Análisis de proteínas Cap-unión en células humanas expuestas a condiciones de oxígeno fisiológicas

El objetivo general de este experimento es capturar proteínas de unión a la tapa en condiciones de bajo oxígeno. Este método utiliza un análogo de siete tapas de metil-guanosina unido a agarosa para investigar los factores de unión a la tapa y sus socios que interactúan. Este método ayudará a responder preguntas clave en el campo de la síntesis de proteínas, como la identificación de nuevos factores regulados por el oxígeno implicados en la traducción dependiente de la tapa.

La principal ventaja de esta técnica es que las células se mantienen en una estación de trabajo de hipoxia hasta el punto de lisis. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer porque las células cancerosas dentro de un tumor están expuestas a niveles muy bajos de oxígeno y el control traslacional juega un papel clave en la progresión del tumor. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando leímos una publicación reciente de los colegas de Corona que informaba de que la oxigenación de los tejidos está más cerca de lo que llamamos hipoxia que de la normaxia en la que se cultivan las células de forma rutinaria.

Comience este procedimiento con el cultivo celular como se describe en el protocolo de texto. Después de contar las células con un hemocitómetro, alimente placas cultivadas de 150 milímetros que contengan 15 mililitros de medio completo para obtener una densidad celular de 2500 a 5000 células por centímetro cuadrado. Utilice dos platos de 150 milímetros para cada ensayo de unión de tapones.

Coloque las placas de cultivo sembrado en la incubadora a 37 grados centígrados y una atmósfera de dióxido de carbono del cinco por ciento. Después de que las células se hayan incubado al menos 24 horas, colóquelas en una estación de trabajo de hipoxia durante el tiempo deseado. A continuación, ajuste la estación de trabajo a la fisioxia adecuada.

Precaliente una solución salina tamponada con fosfato X, o PBS, y tripsina en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Alícuota de 980 microlitros de tampón de lisis en un tubo de centrífuga de 1,5 microlitros para cada ensayo de unión de tapones que se realice. 10 microlitros de cóctel de inhibidores de proteasa 100X y 10 microlitros de hidrocloruro de fluoruro de 4-bencenosulfonilo a los 980 microlitros de tampón de lisis en hielo.

Deseche los medios de cada plato de 150 milímetros en un contenedor de residuos dentro de la estación de trabajo de hipoxia. Luego, lave las celdas con tres o cuatro mililitros de un X PBS tibio y deseche el líquido. Agregue un mililitro de 05 por ciento de tripsina EDTA tibia a cada plato y deje reposar los platos durante dos minutos o hasta que las células ya no estén adheridas al plato.

Con una pipeta, transfiera las celdas de una placa a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Repita según sea necesario para que cada placa de células se transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por separado. Centrifugar los tubos de microcentrífuga a 6000 veces g durante 90 segundos para granular las células.

Después de la centrifugación, aspire la tripsina con una pipeta sin alterar el pellet. Lave las celdas con uno caliente X PBS pipeteando suavemente 200 microlitros de PBS en el tubo justo encima del pellet. A continuación, aspire el PBS sin alterar el pellet.

A continuación, pipetee 500 microlitros de la solución tampón de lisis preparada de un mililitro en el primer gránulo celular. Vuelva a suspender el pellet por completo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Combine las celdas resuspendidas con el gránulo de la segunda celda y vuelva a suspender el segundo pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Repita este proceso hasta que todos los gránulos se hayan combinado y vuelto a suspender para cada muestra. A continuación, combine el lisado con los 500 microlitros restantes de tampón de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5 litros. Retire las muestras de la estación de trabajo de hipoxia.

Lise las células mediante una agitación suave girando las muestras a cuatro grados centígrados durante 1,5 a dos horas. Después de la incubación, centrifugar las células lisadas a 1200 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los restos celulares. Transfiera el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y deseche el pellet.

Reserve una porción del sobrenadante para utilizarla como control de entrada de lisado de células enteras para el análisis de Western blot. Para prepararse para el ensayo de unión de tapones, utilice unas tijeras para retirar la punta de la pipeta y facilitar la recogida de la suspensión de perlas. Para cada muestra, transfiera 50 microlitros de la suspensión de control de perlas de agarosa en blanco y 50 microlitros de la suspensión de perlas enlazadas con agarosa M7GTP C10 a tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros.

A continuación, granule las perlas centrifugando la lechada a 500 veces g durante 30 segundos. Retire el sobrenadante con cuidado y vuelva a suspender las perlas en 500 microlitros de TBS. Después de repetir estos pasos, pegue las cuentas a 500 veces g durante 30 segundos y retire el sobrenadante.

A continuación, transfiera el sobrenadante que contiene el lisado al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene las perlas de agarosa en blanco. Incubar durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Después de 10 minutos, granule las perlas de agarosa en blanco centrifugando a 500 veces g durante 30 segundos.

Después de la centrifugación, transfiera el lisado que no se une a las perlas al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene las perlas enlazadas con agarosa m7GTP C10. Lave las perlas de agarosa en blanco volviendo a suspender las perlas en 500 microlitros de tampón de lisis, peletizando las perlas centrifugando a 500 g de tiempo durante 30 segundos y desechando el sobrenadante. Repita esto cuatro veces para un total de cinco lavados.

Vuelva a suspender las perlas de agarosa en blanco en un búfer de muestra X SDS-PAGE. Y hervir las cuentas durante 90 segundos a 95 grados centígrados. Almacene la muestra a 20 grados centígrados para futuros análisis de Western blot para observar el clima en el que la proteína de interés se une de forma no específica a la cuenta.

Incubar el lisado con las perlas enlazadas con agarosa C10 m7GTP con una suave agitación durante una hora a cuatro grados centígrados para capturar las proteínas de unión al capuchón. Después de la agitación, granule las perlas enlazadas con agiras M7GTP C10 centrifugando a 500 veces g durante 30 segundos. Después de desechar el sobrenadante, lave las perlas enlazadas con agarosa M7GTP C10 como antes.

Vuelva a suspender las perlas en 600 microlitros de tampón de lisis y agregue GTP hasta una concentración final de un milimolar. Incubar las perlas enlazadas con agarosa M7GTP C10 más un GTP milimolar con agitación suave durante una hora a cuatro grados centígrados. Esto disociará las proteínas que interactúan de forma no específica con m7GTP.

Granular las perlas m7GTP de agarosa C10 centrifugando a 500 g de tiempo durante 30 segundos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue 200 microlitros de cuatro tampones de muestra X SDS-PAGE. Después de lavar las cuentas como antes, vuelva a suspender las cuentas en un tampón de muestra X SDS-PAGE y hierva a 95 grados centígrados durante 90 segundos.

Aquí se muestran Western blots representativos de una purificación típica de afinidad m7GTP de dos proteínas principales de unión a la tapa en respuesta a las fluctuaciones de oxígeno en las células epiteliales primarias del túbulo proximal renal humano. Los lisados celulares se expusieron a un ocho por ciento, cinco por ciento, tres por ciento o uno por ciento de oxígeno durante 24 horas. Los carriles incluyen el 10 por ciento del lisado de toda la célula como entrada, un lavado de GTP para medir la especificidad de m7GTP y las proteínas unidas a las perlas de m7GTP después del lavado de GTP.

Los datos de al menos tres experimentos independientes se cuantificaron mediante la Imagen J y se expresaron como unidades de densidad relativa en relación con la entrada del 10 por ciento del lisado de células completas. Los resultados indican que las células humanas cultivadas bajo oxígeno fisiológico utilizan dos proteínas de unión a la tapa para reclutar ARNm distintos para la traducción. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo capturar proteínas de unión a la tapa en condiciones de bajo oxígeno.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en la estación de trabajo de hipoxia hasta el punto de lisis, ya que el oxígeno puede alterar rápidamente las propiedades bioquímicas de estos factores de iniciación de la traducción. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el fraccionamiento de polisomas, para responder a preguntas adicionales, como qué proteínas de unión a la tapa se asocian con la traducción activa en condiciones de bajo oxígeno.