Carga de un tinte de calcio en las terminaciones nerviosas de las ranas a través del tocón nervioso: Registro de transitorios de calcio en la unión neuromuscular de la rana

Hola, mi nombre es Dimitry Samigullin, trabajo en el laboratorio de Biofísica de los Procesos Sinápticos del Instituto de Bioquímica y Biofísica de Kazán, la Academia Rusa de Ciencias. En nuestro laboratorio estudiamos vastas vías de señalización del calcio en la Unión Neuromuscular. Uno de los métodos más accesibles para medir el nivel sináptico de calcio es un registro óptico.

Aquí describimos el método de carga de un colorante sensible al calcio, a través de un muñón nervioso, en las terminaciones nerviosas de la rana. Además, se presenta el protocolo para medir y analizar un vasto transitorio de calcio en las terminales de las ranas. Con este método es posible estudiar la influencia de los fármacos activos en el nivel presináptico del calcio durante la actividad sináptica.

Preparación de la solución de carga de tinte. El colorante de calcio de Fluorescein Oregon Green BAPTA, viene en 500 microlitros a través de una pequeña cantidad de 500 microgramos de polvo. Agregue 14 microlitros de solución, que contiene HEPES, al polvo.

Solución de carga de vórtice y gire hacia abajo para mezclar completamente. Envuelva el vial con la solución de carga con papel de aluminio, para evitar la exposición a la luz. Almacene la solución de carga a menos 20 grados centígrados, en un congelador.

Procedimiento de carga de tinte. Diseccionar un músculo pectoris cutáneo del animal. Monte el tejido disecado en una placa de Petri forrada de plata.

Estire el pañuelo con alfileres finos de acero inoxidable. Añade la solución de Ringer a la placa de Petri. Con una cuchilla de afeitar, corte un trozo pequeño, alrededor de 2 milímetros del tubo de pipeta de diez microlitros desde el extremo delgado.

Prepare un trozo de plastilina para sujetar la pipeta de llenado en la placa de Petri. Conecte la pipeta de llenado con una jeringa de plástico a través de un tubo de silicona y adaptadores hechos de tubos de pipeta. Retire la solución temporal de Ringer de la placa de Petri con una pipeta de plástico.

Preparación seca con una jeringa. Eso evitará la succión de la solución en la pipeta de llenado. Retire el vial con solución de carga del congelador y deje descongelar a temperatura ambiente en un lugar oscuro.

Con una pinza fina y unas tijeras, bajo control visual, con microscopio estéril, corte el nervio cerca del músculo. Deja alrededor de dos milímetros de muñón nervioso. Fije la pipeta de llenado con un tubo y la jeringa, en la placa de Petri con plastilina.

Acércalo a la rama nerviosa. Aspire suavemente el muñón nervioso en la pipeta de llenado. Retire el tubo de succión del extremo romo de la pipeta de llenado.

Seque el muñón nervioso en la pipeta de llenado junto a la jeringa. Avance la pipeta de llenado con el muñón nervioso. Aísle el muñón del nervio del exterior con vaselina.

Una vez más, seque el muñón nervioso en la pipeta de llenado junto a la jeringa. Extraiga el punto cero de cinco microlitros de solución de carga con una pipeta con una punta de pipeta larga. Inserte suavemente la punta de pipeta con la solución de carga en la pipeta de llenado.

Expulse la mezcla directamente al muñón del nervio. Selle el extremo abierto de la pipeta de llenado con vaselina. Agregue una pequeña cantidad de solución en la placa de Petri.

Incubar la preparación a temperatura ambiente en un lugar oscuro y húmedo durante cinco horas. Después del procedimiento de incubación, tome la preparación y retire la pipeta de llenado con la solución de carga. Coloque la preparación en un baño y lávela con la solución de Ringer.

Mantenga el baño con la preparación durante la noche en un refrigerador a ocho grados centígrados de temperatura. Preparar el tejido para la microscopía. Tome la preparación del baño.

Monte la preparación en una cámara forrada de plata y estire ligeramente el tejido. Enjuague el pañuelo con solución fresca de Ringer. Tome el electrodo de estimulación de succión.

Coloque el electrodo de succión de estimulación en la cámara con su punta cerca del extremo cortado del nervio. Acerque el nervio al electrodo. La construcción del electrodo se describe en el artículo de Khazokoff, un enlace al artículo está en los materiales.

Fije la cámara de preparación en la platina del microscopio. Coloque la sonda de temperatura. Conecte los tubos de entrada en un cable de alimentación para el elemento Peltier en la cámara de preparación.

Coloque el tubo de salida en la cámara de preparación. Encienda una bomba de perfusión. Encienda el término unidad controladora.

Ajuste la temperatura en la unidad controladora para que alcance los 20 grados centígrados. Instale un escudo de protección ultravioleta. Configure la duración del retraso y el período en el estimulador.

Conecte un cable del electrodo de succión con el estimulador. Enciéndelo. Bajo un objetivo de aumento bajo, verifique la contracción muscular activando el estímulo.

Llene el sistema de perfusión con una solución de Ringer con bajo contenido de calcio y alto contenido de magnesio. Ajuste la tasa de perfusión de unos dos mililitros por minuto. Reemplace el objetivo para un aumento de 40 veces.

Encienda la longitud de onda de emisión Polychrome V.Select y la iluminación de modo continuo. Abra el obturador. Con un objetivo de aumento inferior a 40 veces, las iluminaciones en modo de fluorescencia garantizan que los terminales estén cargados.

Encuentra el terminal y concéntrate en él. El nervio cargado y las terminales nerviosas motoras bien cargadas están representadas en la figura. Captura de video con cámara CCD Neuro Red-Short.

Ejecute el software Turbo-SM. Seleccione Cambiar configuración. El número de fotogramas de entrada es 500.

Introduzca el nombre del experimento. La configuración básica es de 1000 fotogramas por segundo. 80 por 80.

Elija un disparador externo. Introduzca el tiempo previo al disparo. Menos diez milisegundos.

Introduzca el número de repeticiones, 20. En el software Polychrome, seleccione el modo de iluminación del disparador externo. Ejecute el software Clampex.

Protocolo de estimulación de carga. El protocolo está disponible para su descarga desde nuestra página de laboratorio en el sitio web de la Universidad Federal de Kazán. Antes de grabar, capture un fotograma oscuro en el software Turbo-SM.

En el cubo trinocular, seleccione los niveles de intercambio de la trayectoria de la luz. 100 por ciento para la cámara. Ejecuta el protocolo de estimulación.

Seleccione la región de interés y verifique la señal. En respuesta a la estimulación nerviosa, registramos el cambio de intensidad de fluorescencia que refleja la entrada de calcio en la terminación nerviosa. Análisis de datos.

En el software Turbo-SM, seleccione archivo. A continuación, seleccione, Promedio de archivos. Seleccione los archivos.

Introduzca el nombre del archivo de promedio y promedie el promedio de ellos. Guarde el archivo promedio como archivo de ajuste. Seleccione, guarde como archivo de ajuste.

Introduzca el nombre del archivo y guárdelo. Ejecute la imagen J y abra los instrumentos a continuación. Análisis, herramientas, Gestor de ROI.

Encuentre el archivo de promedio guardado en formato de ajuste. Arrástralo y suéltalo en la imagen J.Amplíe la ventana para una mejor vista. Seleccione una región rectangular de interés sobre lo que cree que es el fondo.

Agréguelo al administrador de ROI. En el administrador de ROI, seleccione, más. Multimedida. Carga hacia abajo media.

Copiar datos, exportar a Excel. En Excel, use la función promedio para calcular el valor promedio del fondo para una proporción. Sin cerrar Excel, vuelva a la imagen J.Cierre la ventana con el cálculo en segundo plano sin guardar.

Utilice el Administrador de ROI, elimine el dibujo de fondo rectangular. Proceso de instrumento abierto, matemáticas, restar. Ingrese el valor promedio calculado del umbral de Excel y reste el suelo de las pilas.

Seleccione una región rectangular de interés alrededor de una terminal nerviosa. Añádelo al Administrador de ROI. En el Administrador de ROI, seleccione, más, Multimedida, Carga hacia abajo, Medio.

Copiar y pegar en la ventana de Excel. Utilice el gráfico de trazado de instrumentos de Excel. Seleccione un área plana antes de iniciar la señal.

Cargue el gráfico con los detalles desde los primeros valores de fluorescencia en el resto, hasta el inicio de la señal. A continuación, determine el número de puntos para promediar los valores de fluorescencia en reposo. Promedie estos valores, luego encuentre el número promedio de la fluorescencia en el resto.

Divida las señales por fluorescencia en el resto, reste uno y multiplíquelo por 100 por ciento. Traza la señal y calcula la amplitud del transitorio de calcio.

Los parámetros de tiempo de las señales de fluorescencia dependen de la velocidad de las reacciones de avance y/o retroceso de la formación de complejos de colorante de calcio. El tiempo de aumento de la señal de calcio representa la dinámica de la entrada de calcio. Es la difusión en el terminal y la interacción del calcio con el colorante.

La descomposición del calcio transitorio depende de la afinidad del colorante y la tasa de amortiguación del calcio y su retirada. El análisis de la amplitud transitoria del calcio se puede utilizar para estudiar la influencia de diferentes sustancias activas en la entrada de calcio que participan en la liberación de neurotransmisores. Esta técnica de carga es muy adecuada para la obtención de imágenes de cambios en el calcio citosómico.

Con indicadores fluorescentes y la estimulación de un solo nervio y actividad sináptica rítmica. El análisis de la amplitud transitoria del calcio se puede utilizar para estudiar la influencia de diferentes sustancias en la entrada de calcio que participa en la liberación de neurotransmisores. Hay algunos puntos importantes a los que queremos prestar atención.

El procedimiento de incubación incluye dos pasos. Incubación a temperatura ambiente, y en nevera. Es importante controlar el tiempo de incubación con el colorante a temperatura ambiente.

Dependiendo de la longitud del muñón del nervio, el tinte y la temperatura de la habitación, el tiempo de incubación puede variar. Si se sobreexponen los terminales preoperatorios y las partes proximales, cerca del muñón del nervio, pueden sobrecargarse. Debido a la larga incubación en el refrigerador, el tinte se distribuye uniformemente a lo largo de las terminaciones nerviosas.

Es esencial colocar el nervio en la solución de carga de colorante, dentro de varios minutos después del corte, para permitir que el tinte ingrese al nervio, ya que los intervalos de tiempo más largos producen una carga ineficaz, presumiblemente debido a recibir el nervio cerrado. Para reducir la compartimentación del tinte, es posible utilizar la forma extendida del tinte. Es muy importante evitar la iluminación fluorescente prolongada del tejido porque afecta a su supervivencia.

Utilizamos la óptica Nomarski en el canal de luz visible para buscar los terminales. Durante la grabación, limitamos la vista iluminada, por el diafragma. La larga duración del proceso de carga se puede reducir utilizando el sello del obturador del nervio.

En este caso, se puede utilizar un microbypass de vidrio.