Ordenamiento temporal de los datos de expresión dinámica de la expresión espacial detallada Mapas

El objetivo general de este procedimiento experimental es mapear la dinámica de expresión génica espacio-temporal del reloj de segmentación de vertebrados utilizando muestreo de tejido fijo. Este método permite una evaluación no sesgada de la dinámica génica oscilatoria en el mesodermo presomítico, y esto es crucial para comprender los mecanismos moleculares que gobiernan la somatogénesis de los vertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden generar y procesar muchas muestras simultáneamente, lo que permite el análisis en tres partes de la dinámica de la expresión génica en tejido fijo.

La Dra. Charlotte Bailey, ex investigadora postdoctoral en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de obtener un cuerno uterino de ratón según el protocolo de texto, bajo un microscopio estereoscópico, se utilizaron tijeras curvas para cortar la gruesa membrana muscular del cuerno uterino y extraer cuidadosamente cada embrión. Con unas tijeras curvas y unas pinzas finas, disecciona el saco amniótico de cada embrión.

Luego, usando una aguja quirúrgica o unas tijeras curvas, recolecta el tejido de la cola de cada embrión cortando el embrión anterior a las yemas de las extremidades traseras. Equilibra el tejido de la cola con el lado ventral hacia abajo. A continuación, genere pares de explantes de PSM diseccionando el tejido de la cola en dos mitades a lo largo de la línea media, utilizando un suave movimiento de balanceo con la aguja.

Asegúrese de que el tubo neural, la notocorda y el tejido PSM se dividan en partes iguales entre los dos explantes. A continuación, pipetee cada explante de PSM contralateral en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo de plástico de 35 mm en un pequeño volumen de medio de cultivo precalentado. Coloque el plato en la parte superior de la tapa e inviértalo rápidamente, de modo que el pañuelo PSM quede suspendido de la tapa en una gota colgante de medio.

A continuación, cultive las explantaciones de PSM en una cámara humidificada a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Transfiera pares de explantes de PSM a los pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. A continuación, añada un 4% de paraformaldehído en PBS a las muestras e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora, o a cuatro grados centígrados en una plataforma oscilante durante la noche.

Después de la incubación, use PBS para lavar los pocillos de muestra a temperatura ambiente en una plataforma oscilante. Con una pipeta Pasteur de plástico fino, cambie la solución de PBS en las muestras tres o cuatro veces. Para llevar a cabo la inmunohistoquímica, añadir 2%Triton X-100 en PBS a un explante de PSM de cada par embrionario e incubar las muestras a temperatura ambiente en una plataforma oscilante durante una hora para lavarlas.

Use PBS para enjuagar brevemente las muestras. Luego, reemplace el PBS con solución de bloqueo e incube las muestras a cuatro grados centígrados en una plataforma oscilante durante la noche. Con tampón de trabajo, diluya los anticuerpos primarios deseados.

En este ejemplo, los anticuerpos contra Delta-like 1 y Notch1 se utilizan en una dilución de 1:25. Agregue los anticuerpos a los explantes e incube las muestras en una plataforma oscilante a cuatro grados centígrados durante tres a cinco días. Después de la incubación, use PBS para lavar las muestras dos veces durante cinco a diez minutos cada una.

A continuación, realice tres lavados en Triton X-100 al 0,3% en PBS a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante. Después de diluir los anticuerpos secundarios en tampón de trabajo, agregue 250-500 microlitros de la solución de anticuerpos a cada pocillo de muestra, teniendo cuidado de no usar los últimos microlitros de solución, que pueden contener agregados de anticuerpos. Con papel de aluminio, cubra la placa e incube las muestras en una solución secundaria de anticuerpos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante tres a cinco días.

Después de la incubación, use PBST para lavar las muestras dos veces durante diez minutos cada una. A continuación, utilice PBS para lavar el pañuelo una vez a temperatura ambiente en una plataforma mecedora durante cinco minutos. Siguiendo el protocolo de texto, deshidrate y rehidrate los explantes de PSM contralaterales restantes a través de una serie de diluciones de etanol PBST.

Añadir diez microgramos por mililitro de proteinasa K al 0,1% PBST a los explantes, e incubar el tejido sin agitación durante cinco minutos. A continuación, retire rápidamente la solución de proteinasa K y utilice PBST para enjuagar brevemente las muestras. Añadir un 4% de formaldehído y un 0,1% de glutaraldehído en PBST a los explantes de PSM para postfijarlos e incubar las muestras durante 30 minutos.

Luego, después de usar PBST para lavar las muestras dos veces durante diez minutos cada una, agregue una mezcla de hibridación al 50% al tejido e incube a 65 grados Celsius sin agitar durante diez minutos. Después de incubar las muestras y la mezcla de hibridación de acuerdo con el protocolo de texto, retire la solución y agregue de 0,25 a 0,5 mililitros de mezcla de hibridación precalentada que contenga una sonda de ARN antisentido marcada con digoxigenina contra un componente de reloj de segmentación conocido. Use cinta adhesiva para sellar la placa e incubar las muestras a 65 grados centígrados durante dos noches.

Después de la incubación, utilice una mezcla de hibridación precalentada al 50% en TBST para lavar las muestras durante 15 minutos. A continuación, utilice TBST para enjuagar las muestras dos veces antes de incubar el tejido en TBST a temperatura ambiente en una plataforma oscilante durante 30 minutos. A continuación, preincube los explantes en solución de bloqueo durante un mínimo de dos horas.

A continuación, sustituya la solución por una solución bloqueante fresca, que contenga una dilución 1:200 del anticuerpo antidigoxigenina conjugado HRB. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use TBST para enjuagar las muestras tres veces a temperatura ambiente y transfierirlas a pocillos individuales de una nueva placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.

Luego, con TBST, lave los explantes tres veces durante una hora cada uno. Utilice un kit de amplificación de señal de tiramida para visualizar el ARNm detectado antes de preparar las muestras para la obtención de imágenes. Prepare un portaobjetos de vidrio de adhesión cargado para cada par de explantes retirando el revestimiento adhesivo de un espaciador de imágenes de 0,12 mm de grosor y pegándolo en un portaobjetos de vidrio.

Después de colocar un par de explantes en el portaobjetos de acuerdo con el protocolo de texto, permita que las muestras se adhieran al portaobjetos durante 45-60 segundos, hasta que el tejido comience a parecer pegajoso y translúcido sin secarse por completo. Mientras tanto, use pinzas para quitar el revestimiento adhesivo restante del espaciador y agregue una gran gota de medio de montaje de doble función y solución de limpieza a las muestras en el centro del espaciador. Aplique un cubreobjetos circular a través de las muestras, asegurándose de que el medio de montaje esté distribuido uniformemente y que todos los bordes hagan contacto con el espaciador.

A continuación, coloque el portaobjetos boca abajo sobre un papel de baja pelusa. Presione firmemente hacia abajo para asegurarse de que el cubreobjetos se adhiera completamente al espaciador y que se elimine cualquier exceso de medio de montaje. Repita este proceso hasta que no haya más medios de montaje que manchen el papel.

Limpie y etiquete el portaobjetos y guárdelo en la oscuridad hasta obtener imágenes. A continuación, realice imágenes y análisis de acuerdo con el protocolo de texto. En este experimento, se muestra que la expresión de las proteínas Delta-Like 1 y Notch1 oscila fuera de sincronía mediante la disposición temporal de los embriones de acuerdo con la transcripción naciente del gen del reloj de segmentación regulado por Notch en la franja lunática intrónica detectada en la mitad de cada par de explantes.

Los paneles se organizan de acuerdo con las fases uno, dos y tres del ciclo de reloj de segmentación. La extensión de los dominios de expresión para Delta-Like 1, Notch1 y la franja lunática intrónica a lo largo del eje anteroposterior del PSM se demarca mediante barras codificadas por colores. Como se muestra aquí, se genera un gráfico para cuantificar la intensidad de la señal Delta-Like 1, Notch1 y lunática intrónica en relación con el eje anteroposterior del PSM e ilustra la variación axial y la intensidad de la señal a través del PSM a lo largo del ciclo del reloj.

Los cimogógrafos visualizan la distribución espacial de Delta-Like 1, Notch1 y la franja lunática intrónica en numerosos PSM. Cada fila del cimograma representa la intensidad de la señal de un explante PSM individual. La cuantificación de la intensidad de la señal Delta-Like 1, Notch1 y de la franja lunática intrónica en relación con el eje anteroposterior del PSM revela una clara dinámica de expresión oscilatoria para estos objetivos.

Finalmente, estos kymographs muestran la distribución espacial de la forma escindida y activada del receptor Notch NICD, Delta-Like 1, intronic luntic fringe y Notch1 en numerosos PSM. Esta técnica ha ayudado a los investigadores en el campo de la mitogénesis de vertebrados a comprender mejor la dinámica de la oscilación génica de la segmentación en el mesodermo presomítico de pollitos y ratones. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un gran número de muestras, lo que permite analizar simultáneamente los perfiles de expresión de varios ARNm y proteínas de interés.

Después de este procedimiento, la cuantificación adicional de los datos de la imagen puede proporcionar una comprensión de los retrasos temporales en la expresión génica, así como la localización subcelular de las señales de ARN y proteínas de interés para el investigador. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo mapear la dinámica de expresión génica espacio-temporal del reloj de segmentación de vertebrados utilizando un muestreo de tejido grueso. A esto le puede seguir el análisis automatizado de imágenes, tal y como se detalla en el protocolo de texto.

Al intentar este procedimiento, es importante garantizar una distribución equitativa de PSM, notocorda y tubo neural entre los explantes de PSM y optimizar cuidadosamente las diluciones de anticuerpos antes de comenzar. Recuerde que trabajar con formamida, paraformaldehído y glutaraldehído puede ser extremadamente peligroso. Tenga cuidado de usar equipo de protección personal y trabaje en una campana extractora cuando corresponda.