) tiene una afinidad mucho menor para 4E-BP 11, tal vez lo que le permite evadir la represión mediada por el estrés. De hecho, caracterizada inicialmente como un represor de la traducción debido a su falta de interacción con eIF4G 12, eIF4E2 inicia la traducción de centenares de ARNm que contienen elementos de respuesta a la hipoxia de ARN en su 3 &#39;UTR durante el estrés hipóxico 6,13. Esta i activacións logrado a través de interacciones con proteínas motivo 4, y el factor inducible por hipoxia (HIF) 2α eIF4G3, ARN de unión para constituir un complejo eIF4F hipóxica, o eIF4F H 6,13. Como un represor en condiciones normales, eIF4E2 une con GIGYF2 y ZNF598 14. Estos complejos fueron, en parte, identificados a través de 7 m resinas de afinidad GTP vinculados-agarosa. Este método clásico 15 es estándar en el campo de la traducción y los ensayos es mejor y más comúnmente utilizado la técnica para aislar los complejos de unión de capuchón en la tracción y la unión in vitro 16-19. A medida que la maquinaria de traducción dependiente de la cubierta está emergiendo como flexible y adaptable con las piezas de cambio inter 6-8,13, este método es una herramienta poderosa para identificar rápidamente nuevas proteínas de unión con forma de capuchones que intervienen en la respuesta al estrés. Por otra parte, las variaciones en eIF4F podría tener amplias implicaciones como varios sistemas modelo eucariotas parecen usar un homólogo de eIF4E2 de las respuestas de estrés talescomo A. thaliana 20, S. pombe 21, 22 D. melanogaster y C. elegans 23. La evidencia sugiere que las variaciones en eIF4F no pueden limitarse estrictamente a condiciones de estrés, pero estar implicados en la fisiología normal 24. El suministro de oxígeno a los tejidos en los extremos (capilares) o dentro de los tejidos (medido a través de microelectrodos) varía desde 2 hasta 6% en el cerebro 25, 3-12% en los pulmones 26, 3,5 a 6% en el intestino 27, 4% en el hígado 28, 7-12% en el riñón 29, 4% en el músculo 30, y 6-7% en la médula ósea 31. Las células y las mitocondrias contienen menos de 1,3% de oxígeno 32. Estos valores son mucho más cerca de la hipoxia que el aire ambiente donde las células son cultivadas de forma rutinaria. Esto sugiere que lo que se pensaba anteriormente de procesos celulares como la hipoxia-específicos pueden ser relevantes en un entorno fisiológico. Curiosamente, eIF4F y eIF4F H </sup&gt; participar activamente en la iniciación de la traducción de piscinas o clases de ARNm distintos en varios diferentes líneas celulares humanas expuestas al oxígeno fisiológica o &quot;physioxia&quot; 24. Bajos niveles de oxígeno también impulsa el correcto desarrollo fetal y 33 células por lo general tienen mayores tasas de proliferación, mayor esperanza de vida, menos daño en el ADN y las respuestas al estrés en general menos de 34 physioxia. Por lo tanto, eIF4F H es probablemente un factor clave en la expresión de genes de selección en condiciones fisiológicas. A continuación, ofrecemos un protocolo para cultivar células en condiciones fijas de oxígeno fisiológicas o en un rango de fluctuación dinámica que es probable que sea más representativo de los microambientes de tejido. Una ventaja de este método es que las células se lisan dentro de la estación de trabajo de la hipoxia. No es a menudo claro cómo se lleva a cabo la transición del cultivo de células hipóxicas a la lisis celular en otros protocolos. Las células se quitan a menudo por primera vez de una pequeña incubadora hipoxia serlisis de proa, pero esta exposición al oxígeno podría afectar a las vías bioquímicas como la respuesta celular al oxígeno es rápida (una o dos min) 35. Ciertas proteínas de unión con forma de capuchones requieren la interacción con una segunda base o pueden hidrolizar el GTP m 7, por lo tanto, algunos interactores cap pueden pasarse por alto en el proceso de purificación. Agarosa ligada a los análogos de tapa enzimáticamente resistentes puede sustituirse en este protocolo. La exploración de la actividad y la composición de eIF4F H y otras variaciones de eIF4F a través del método descrito aquí arrojará luz sobre los genes de expresión intrincados mecanismos que utilizan las células en condiciones fisiológicas o las respuestas al estrés.

<table><tbody><tr><td>&gamma;-aminofenil-m7GTP agarosa C10 perlas enlazadas</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarosa ligada a la <>7GTP</td></tr><tr><td>Placa de cultivo</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10 cm placa de cultivo de 150</td></tr><tr><td>mm</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>plato de cultivo de 15 cm</td></tr><tr><td>AEBSF Clorhidrato ACROS</td><td> Orgánicos</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agarose Beads</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Control de perlas de agarosa</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>Componente del tampón de carga SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de centrífuga</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Se utiliza para centrifugar pequeños volúmenes</td></tr><tr><td>15 ml Tubos de centrífuga cónicos Fisher</td><td></td><td>1495970C</td><td>Se utiliza en el cultivo de células primarias</td></tr><tr><td>Definido Inhibidor de tripsina</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr> Medio <tr><td>celular epitelial (kit completo)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Incluye suplementos de suero y factor de crecimiento)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Componente del tampón de carga SDS-PAGE</td></tr><tr><td>100 mM Guanosina 5'-trifosfato, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 carcinoma colorrectal</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>Línea celular de cáncer humano</td></tr><tr><td>Células epiteliales tubulares proximales renales humanas</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/Alta glucosa</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Medios estándar para el cultivo de células humanas</td></tr><tr><td>Solución de hipoclona penicilina-estreptomicina</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>Componente antibiótico de DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Estación de trabajo de hipoxia</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biomedicals</td><td>2198596</td><td>Componente detergente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>Fosfato monopotásico</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4Cloruro de</td></tr> <tr><td>potasio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (componente inhibidor de la fosfatasa del tampón de lisis)</td></tr><tr><td>Fosfato disódico</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Premium Grade Fetal Bovine</td><td>Serum Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa (100x)</td><td>Señalización celular</td><td>58715</td><td>Componente del tampón de lisis</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Componente de tampones</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Tripsina utilizada para separar las células adherentes</td></tr></tbody></table>

análisis de proteínas cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

El control traslacional es un punto focal de la regulación génica, especialmente durante los períodos de estrés celular. La traducción dependiente de la tapa a través del complejo eIF4F es, con mucho, la vía más común para iniciar la síntesis de proteínas en las células eucariotas, pero ahora están surgiendo variaciones específicas de estrés de este complejo. La purificación de proteínas de unión a la tapa con una resina de afinidad compuesta por m7GTP unido a agarosa (un análogo de la tapa del ARNm 5') es una herramienta útil para identificar los factores implicados en la regulación del inicio de la traducción. La hipoxia (bajo nivel de oxígeno) es un estrés celular que se produce durante el desarrollo fetal y la progresión tumoral, y depende en gran medida de la regulación de la traducción. Además, recientemente se informó que los órganos humanos adultos tienen un contenido de oxígeno más bajo (fisioxia 1-9% de oxígeno) que está más cerca de la hipoxia que el aire ambiente donde las células se cultivan de forma rutinaria. Con la caracterización en curso de un complejo eIF4F hipóxico (eIF4FH), existe un interés creciente en comprender el inicio de la traducción dependiente del oxígeno a través de la tapa de ARNm 5'. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo de células humanas para analizar proteínas de unión a la tapa que están reguladas por la disponibilidad de oxígeno. Este protocolo enfatiza que el cultivo celular y la lisis se realicen en una estación de trabajo de hipoxia para eliminar la exposición al oxígeno. Las células deben incubarse durante al menos 24 horas para que los medios líquidos se equilibren con la atmósfera dentro de la estación de trabajo. Para evitar esta limitación, se pueden agregar medios preacondicionados (desoxigenados) a las celdas si se requieren puntos de tiempo más cortos. Ciertas proteínas de unión a la tapa requieren interacciones con una segunda base o pueden hidrolizar el GTP m7, por lo tanto, es posible que algunos interactores de la tapa se pierdan en el proceso de purificación. La agarosa unida a análogos de sombreros enzimáticamente resistentes puede sustituirse en este protocolo. Este método permite al usuario identificar nuevos factores de traducción regulados por oxígeno implicados en la traducción dependiente de la tapa.

Análisis de Capacidad del casquillo de unión en respuesta al oxígeno de eIF4E y eIF4E2 en un m 7 GTP columna de afinidad Las figuras 1 y 2 representan transferencias Western de m 7 GTP afinidad purificación típica de las dos principales proteínas de unión del casquillo en respuesta a las fluctuaciones de oxígeno en dos líneas celulares humanas: células primarias humanas rena...

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células humanas para analizar los factores de iniciación de la traducción que se unen a la tapa 5' del ARNm durante las condiciones fisiológicas de oxígeno. Este método utiliza un análogo de tapa m7GTP ligado a agarosa y es adecuado para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan.

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

El objetivo general de este experimento es capturar proteínas de unión a la tapa en condiciones de bajo oxígeno. Este método utiliza un análogo de siete tapas de metil-guanosina unido a agarosa para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la síntesis de proteínas, como la identificación de nuevos factores regulados por el oxígeno implicados en la traducción dependiente de la tapa.La principal ventaja de esta técnica es que las células se mantienen en una estación de trabajo de hipoxia hasta el punto de lisis. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer porque las células cancerosas dentro de un tumor están expuestas a niveles muy bajos de oxígeno y el control traslacional juega un papel clave en la progresión del tumor. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos una publicación reciente de los colegas de Corona que informaba de que la oxigenación de los tejidos está más cerca de lo que llamamos hipoxia que de la normaxia en la que se cultivan las células de forma rutinaria.Comience este procedimiento con el cultivo celular como se describe en el protocolo de texto. Después de contar las células con un hemocitómetro, alimente placas cultivadas de 150 milímetros que contengan 15 mililitros de medio completo para obtener una densidad celular de 2500 a 5000 células por centímetro cuadrado. Utilice dos platos de 150 milímetros para cada ensayo de unión de tapones.Coloque las placas de cultivo sembrado en la incubadora a 37 grados centígrados y una atmósfera de dióxido de carbono del cinco por ciento. Después de que las células se hayan incubado al menos 24 horas, colóquelas en una estación de trabajo de hipoxia durante el tiempo deseado. A continuación, ajuste la estación de trabajo a la fisioxia adecuada.Precaliente una solución salina tamponada con fosfato X, o PBS, y tripsina en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Alícuota de 980 microlitros de tampón de lisis en un tubo de centrífuga de 1,5 microlitros para cada ensayo de unión de tapones que se realice. 10 microlitros de cóctel de inhibidores de proteasa 100X y 10 microlitros de hidrocloruro de fluoruro de 4-bencenosulfonilo a los 980 microlitros de tampón de lisis en hielo.Deseche los medios de cada plato de 150 milímetros en un contenedor de residuos dentro de la estación de trabajo de hipoxia. Luego, lave las celdas con tres o cuatro mililitros de un X PBS tibio y deseche el líquido. Agregue un mililitro de 05 por ciento de tripsina EDTA tibia a cada plato y deje reposar los platos durante dos minutos o hasta que las células ya no estén adheridas al plato.Con una pipeta, transfiera las celdas de una placa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Repita según sea necesario para que cada placa de células se transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por separado. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 6000 veces g durante 90 segundos para granular las células.Después de la centrifugación, aspire la tripsina con una pipeta sin alterar el pellet. Lave las celdas con uno caliente X PBS pipeteando suavemente 200 microlitros de PBS en el tubo justo encima del pellet. A continuación, aspire el PBS sin alterar el pellet.A continuación, pipetee 500 microlitros de la solución tampón de lisis preparada de un mililitro en el primer gránulo celular. Vuelva a suspender el pellet por completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Combine las celdas resuspendidas con el gránulo de la segunda celda y vuelva a suspender el segundo pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Repita este proceso hasta que todos los gránulos se hayan combinado y vuelto a suspender para cada muestra. A continuación, combine el lisado con los 500 microlitros restantes de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 litros. Retire las muestras de la estación de trabajo de hipoxia.Lise las células mediante una agitación suave girando las muestras a cuatro grados centígrados durante 1,5 a dos horas. Después de la incubación, centrifugar las células lisadas a 1200 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Transfiera el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y deseche el pellet.Reserve una porción del sobrenadante para utilizarla como control de entrada de lisado de células enteras para el análisis de Western blot. Para prepararse para el ensayo de unión de tapones, utilice unas tijeras para retirar la punta de la pipeta y facilitar la recogida de la suspensión de perlas. Para cada muestra, transfiera 50 microlitros de la suspensión de control de perlas de agarosa en blanco y 50 microlitros de la suspensión de perlas enlazadas con agarosa M7GTP C10 a tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros.A continuación, granule las perlas centrifugando la lechada a 500 veces g durante 30 segundos. Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender las perlas en 500 microlitros de TBS. Después de repetir estos pasos, pegue las cuentas a 500 veces g durante 30 segundos y retire el sobrenadante.A continuación, transfiera el sobrenadante que contiene el lisado al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene las perlas de agarosa en blanco. Incubar durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Después de 10 minutos, granule las perlas de agarosa en blanco centrifugando a 500 veces g durante 30 segundos.Después de la centrifugación, transfiera el lisado que no se une a las perlas al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene las perlas enlazadas con agarosa m7GTP C10. Lave las perlas de agarosa en blanco volviendo a suspender las perlas en 500 microlitros de tampón de lisis, peletizando las perlas centrifugando a 500 g de tiempo durante 30 segundos y desechando el sobrenadante. Repita esto cuatro veces para un total de cinco lavados.Vuelva a suspender las perlas de agarosa en blanco en un búfer de muestra X SDS-PAGE. Y hervir las cuentas durante 90 segundos a 95 grados centígrados. Almacene la muestra a 20 grados centígrados para futuros análisis de Western blot para observar el clima en el que la proteína de interés se une de forma no específica a la cuenta.Incubar el lisado con las perlas enlazadas con agarosa C10 m7GTP con una suave agitación durante una hora a cuatro grados centígrados para capturar las proteínas de unión al capuchón. Después de la agitación, granule las perlas enlazadas con agiras M7GTP C10 centrifugando a 500 veces g durante 30 segundos. Después de desechar el sobrenadante, lave las perlas enlazadas con agarosa M7GTP C10 como antes.Vuelva a suspender las perlas en 600 microlitros de tampón de lisis y agregue GTP hasta una concentración final de un milimolar. Incubar las perlas enlazadas con agarosa M7GTP C10 más un GTP milimolar con agitación suave durante una hora a cuatro grados centígrados. Esto disociará las proteínas que interactúan de forma no específica con m7GTP.Granular las perlas m7GTP de agarosa C10 centrifugando a 500 g de tiempo durante 30 segundos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue 200 microlitros de cuatro tampones de muestra X SDS-PAGE. Después de lavar las cuentas como antes, vuelva a suspender las cuentas en un tampón de muestra X SDS-PAGE y hierva a 95 grados centígrados durante 90 segundos.Aquí se muestran Western blots representativos de una purificación típica de afinidad m7GTP de dos proteínas principales de unión a la tapa en respuesta a las fluctuaciones de oxígeno en las células epiteliales primarias del túbulo proximal renal humano. Los lisados celulares se expusieron a un ocho por ciento, cinco por ciento, tres por ciento o uno por ciento de oxígeno durante 24 horas. Los carriles incluyen el 10 por ciento del lisado de toda la célula como entrada, un lavado de GTP para medir la especificidad de m7GTP y las proteínas unidas a las perlas de m7GTP después del lavado de GTP.Los datos de al menos tres experimentos independientes se cuantificaron mediante la Imagen J y se expresaron como unidades de densidad relativa en relación con la entrada del 10 por ciento del lisado de células completas. Los resultados indican que las células humanas cultivadas bajo oxígeno fisiológico utilizan dos proteínas de unión a la tapa para reclutar ARNm distintos para la traducción. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar proteínas de unión a la tapa en condiciones de bajo oxígeno.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en la estación de trabajo de hipoxia hasta el punto de lisis, ya que el oxígeno puede alterar rápidamente las propiedades bioquímicas de estos factores de iniciación de la traducción. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el fraccionamiento de polisomas, para responder a preguntas adicionales, como qué proteínas de unión a la tapa se asocian con la traducción activa en condiciones de bajo oxígeno.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Saponina permeabilized preparación de la fibra junto con el análisis de la fosforilación oxidativa respirométrica proporciona una evaluación integradora de la función mitocondrial. Respiración mitocondrial en los estados fisiológicos y patológicos pueden reflejar diferentes influencias regulatorias, incluidas las interacciones mitocondrial, la morfología y la bioquímica.

Evaluación de respirometría la fosforilación oxidativa en saponina-permeabilized fibras cardíacas

Aquí proponemos métodos sencillos para inducir la hipoxia en cultivos de células y pruebas sencillas para evaluar el estado de hipoxia de los cultivos.

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Fuente:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste video explica cómo se utiliza el flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células de mamíferos vivas y permeabilizadas. Demuestra el uso secuencial de digitonina, sustratos metabólicos, ADP, un desacoplador y un inhibidor para caracterizar diferentes estados respiratorios. El perfil de flujo de oxígeno resultante revela la función mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento...

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Se describe una técnica para el análisis de la síntesis del ARN mundial en la hipoxia utilizando imágenes. Click-química etiquetado de ARN previamente no se ha realizado en condiciones de hipoxia y permite la visualización de los cambios globales en el nivel de ARN de una sola célula. Este enfoque complementa las técnicas de ARN promediados existentes, lo que permite la visualización directa de célula a célula de los cambios en la síntesis de ARN mundial.

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Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

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Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

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Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Este protocolo detalla la síntesis, encapsulación de hemoglobina y PEGilación superficial de nanopartículas jerárquicamente porosas de UiO-66 diseñadas para la entrega de oxígeno. El procedimiento combina ingeniería de defectos con conjugación biortogonal promovida por deformación para generar portadores altamente permeables y fisiológicamente estables, adecuados para aplicaciones biomédicas.

Síntesis, encapsulación de hemoglobina y PEGilación biortogonal en nanopartículas UiO-66 jerárquicamente porosas para aplicaciones de suministro de oxígeno

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Aprende a capturar proteínas de unión al cap en células humanas bajo hipoxia usando un análogo m7GTP unido a agarosa. Este método identifica factores regulados por oxígeno implicados en la iniciación de la traducción.

Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

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