Name: Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprende a generar esferoides de células madre mesenquimales en condiciones libres de xenoinjertos para mejorar la retención y funcionalidad celular en terapias regenerativas. Este método optimiza aplicaciones clínicas.

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Este trabajo fue financiado en parte por P40RR17447 de subvención del Instituto Nacional de Salud y RP150637 de premio del Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas. Nos gustaría agradecer al Dr. Darwin J. Prockop por su apoyo en el proyecto.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El MSC óptima para su uso en algunas aplicaciones de investigación y clínicos debe ser altamente activa para maximizar su beneficio, y preferentemente prepara en condiciones XF definidos químicamente para reducir al mínimo la entrega de antígenos potenciales a partir de los componentes del medio xenogénicos tales como FBS. En los protocolos descritos aquí, hemos demostrado a los métodos 1) activar las MSC en cultivo 3D mediante la formación de esferoides, 2) lograr la activación 3D de las MSC en condiciones XF, 3) evalu...

Mesenquimales madre / células del estroma (MSC) han mostrado un gran potencial para los diversos enfoques de medicina regenerativa. MSCs fueron aislados inicialmente como un componente del estroma de médula ósea, pero desde entonces se han obtenido a partir de numerosos otros tejidos adultos, incluyendo el tejido adiposo 1, 2, 3. Curiosamente, el método de aislamiento principal abarca la notable propiedad de MSCs se adhiera firmemente en plástico de cultivo de tejidos en presencia de suero bovino fetal (FBS). Si bien esta técnica de aislamiento tradicional permite la expansión fácil y rápida de las MSC en dos dimensiones-cultivo (2D), que también es muy artificial y no tiene en cuenta importancia del medio ambiente nativo en tres dimensiones (3D) que conduce a la pérdida potencial de importante características celular 4, 5 , 6. Por lo tanto, el estudio de las MSC en cultivos 3D, queson más fisiológica que los cultivos tradicionales en 2D, ha surgido en búsqueda de características MSC &quot;perdidos / parcial&quot;. Por otra parte, un gran interés ha aumentado para identificar condiciones (XF) libre de xeno químicamente definido para el cultivo de MSC y activación, y de este modo hacer que las células sean más susceptibles para aplicaciones clínicas. Muchos estudios se han publicados que demuestran la cultura 3D de MSCs tanto en biomateriales y como agregados esféricos o esferoides. MSC en biomateriales fueron diseñados inicialmente para los enfoques de ingeniería de tejidos para reemplazar tejidos dañados con andamios sembrado de células, mientras que no se observaron cultivos de esferoides de MSC como una manera de entender el comportamiento de MSC in vivo después de la administración de las células para terapias en ensayos preclínicos o clínicos 4, 5, 7. Curiosamente, MSC formar esferoides espontáneamente cuando no está permitido adherencia al plástico de cultivo de tejidos8, 9, 10. Tradicionalmente, la agregación de células fue facilitado por métodos matraz de agitación o técnicas de superposición líquidos, métodos utilizados inicialmente en la biología del cáncer en los esfuerzos para tratar de imitar el microambiente tumoral. Más recientemente, métodos adicionales han surgido que demuestran la agregación de células en placas de cultivo pre-recubierto con productos químicos específicos para evitar que la célula-a-plástico de adhesión 4, 5, 6. Uno de los métodos más simples y más económicos para generar esferoides MSC es a la cultura en gotas colgantes, una técnica que a menudo se utiliza para producir cuerpos embrioides a partir de células madre embrionarias. Con colgando técnica de cultivo gota, adherencia de las células al plástico de cultivo de tejidos se evita mediante la suspensión de las células en una gota de medio en la parte inferior de una tapa de placa de cultivo de tejido y permitiendo que la gravedad para facilitar AGGREG célulaación en el ápice de la gota. El tamaño esferoide puede ser manipulado fácilmente por el cambio de la concentración de células o el volumen de la gota, haciendo culturas gota colgante especialmente fácil de controlar. Los primeros estudios sobre la cultura 3D de MSCs demostraron diferencias radicales en las características de las células en 3D en comparación con sus contrapartes 2D 6, 8, 9. Al mismo tiempo, los informes demostraron que los efectos beneficiosos de las MSC in vivo se basó en su capacidad de activarse por señales micro-ambientales y, en respuesta, para producir anti-inflamatorio e inmunomodulador factores de 11. Curiosamente, muchos de estos factores, tales como la prostaglandina E2 (PGE2), tumor necrosis gen del factor estimulada 6 (TSG6), y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se produjeron en cantidades mucho mayores por esferoides MSC que MSCs 2D tradicionales allanando el camino para el idea deutilizando cultivos 3D para activar las células 8, 12, 13. Por otra parte, la activación de genes en cultivos 3D apareció recapitular mecanismos, al menos en parte, de la activación de células después de la inyección en ratones 12. Mediante la activación de las MSC antes de su uso en los experimentos, los efectos de las células podrían ser prolongados y más prominente como el efecto MSC tradicional in vivo a menudo se retrasa y transitorios, y puede ser descrito como &quot;golpear y correr&quot;. Durante los últimos años, los estudios funcionales importantes utilizando esferoides MSC han demostrado que pueden suprimir las respuestas inflamatorias y modular la inmunidad in vivo al influir en las células efectoras, tales como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, y células T que hacen esferoides una forma atractiva de MSCs imprimados 2 , 3. Además, la producción de moléculas anti-cáncer, tales como interleukin-24 (IL-24) y la necrosis tumoral relacionado con el factor inductor de apoptosis ligando (TRAIL), se incrementan en cultivos 3D de las MSC en relación con monocapa MSCs, un fenómeno que podría ser explotado para terapias contra el cáncer dirigidas 8, 10, 14. A medida que la cultura tradicional de MSC requiere no sólo el uso de plástico de cultivo de tejidos, sino también de FBS, otro obstáculo para hacer esferoides MSC más favorable para el uso clínico se tuvieron que superar. Para hacer frente a este obstáculo, que recientemente mostró la formación de esferoides de MSC en condiciones específicas XF definidos químicamente y estableció que los esferoides MSC resultantes se activan para producir las mismas moléculas contra el cáncer anti-inflamatorio y como los esferoides generados en condiciones con FBS al 14. En este caso, estos resultados se presentan en varios protocolos detallados que demuestran la generación de MSC pre-activadas en cultivos 3D usando XFmedios de comunicación. Además, los protocolos se presentan que describen formas eficaces para evaluar los niveles de activación de las MSCs en cuanto a sus efectos antiinflamatorios, inmunomoduladores y anti-cáncer de efectos, junto con un método práctico para entregar los esferoides intactas en ratones.

<table><tbody><tr><td>MEM-y alfa; (alfa medio esencial mínimo)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>12561049; 12561056; 12561072</td><td>medio esencial mínimo para la preparación del medio de crecimiento MSC (CCM)</td></tr><tr><td>FBS (suero fetal bovino), selección premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11595; S11510; S11550; S11595-24</td><td>componente de medios de cultivo completos para todo tipo de células</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25030081; 25030149; 25030164</td><td>componente de medios de cultivo completos para todo tipo de células</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td></td><td>15070063 componente de medios de cultivo completos para todo tipo de células</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de esterilización, 0,22 y micro; m Membrana PES</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE</td><td>medio de esterilización placa de</td></tr><tr><td>cultivo celular de 150 mm</td><td>Nunc</td><td>D8554&nbsp; Cultivo celular SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma con camisa de agua CO2 incubadora humidificada</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modelo 3110</td><td>de células cultivadas</td></tr><tr>Paso<td>temprano</td><td>Centro de Preparación y Distribución de Células Madre Adultas en The Texas A& M Centro de Ciencias de la Salud Facultad de Medicina Instituto de Medicina Regenerativa en Scott & Preparación</td> de <td>NA</td> blanco <td>de cultivos 2D y 3D de MSC</td></tr><tr><td>baño de agua</td><td>VWR</td><td>89501-468</td><td>medios de calentamiento a 37 & grados; C</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>492000904</td><td>manipulación manual</td></tr><tr><td>de líquidos Pipete-Aid Drummond</td><td>Scientific Company</td><td>4-000-300</td><td>manipulación de pipetas serológicas</td></tr><tr><td>Costar pipeta serológica estéril (5, 10, 25 y 50 ml)</td><td>Corning</td><td>4487; 4101; 4251; 4490</td><td></td></tr><tr><td>manipulación de líquidos PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,4</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10010023; 10010072; 10010031; Procesamiento de</td><td>cultivos celulares</td></tr><tr><td>10010049 Solución de tripsina/EDTA al 0,25 %</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>25200056; 25200072; 25200114</td><td>Células adherentes de elevación y dispersión de agregados celulares</td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 ml</td><td>Centrifugación de células</td><td>352097 Corning/BD Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>Centrifugación de células</td><td>352098 Corning/BD Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada Eppendor</td><td>Eppendorf/Fisher Scientific</td><td>Modelo 5810R</td> hemocitómetro <td>de centrifugación celular</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>26716</td> recuento <td>de células</td></tr><tr><td>azul de tripán</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154 SIGMA</td><td>Exclusión de células muertas durante el recuento de células en hemacitómetro</td></tr><tr><td>Definido xenofree MSC medium-1 (XFM-1)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>A1067501</td><td>Medios libres de xeno formulados específicamente para el crecimiento y la expansión de células madre mesenquimales humanas</td></tr><tr><td>Medios MSC xenolibres definidos-2 (XFM-2)</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>5420</td><td>Medio definido y libre de xeno para células madre mesenquimales humanas</td></tr><tr><td>HSA (albúmina sérica humana)</td><td>Gemini</td><td>800-120</td><td>Componente de medios MSC libres de xeno</td></tr><tr><td>rHSA (albúmina sérica humana recombinante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731&nbsp; SIGMA</td><td>Componente de medios MSC libres de xeno Aislamiento total</td></tr> de <tr><td>ARN Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Extracción de ARN total</td></tr><tr><td>Qiashredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Homogeneización de muestras antes de la extracción total</td></tr><tr><td>de ARN Conjunto de DNasa libre de ARNasa&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Eliminación de ADN en columna durante la extracción total de ARN</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp; </td><td>Inhibición de ALDRICH de ARNasas en tampón RLT</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td>muestra de mezcla</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Biorad</td><td>NA</td><td>Concentración y calidad de ARN</td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td>transcripción de ARN total en ADNc</td></tr><tr><td>Ensayos de expresión génica</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>Varía la</td><td>combinación de cebador/sonda para PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR universal rápida</td><td>ThermoFisher/Applied Biosystems</td><td>4352042; 4364103; 4366073; 4367846</td> mezcla <td>maestra para reacción de PCR en tiempo real Sistema de</td></tr><tr><td>PCR en tiempo real (sistema de detección de secuencia ABI Prism 7900 HT)</td>Tubo de centrífuga <td>ABI Prizm</td><td>NA</td><td>PCR en tiempo real de</td></tr><tr><td>1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>Centrifugación celular, recolección y almacenamiento</td></tr> <tr><td>de muestras (-80 &deg; C) congelador</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modelo Thermo Forma 8695</td><td>almacenamiento de muestras</td></tr><tr><td>PGE2 (Prostaglandina E2) ELISA Kit</td><td>R& D Sistemas</td><td>KGE004B</td><td>estimación de la concentración de citocinas en la muestra</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Eagle medium)</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>10566-016; 10566-024; 10566-032 medio de</td><td>cultivo de macrófagos</td></tr><tr><td>J774 macrófagos de ratón</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>línea celular de macrófagos de ratón</td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>in vitro estimulación de macrófagos</td></tr><tr><td>LPS (lipopolisacárido)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4130</td><td>in vitro estimulación de macrófagos</td></tr><tr><td>Ratón TNF-a kit ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>MTA00B</td><td>estimación de la concentración de citocinas en la muestra</td></tr><tr><td>de ratón IL-10 (interleucina 10) kit ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>M1000B</td><td>estimación de la concentración de citocinas en la muestra</td></tr> Medio <tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>11875-085</td><td>medios de cultivo de esplenocitos</td></tr><tr><td>BALB/c ratones The</td><td>Jackson Laboratory</td><td>651</td><td>in vivo liberación de esferoides; preparación de esplenocitos</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD3e Grado funcional purificado</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>in vitro Estimulación de Esplenocitos</td></tr><tr><td>70 &mu; M colador&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Preparación de esplenocitos</td></tr><tr><td>Solución de lisis de glóbulos rojos (1x)</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>00-4333</td><td>eliminación de glóbulos rojos durante el aislamiento de esplenocitos</td></tr><tr><td>Ratón IFN-&#947; (interferón gamma) Kit ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>MIF 00</td><td>estimación de la concentración de citocinas en la muestra de</td></tr><tr><td>células de cáncer de próstata LNCaP&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>estudia el efecto de las MSC 3D en líneas celulares cancerosas in vitro</td></tr><tr><td>ADN kit de ensayo de proliferación celular basado en</td><td>ThermoFisher</td><td>C7026</td><td>medición del número de células basada en el contenido de ADN</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>componente del reactivo de lisis</td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>ThermoFisher</td><td>FERR1021</td><td>quelante de calcio, componente del reactivo de lisis</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>Degradación de ARN para la medición de ADN Lector de</td></tr><tr><td>microplacas multimodo basado en filtro</td><td>BMG Technology</td><td>NA</td><td>Ensayos de microplacas (ELISA, cuantificación celular, etc.)</td></tr><tr><td>HBSS (solución salina equilibrada de Hanks), sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>ThermoFisher/Gibco</td><td>14175079</td><td>reposición de esferoides MSC antes de las inyecciones in vivo</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>MWI Vet Supply</td><td>502017</td><td>Anestesia para inyecciones in vivo</td></tr><tr><td>Oxígeno, gas comprimido</td><td>Praxair</td><td>NA</td><td>Para usar con isoflurano</td></tr><tr><td>Thermo Forma Gabinete BSL-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>Modelo 1385</td><td>Cultivo de células estériles</td></tr><tr><td>Seguridad: catéter intravenoso/aguja de aguja, 20 G, 1 pulgada</td><td>Terumo</td><td>SR*FNP2025</td><td>Entrega de shperoides a la cavidad peritoneal</td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta estériles</td><td>Eppendorf</td><td>varía el manejo de</td><td>líquidos/células</td></tr></tbody></table>

producción y administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (msc) esferoides imprimado en 3-d los cultivos bajo condiciones xeno-libres

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenquimales del estroma células madre / (MSC) son una gran promesa en la bioingeniería y la medicina regenerativa. MSCs se pueden aislar a partir de múltiples tejidos adultos a través de su fuerte adherencia a plástico de cultivo tisular y luego se expandieron adicionalmente in vitro, más comúnmente usando suero bovino fetal (FBS). Desde FBS puede causar MSCs para ser inmunogénico, su presencia en los cultivos de MSC limita las aplicaciones clínicas y experimentales de las células. (XF) medios libres de xeno Por lo tanto, los estudios que emplean definidos químicamente para cultivos de MSC son extremadamente valiosos. Muchos de los efectos beneficiosos de las MSC se han atribuido a su capacidad para regular la inflamación y la inmunidad, principalmente a través de la secreción de factores inmunomoduladores tales como necrosis tumoral gen del factor estimulada 6 (TSG6) y la prostaglandina E2 (PGE2). Sin embargo, las MSC requieren activación para producir estos factores y dado que el efecto de las MSC es a menudo transitoria, un gran interés ha surgido para descubrir maneras de pre-activación de las células prior a su uso, eliminando así el tiempo de retraso para la activación in vivo. Aquí presentamos los protocolos de activar de manera eficiente o MSC principales en tres dimensiones (3D) de las culturas XF en condiciones definidas químicamente y administrar estos MSC pre-activadas in vivo. Específicamente, primero se describen los métodos para generar MSC esférica micro-tejidos o &quot;esferoides &#39;en gotas colgantes usando medio XF y demostrar cómo las esferas y el medio acondicionado (CM) se pueden cosechar para diversas aplicaciones. En segundo lugar, describimos pantallas de la expresión génica y en ensayos funcionales in vitro para evaluar rápidamente el nivel de activación MSC en esferoides, haciendo hincapié en el potencial anti-inflamatorio y anti-cáncer de las células. En tercer lugar, se describe un nuevo método para inyectar esferoides MSC intactas en la cavidad peritoneal del ratón para ensayos de eficacia in vivo. En general, los protocolos en este documento superar los principales retos de la obtención de las MSC pre-activadas bajo con XF químicamente definidocondiciones y proporcionan un sistema flexible para administrar esferoides MSC para las terapias.

En el presente trabajo, se emplearon cultivos que cuelgan de gota compactos para generar micro-tejidos esféricos o esferoides &#39;&#39; de MSC activa en condiciones XF. La hoja de ruta de investigación en la Figura 1 muestra que las MSC se les anima a la auto-ensamblan para formar esferoides cuando se suspenden en cuelgan gotas durante 72 horas, después de lo cual los esferoides, o el CM cargados de factores terapéuticos esfera derivados, se pueden recoger y potencialme...

El potencial terapéutico de las células madre/estroma mesenquimales (MSCs) está bien documentado, sin embargo, el mejor método para preparar las células para los pacientes sigue siendo controvertido. En este artículo, comunicamos protocolos para generar y administrar de manera eficiente agregados esféricos terapéuticos o 'esferoides' de MSCs preparados en condiciones libres de xeno para aplicaciones experimentales y clínicas.

Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

El objetivo general de estos experimentos es generar e inyectar de manera eficiente agregados esféricos terapéuticos, o esferoides, de células madre mesenquimales/estromales, o CMM, cebadas en condiciones libres de componentes xenógenos en aplicaciones experimentales y clínicas. Estos métodos pueden ayudar a superar barreras importantes en el campo de la terapéutica con CMM, como la baja retención celular, supervivencia y funcionalidad, que a menudo se observan tras el trasplante de células dispersas y en condiciones adversas comúnmente asociadas con lesión tisular.La principal ventaja de estos procedimientos es que los esferoides de MSC pueden prepararse, cebarese e inyectarse en ausencia de productos animales inmunogénicos, como el suero bovino fetal (FBS), lo cual actualmente limita algunas aplicaciones clínicas de las células y también puede dificultar la interpretación de ciertos datos preclínicos. Aunque este mecanismo es potencialmente muy beneficioso para mediar la eficacia basada en MSC, también puede utilizarse para comprender la reparación tisular mediada por MSC y cómo otras formulaciones de medio pueden modificar el genex terapéutico plus. Estos procedimientos serán demostrados por Josh Beaver y Bret Clough, dos técnicos de mi laboratorio.Después de sembrar e incubar las células madre mesenquimales, según el protocolo descrito, utilice tripsina y EDTA para recolectar las células tras centrifugarlas a 450 × g, y reúna todas las células en un único tubo cónico con el medio adecuado. Centrifugue las células y re-suspenda el sedimento en un pequeño volumen de medio. Luego, tras contar las células, para generar esferoides de aproximadamente 25 000 células, diluya las CMM recolectadas en uno de los siguientes medios a una concentración de 714 células por microlitro.A continuación, pipetee gotas de 35 microlitros de las células en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo invertida de 150 milímetros. Transfiera 20 mililitros de PBS a temperatura ambiente a la base de la placa y, en un movimiento continuo y constante, invierta la tapa que contiene las gotas de manera que las ápices de las gotas queden orientadas hacia abajo. Luego, coloque cuidadosamente la tapa sobre la base de la placa de cultivo.Transfiera el recipiente al incubador durante tres días sin perturbarlo para permitir un ensamblaje adecuado de las esferas. Tras la incubación, comience la recolección de esferoides retirando cuidadosamente la tapa e invirtiéndola de modo que las gotas queden nuevamente orientadas hacia arriba. Luego, incline la tapa aproximadamente entre 10 y 20 grados y utilice un levantador de células para empujar las gotas que contienen los esferoides hacia el borde de la placa.Utilizando una pipeta de un mililitro, transfiera el medio del extremo de la esfera a un tubo cónico de 15 mililitros y use PBS a temperatura ambiente y la misma punta de pipeta para lavar la placa, asegurando así la recuperación máxima de los esferoides. Para ensayos de PCR en tiempo real, centrifugue la suspensión de esferas a 450 × g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego aspire el sobrenadante.Lave los esferoides con PBS y repita ambos pasos de centrifugación y aspiración. Para la administración en animales, permita que las esferas sedimenten en el fondo del tubo sin centrifugación. Para recoger el medio condicionado, o medio CM, para ensayos de potencial inmunomodulador y anti-cáncer, utilizando un espátula para células y una pipeta como se acaba de demostrar, recolecte los esferoides y el medio CM en un tubo cónico de 15 mililitros.Sin embargo, no lave las tapas con PBS. Tras la centrifugación a 450 veces G durante 5 a 10 minutos, transfiera el sobrenadante a tubos de 1,5 mililitros. Centrifugue el sobrenadante a 10.000 veces G y temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos.Luego, use una pipeta para recoger cuidadosamente el CM clarificado en nuevos tubos de 1,5 mililitros para su almacenamiento a menos 80 grados Celsius. Después de preparar los esferoides como se acaba de demostrar en este video y esperar de tres a cuatro minutos para que sedimenten en el fondo del tubo, aspire el sobrenadante y lave los esferoides añadiendo HBSS suplementado con 0,2 a 0,5 % de HSA para mantener condiciones libres de xenógenos. A continuación, aspire el sobrenadante.Cubra los esferoides con 100 a 200 microlitros de HBSS/HSA estéril y coloque los tubos sobre hielo. Después de anestesiar un ratón según el protocolo descrito, coloque el animal dentro de la cabina BSL-2 con la cara dorsal hacia abajo y use etanol al 70 % para desinfectar el abdomen inferior del ratón. Retire la tapa de un catéter intravenoso de calibre 20 y, mientras sostiene la piel del ratón con una mano, localice el punto medio de una línea imaginaria que conecta la articulación de la rodilla flexionada y la zona genital; con la punta de la aguja del conjunto del estilete del catéter orientada hacia la línea media, use la otra mano para realizar una inyección intraperitoneal.Retire suavemente la aguja metálica del conjunto del estilete del catéter. Verifique la presencia de sangre, orina y heces en el estilete y deseche este. Confirme la colocación correcta del catéter plástico insertando una punta de pipeta de 100 a 200 microlitros con 100 microlitros de HBSS/HSA estéril en el adaptador del émbolo del catéter, formando un sello hermético.Luego, inyecte lentamente el líquido dentro de la cavidad peritoneal. Con una punta de pipeta de 100 a 200 microlitros, recoja los esferoides de MSA y HBSS/HSA y transfiera todo el volumen a la cavidad peritoneal a través del catéter, tal como se acaba de demostrar. A continuación, lave el tubo que contiene las esferas con 100 microlitros de HBSS/HSA y transfiera todo el volumen de esferas a la cavidad peritoneal.Coloque una gasa empapada en antiséptico sobre el catéter y retire lentamente el catéter de la cavidad peritoneal, desechándolo después. Inspeccione el catéter para verificar si quedan esferoides. A continuación, masajee suavemente la cavidad peritoneal con los dedos para asegurar una distribución uniforme de los esferoides.Inmediatamente después de administrar los esferoides en los ratones, evalúe el nivel de activación de los esferoides preparados para inyecciones transfiriendo de 40 a 120 esferas al catéter en una placa de 12 o 6 pocillos que contenga uno a dos mililitros de MEM alfa suplementado con 2 % de FBS y penicilina-estreptomicina al 1X. Seis horas después, transfiera el medio de los pocillos a tubos de 1,5 o 15 mililitros y centrifugue los tubos a 450 × g y temperatura ambiente durante cinco minutos. Finalmente, transfiera el CM clarificado a nuevos tubos de 1,5 mililitros y utilice un kit comercial de ELISA según el protocolo del fabricante para cuantificar la concentración de PGE-2.Como se observa aquí, cuando aproximadamente 25.000 MSC se suspenden en gotas de 35 microlitros de CCM, las células primero se agrupan en agregados pequeños, pero eventualmente se fusionan para generar una única esfera compacta en la cúspide de la gota a las 72 horas. Esta figura demuestra que la formación de esferas compactas únicas y XFM-1 requiere suplementación con 13 miligramos por mililitro de HSA, una concentración que refleja el contenido estimado total de proteínas en el CCM. Durante el ensamblaje de la esfera, el fenotipo de las MSC cambia radicalmente y, cuando se encuentran en un medio químicamente definido y libre de componentes xenógenos adecuado, se incrementa la expresión de numerosos factores antiinflamatorios, incluyendo PGE2 y TSG6.Sin embargo, la producción de TSG6 y PGE2 no se incrementa notablemente en las MSC cultivadas como esferas en XFM-2 o XFM-1 sin HSA. Finalmente, de forma similar a los efectos in vitro, las esferas de XFM-1 con HSA inyectadas en la cavidad peritoneal de ratones inmediatamente después de inducir inflamación sistémica mediante la administración intravenosa de LPS, aumentaron los niveles de PGE2 e IL-10 en el peritoneo, mientras reducían el TNF alfa proinflamatorio. Una vez dominado, cada placa de gotas colgantes puede prepararse en uno o dos minutos.Y la administración intraperitoneal de esferoides íntegros puede completarse en 5 a 10 minutos por animal cuando se realiza adecuadamente. Al producir esferoides de CMM mediante la técnica de gota colgante, es importante recordar que diferentes formulaciones de medios libres de xeno no son iguales en cuanto a la formación de esferas y la mejora de la expresión de genes terapéuticos. Tras este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la microscopía confocal, para comprender la organización de las CMM en los esferoides y también qué vías de señalización adicionales podrían estar activadas en las CMM en diferentes partes del esferoide.Tras este desarrollo, este método permitió a los científicos que trabajan con CMM estudiar otras condiciones de cultivo tridimensional y cómo afectan la preparación de CMM y la expresión génica terapéutica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar CMM como esferoides utilizando la técnica de gota colgante, cómo evaluar su eficacia terapéutica in vitro y cómo administrar eficazmente esferoides íntegros en ratones para pruebas de eficacia in vivo. Y no olvide que trabajar con células madre humanas adultas requiere equipo especial y capacitación, y puede ser peligroso si las células no se manipulan adecuadamente.Debe usarse equipo de protección personal adecuado en todo momento al manipular células madre humanas adultas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

El cultivo de células mesenquimales estromales humanas (hMSC) con suero autólogo, reduce los riesgos de rechazo por el material xenogénico y otros efectos negativos. También permite la recuperación de un subconjunto de progenitores mesodérmicos, que puede entregar hMSCs frescas. Incorporación de hMSCs en un coágulo de fibrina autóloga permite un manejo fácil y efectiva implantación quirúrgica.

Mesenquimales estromales de cultivo celular y de entrega en autólogas Condiciones: Enfoque inteligente para aplicaciones ortopédicas

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de esferoides celulares del ligamento periodontal humano (PDL) por películas de quitosano. El cultivo de esferoides celulares tridimensionales (3D) proporciona una alternativa al sistema de cultivo de poliestireno (TCPS) de cultivo tisular convencional.

Formación de esferoides de células de ligamento periodontal humano en Chitosan Films

Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.

Producción automatizada a gran escala de esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo para bioimpresión 3D

Aquí, presentamos un protocolo para cosechar células adherentes de matraces multicapa de manera semiautomatizada cerrada utilizando un sistema de centrifugación de contraflujo. Este protocolo se puede aplicar para recolectar células adherentes y de suspensión de otras plataformas de expansión celular con pocas modificaciones a los pasos existentes.

Procesamiento de células madre mesenquimales humanas para aplicaciones clínicas utilizando un flujo de trabajo semiautomatizado cerrado

Los productos xenogénicos (químicos o derivados de animales) introducidos en los pasos de preparación/manipulación de la terapia celular se asocian con un mayor riesgo de reactividad inmune y transmisión patogénica en pacientes huéspedes. Aquí, se describe un método completo libre de xenogénicos para el aislamiento y la expansión in vitro de células madre derivadas de tejido adiposo humano.

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo humano con un innovador método libre de xenogénicos para terapia humana

Se describe un protocolo para la producción de microportadores-microbioreactores de células dependientes del anclaje como posibles terapias basadas en células. Al abordar un caso de uso del síndrome de dificultad respiratoria aguda, se ilustra un rendimiento celular comparable y una expresión génica favorable en relación con condiciones de proceso basadas en matraz. Este protocolo es extensible a otras celdas dependientes del anclaje e indicaciones de objetivos.

Producción basada en microbioreactores de células estromales mesenquimales dependientes del anclaje, preparadas para el síndrome de dificultad respiratoria aguda

En este documento se describen los métodos para la disección de tejidos fetales y maternas de placenta humana a término, seguido por el aislamiento y expansión de células madre mesenquimatosas / estroma (MSC) de estos tejidos.

Aislamiento y expansión de células madre mesenquimales / estromales derivadas de tejido de placenta humana

Se presenta un método para la cría de Drosophila melanogaster en condiciones axénicas y gnotobióticos. Volar embriones se dechorionated en hipoclorito de sodio, de manera aséptica a la dieta estéril, y se ha criado en contenedores cerrados. La inoculación de la dieta y los embriones con bacterias conduce a asociaciones gnotobióticos, y la presencia bacteriana se confirmó mediante siembra de todo el cuerpo homogeneizados de Drosophila.

La cría de la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos

Aprende a generar esferoides de células madre mesenquimales en condiciones libres de xenoinjertos para mejorar la retención y funcionalidad celular en terapias regenerativas. Este método optimiza aplicaciones clínicas.

Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres (Video) | JoVE Journal

Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

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