Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

El objetivo general de estos experimentos es generar e inyectar de manera eficiente agregados esféricos terapéuticos, o esferoides, de células madre mesenquimales/estromales, o CMM, cebadas en condiciones libres de componentes xenógenos en aplicaciones experimentales y clínicas. Estos métodos pueden ayudar a superar barreras importantes en el campo de la terapéutica con CMM, como la baja retención celular, supervivencia y funcionalidad, que a menudo se observan tras el trasplante de células dispersas y en condiciones adversas comúnmente asociadas con lesión tisular.

La principal ventaja de estos procedimientos es que los esferoides de MSC pueden prepararse, cebarese e inyectarse en ausencia de productos animales inmunogénicos, como el suero bovino fetal (FBS), lo cual actualmente limita algunas aplicaciones clínicas de las células y también puede dificultar la interpretación de ciertos datos preclínicos. Aunque este mecanismo es potencialmente muy beneficioso para mediar la eficacia basada en MSC, también puede utilizarse para comprender la reparación tisular mediada por MSC y cómo otras formulaciones de medio pueden modificar el genex terapéutico plus. Estos procedimientos serán demostrados por Josh Beaver y Bret Clough, dos técnicos de mi laboratorio.

Después de sembrar e incubar las células madre mesenquimales, según el protocolo descrito, utilice tripsina y EDTA para recolectar las células tras centrifugarlas a 450 × g, y reúna todas las células en un único tubo cónico con el medio adecuado. Centrifugue las células y re-suspenda el sedimento en un pequeño volumen de medio. Luego, tras contar las células, para generar esferoides de aproximadamente 25 000 células, diluya las CMM recolectadas en uno de los siguientes medios a una concentración de 714 células por microlitro.

A continuación, pipetee gotas de 35 microlitros de las células en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo invertida de 150 milímetros. Transfiera 20 mililitros de PBS a temperatura ambiente a la base de la placa y, en un movimiento continuo y constante, invierta la tapa que contiene las gotas de manera que las ápices de las gotas queden orientadas hacia abajo. Luego, coloque cuidadosamente la tapa sobre la base de la placa de cultivo.

Transfiera el recipiente al incubador durante tres días sin perturbarlo para permitir un ensamblaje adecuado de las esferas. Tras la incubación, comience la recolección de esferoides retirando cuidadosamente la tapa e invirtiéndola de modo que las gotas queden nuevamente orientadas hacia arriba. Luego, incline la tapa aproximadamente entre 10 y 20 grados y utilice un levantador de células para empujar las gotas que contienen los esferoides hacia el borde de la placa.

Utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera el medio del extremo de la esfera a un tubo cónico de 15 mililitros y use PBS a temperatura ambiente y la misma punta de pipeta para lavar la placa, asegurando así la recuperación máxima de los esferoides. Para ensayos de PCR en tiempo real, centrifugue la suspensión de esferas a 450 × g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego aspire el sobrenadante.

Lave los esferoides con PBS y repita ambos pasos de centrifugación y aspiración. Para la administración en animales, permita que las esferas sedimenten en el fondo del tubo sin centrifugación. Para recoger el medio condicionado, o medio CM, para ensayos de potencial inmunomodulador y anti-cáncer, utilizando un espátula para células y una pipeta como se acaba de demostrar, recolecte los esferoides y el medio CM en un tubo cónico de 15 mililitros.

Sin embargo, no lave las tapas con PBS. Tras la centrifugación a 450 veces G durante 5 a 10 minutos, transfiera el sobrenadante a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugue el sobrenadante a 10.000 veces G y temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.

Luego, use una pipeta para recoger cuidadosamente el CM clarificado en nuevos tubos de 1,5 mililitros para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Después de preparar los esferoides como se acaba de demostrar en este video y esperar de tres a cuatro minutos para que sedimenten en el fondo del tubo, aspire el sobrenadante y lave los esferoides añadiendo HBSS suplementado con 0,2 a 0,5 % de HSA para mantener condiciones libres de xenógenos. A continuación, aspire el sobrenadante.

Cubra los esferoides con 100 a 200 microlitros de HBSS/HSA estéril y coloque los tubos sobre hielo. Después de anestesiar un ratón según el protocolo descrito, coloque el animal dentro de la cabina BSL-2 con la cara dorsal hacia abajo y use etanol al 70 % para desinfectar el abdomen inferior del ratón. Retire la tapa de un catéter intravenoso de calibre 20 y, mientras sostiene la piel del ratón con una mano, localice el punto medio de una línea imaginaria que conecta la articulación de la rodilla flexionada y la zona genital; con la punta de la aguja del conjunto del estilete del catéter orientada hacia la línea media, use la otra mano para realizar una inyección intraperitoneal.

Retire suavemente la aguja metálica del conjunto del estilete del catéter. Verifique la presencia de sangre, orina y heces en el estilete y deseche este. Confirme la colocación correcta del catéter plástico insertando una punta de pipeta de 100 a 200 microlitros con 100 microlitros de HBSS/HSA estéril en el adaptador del émbolo del catéter, formando un sello hermético.

Luego, inyecte lentamente el líquido dentro de la cavidad peritoneal. Con una punta de pipeta de 100 a 200 microlitros, recoja los esferoides de MSA y HBSS/HSA y transfiera todo el volumen a la cavidad peritoneal a través del catéter, tal como se acaba de demostrar. A continuación, lave el tubo que contiene las esferas con 100 microlitros de HBSS/HSA y transfiera todo el volumen de esferas a la cavidad peritoneal.

Coloque una gasa empapada en antiséptico sobre el catéter y retire lentamente el catéter de la cavidad peritoneal, desechándolo después. Inspeccione el catéter para verificar si quedan esferoides. A continuación, masajee suavemente la cavidad peritoneal con los dedos para asegurar una distribución uniforme de los esferoides.

Inmediatamente después de administrar los esferoides en los ratones, evalúe el nivel de activación de los esferoides preparados para inyecciones transfiriendo de 40 a 120 esferas al catéter en una placa de 12 o 6 pocillos que contenga uno a dos mililitros de MEM alfa suplementado con 2 % de FBS y penicilina-estreptomicina al 1X. Seis horas después, transfiera el medio de los pocillos a tubos de 1,5 o 15 mililitros y centrifugue los tubos a 450 × g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Finalmente, transfiera el CM clarificado a nuevos tubos de 1,5 mililitros y utilice un kit comercial de ELISA según el protocolo del fabricante para cuantificar la concentración de PGE-2.

Como se observa aquí, cuando aproximadamente 25.000 MSC se suspenden en gotas de 35 microlitros de CCM, las células primero se agrupan en agregados pequeños, pero eventualmente se fusionan para generar una única esfera compacta en la cúspide de la gota a las 72 horas. Esta figura demuestra que la formación de esferas compactas únicas y XFM-1 requiere suplementación con 13 miligramos por mililitro de HSA, una concentración que refleja el contenido estimado total de proteínas en el CCM. Durante el ensamblaje de la esfera, el fenotipo de las MSC cambia radicalmente y, cuando se encuentran en un medio químicamente definido y libre de componentes xenógenos adecuado, se incrementa la expresión de numerosos factores antiinflamatorios, incluyendo PGE2 y TSG6.

Sin embargo, la producción de TSG6 y PGE2 no se incrementa notablemente en las MSC cultivadas como esferas en XFM-2 o XFM-1 sin HSA. Finalmente, de forma similar a los efectos in vitro, las esferas de XFM-1 con HSA inyectadas en la cavidad peritoneal de ratones inmediatamente después de inducir inflamación sistémica mediante la administración intravenosa de LPS, aumentaron los niveles de PGE2 e IL-10 en el peritoneo, mientras reducían el TNF alfa proinflamatorio. Una vez dominado, cada placa de gotas colgantes puede prepararse en uno o dos minutos.

Y la administración intraperitoneal de esferoides íntegros puede completarse en 5 a 10 minutos por animal cuando se realiza adecuadamente. Al producir esferoides de CMM mediante la técnica de gota colgante, es importante recordar que diferentes formulaciones de medios libres de xeno no son iguales en cuanto a la formación de esferas y la mejora de la expresión de genes terapéuticos. Tras este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la microscopía confocal, para comprender la organización de las CMM en los esferoides y también qué vías de señalización adicionales podrían estar activadas en las CMM en diferentes partes del esferoide.

Tras este desarrollo, este método permitió a los científicos que trabajan con CMM estudiar otras condiciones de cultivo tridimensional y cómo afectan la preparación de CMM y la expresión génica terapéutica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar CMM como esferoides utilizando la técnica de gota colgante, cómo evaluar su eficacia terapéutica in vitro y cómo administrar eficazmente esferoides íntegros en ratones para pruebas de eficacia in vivo. Y no olvide que trabajar con células madre humanas adultas requiere equipo especial y capacitación, y puede ser peligroso si las células no se manipulan adecuadamente.

Debe usarse equipo de protección personal adecuado en todo momento al manipular células madre humanas adultas.