Ordenamiento temporal de los datos de expresión dinámica de la expresión espacial detallada Mapas

El objetivo general de este procedimiento experimental es mapear la dinámica espaciotemporal de la expresión génica del reloj de segmentación de vertebrados mediante el muestreo de tejidos fijados. Este método permite una evaluación imparcial de la dinámica oscilatoria de los genes en el mesodermo presomítico, lo cual es fundamental para comprender los mecanismos moleculares que regulan la somatogénesis en vertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden generar y procesar muchas muestras simultáneamente, lo que posibilita un análisis extenso en tres partes de la dinámica de la expresión génica en tejidos fijados.

La doctora Charlotte Bailey, quien fue posdoctoranda en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de obtener un cuerno uterino de ratón según el protocolo descrito en el texto, bajo un microscopio estereoscópico, utilice tijeras curvas para cortar la membrana muscular gruesa del cuerno uterino y extraer cuidadosamente cada embrión. Con tijeras curvas y pinzas finas, separe la bolsa amniótica de cada embrión.

Luego, utilizando ya sea una aguja quirúrgica o tijeras curvas, obtener el tejido de la cola de cada embrión cortando el embrión anterior a los brotes de las extremidades traseras. Colocar el tejido de la cola con el lado ventral hacia abajo. A continuación, generar pares de explantes del mesodermo paraxial (PSM) dividiendo el tejido de la cola en dos mitades a lo largo de la línea media, utilizando un movimiento suave de balanceo con la aguja.

Asegúrese de que el tubo neural, la notocorda y el tejido del MPP se dividan equitativamente entre los dos explantes. Luego, aspire con la pipeta cada explante contralateral del MPP y colóquelo en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo plástica de 35 mm, en un pequeño volumen de medio de cultivo precalentado. Coloque la placa sobre la tapa e inviértala rápidamente, de modo que el tejido del MPP quede suspendido desde la tapa en una gota colgante de medio.

Luego, cultive los explantes de la MPP en una cámara humedecida a 37 grados Celsius durante una a dos horas. Transfiera pares de explantes de la MPP a los pozos individuales de una placa de cultivo celular de 24 pozos. A continuación, agregue paraformaldehído al 4% en PBS a las muestras e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora, o a cuatro grados Celsius sobre una plataforma oscilante durante la noche.

Después de la incubación, use PBS para lavar los pocillos de la muestra a temperatura ambiente en una plataforma oscilante. Con una pipeta Pasteur de plástico fina, cambie la solución de PBS en las muestras de tres a cuatro veces. Para realizar la inmunohistoquímica, agregue 2% Triton X-100 en PBS a un explante de SMS de cada par embrionario e incube las muestras a temperatura ambiente en una plataforma oscilante durante una hora para lavarlas.

Use PBS para enjuagar brevemente las muestras. Luego, reemplace el PBS con la solución de bloqueo e incube las muestras a cuatro grados Celsius en una plataforma agitadora durante la noche. Diluya los anticuerpos primarios deseados utilizando tampón de trabajo.

En este ejemplo, se utilizan anticuerpos contra Delta-like 1 y Notch1 en una dilución de 1:25. Añada los anticuerpos a los explantes e incube las muestras en una plataforma oscilante a cuatro grados Celsius durante tres a cinco días. Tras la incubación, use PBS para lavar las muestras dos veces durante cinco a diez minutos cada vez.

A continuación, realice tres lavados con Triton X-100 al 0,3 % en PBS a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante. Después de diluir los anticuerpos secundarios en el tampón de trabajo, agregue de 250 a 500 microlitros de la solución de anticuerpos a cada pocillo de muestra, teniendo cuidado de no usar los últimos microlitros de la solución, que podrían contener agregados de anticuerpos. Cubra la placa con papel de aluminio y incube las muestras en la solución de anticuerpos secundarios a oscuras a cuatro grados Celsius durante tres a cinco días.

Después de la incubación, use PBST para lavar las muestras dos veces durante diez minutos cada vez. Luego, lave el tejido una vez con PBS a temperatura ambiente en una plataforma oscilante durante cinco minutos. Siguiendo el protocolo descrito, deshidrate e hidrate nuevamente los explantes de PSM contralaterales restantes mediante una serie de diluciones de etanol en PBST.

Añada diez microgramos por mililitro de proteinasa K en PBST al 0,1 % a los explantes e incube el tejido sin agitación durante cinco minutos. Luego, retire rápidamente la solución de proteinasa K y use PBST para enjuagar brevemente las muestras. Añada 4 % de formaldehído y 0,1 % de glutaraldehído en PBST a los explantes de PSM para postfijarlos e incube las muestras durante 30 minutos.

Luego, después de usar PBST para lavar las muestras dos veces durante diez minutos cada vez, agregue mezcla de hibridación al 50 % al tejido e incube a 65 grados Celsius sin agitación durante diez minutos. Después de incubar las muestras y la mezcla de hibridación según el protocolo descrito, retire la solución y agregue de 0,25 a 0,5 mililitros de mezcla de hibridación precalentada que contenga una sonda de ARN antisentido marcada con digoxigenina contra un componente conocido del reloj de segmentación. Use cinta adhesiva para sellar la placa e incube las muestras a 65 grados Celsius durante dos noches.

Después de la incubación, use una mezcla de hibridación precalentada al 50 % en TBST para lavar las muestras durante 15 minutos. Luego, enjuague las muestras con TBST dos veces antes de incubar el tejido en TBST a temperatura ambiente en una plataforma agitadora durante 30 minutos. A continuación, preincube los explantes en la solución bloqueadora durante un mínimo de dos horas.

A continuación, sustituya la solución por una solución de bloqueo fresca, que contenga una dilución 1:200 del anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con HRB. Incube las muestras a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use TBST para enjuagar las muestras tres veces a temperatura ambiente y transfiéralas a pozos individuales de una nueva placa de cultivo de tejidos de 24 pozos.

Luego, lave los explantes tres veces con TBST durante una hora cada vez. Utilice un kit de amplificación de señal con tiramida para visualizar el ARNm detectado antes de preparar las muestras para la obtención de imágenes. Prepare un portaobjetos de vidrio con carga para cada par de explantes retirando el revestimiento adhesivo de un espaciador de imagen de 0,12 mm de espesor y colocándolo sobre un portaobjetos de vidrio.

Después de colocar un par de explantes sobre el portaobjetos según el protocolo descrito, permita que las muestras se adhieran al portaobjetos durante 45-60 segundos, hasta que el tejido comience a verse pegajoso y translúcido sin secarse por completo. Mientras tanto, utilice pinzas para retirar el forro adhesivo restante del espaciador y agregue una gota grande de medio de montaje de función dual y solución de aclarado a las muestras en el centro del espaciador. Coloque un cubreobjetos circular sobre las muestras asegurándose de que el medio de montaje se distribuya uniformemente y de que todos los bordes hagan contacto con el espaciador.

Luego, coloque la laminilla boca abajo sobre un papel de baja pelusa. Presione firmemente para asegurarse de que la laminilla se adhiera completamente al espaciador y de que se elimine cualquier exceso de medio de montaje. Repita este proceso hasta que ya no salga medio de montaje sobre el papel.

Limpie y etiquete el portaobjetos y guárdelo en la oscuridad hasta la obtención de imágenes. Luego, realice la obtención de imágenes y el análisis según el protocolo descrito en el texto. En este experimento, se muestra que la expresión de las proteínas Delta-Like 1 y Notch1 oscila fuera de sincronía al organizar temporalmente los embriones según la transcripción incipiente del gen del reloj de segmentación regulado por Notch, lunatic fringe intrónico, detectada en una mitad de cada par de explantes.

Los paneles están dispuestos según la fase uno, dos y tres del ciclo del reloj de segmentación. La extensión de los dominios de expresión de Delta-Like 1, Notch1 y lunatic fringe intrónico a lo largo del eje anteroposterior del mesodermo preesomítico (PSM) está delimitada por barras codificadas por colores. Como se muestra aquí, se genera una gráfica para cuantificar la intensidad de la señal de Delta-Like 1, Notch1 y lunatic fringe intrónico en relación con el eje anteroposterior del PSM, y muestra la variación axial y la intensidad de la señal a través del PSM durante todo el ciclo del reloj.

Los cinescopios visualizan la distribución espacial de Delta-Like 1, Notch1 y lunatic fringe intrónico en numerosos PSM. Cada fila del cinescopio representa la intensidad de señal de un explante individual de PSM. La cuantificación de la intensidad de señal de Delta-Like 1, Notch1 y lunatic fringe intrónico en relación con el eje anteroposterior del PSM revela dinámicas claras de expresión oscilatoria para estos objetivos.

Finalmente, estos cinescopios muestran la distribución espacial de la forma escindida y activada del receptor Notch NICD, Delta-Like 1, lunatic fringe intrónico y Notch1 en numerosos mesodermos pre-somíticos. Esta técnica ha ayudado a los investigadores en el campo de la mitogénesis de vertebrados a comprender mejor la dinámica de oscilación de los genes de segmentación en el mesodermo pre-somítico de pollo y ratón. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un gran número de muestras, lo que permite analizar simultáneamente los perfiles de expresión de varios ARNm y proteínas de interés.

Después de seguir este procedimiento, una cuantificación adicional de los datos de imagen puede proporcionar una comprensión de los retrasos temporales en la expresión génica, así como de la localización subcelular de las señales de ARN y proteína de interés para el investigador. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trazar la dinámica espaciotemporal de la expresión génica del reloj de segmentación de vertebrados mediante el muestreo de tejidos gruesos. Esto puede seguirse con un análisis automatizado de imágenes, como se detalla en el protocolo escrito.

Al realizar este procedimiento, es importante asegurar una distribución equitativa del mesodermo paraxial, notocorda y tubo neural entre los explantes de mesodermo paraxial y optimizar cuidadosamente las diluciones de los anticuerpos antes de comenzar. Recuerde que trabajar con formamida, paraformaldehído y glutaraldehído puede ser extremadamente peligroso. Tenga cuidado de usar equipo de protección personal y trabaje en una campana extractora cuando sea necesario.