El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas
29 de marzo de 2017
La PCR de bloqueo de tipo salvaje seguida de secuenciación directa ofrece un método altamente sensible de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras.
El objetivo general de este procedimiento es detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras. Esta metodología puede ayudar a responder preguntas clave en las pruebas de mutaciones somáticas al facilitar la detección de mutaciones de muy baja frecuencia. Aquí buscaremos mutaciones en el gen myd88 en muestras de médula ósea.
La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información muy precisa y sensible sobre la presencia de mutaciones somáticas, incluso con muy pocas células neoplásicas. Este ensayo de secuenciación basado en PCR de bloqueo de tipo salvaje se desarrolló para amplificar parte del exón cinco en el gen myd88, lo que garantiza la cobertura del punto caliente L265. Los cebadores hacia adelante y hacia atrás se diseñaron con una secuencia M13 de cinco números primos para permitir que los cebadores de secuenciación complementarios se arrodillaran.
Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga aproximadamente de 10 a 15 bases de longitud y complemente la plantilla de tipo salvaje donde se desea el enriquecimiento mutante. Un oligonucleótido más corto mejorará la discriminación de desajustes. Para lograr una alta especificidad del objetivo, es importante no utilizar demasiado nucleótidos bloqueantes, ya que esto dará lugar a oligonucleótidos muy pegajosos.
Para diseñar el oligonucleótido bloqueante, comience navegando al sitio web de Oligo Tools. Seleccione la herramienta de predicción Oligo TM. Se abrirá una nueva ventana.
Pegue la secuencia de la plantilla de tipo salvaje que se va a bloquear en el cuadro de secuencia de oligonucleótidos. Agregue un signo más delante de las bases de los bloqueadores para marcarlos. Haga clic en el botón calcular para determinar la TM aproximada del híbrido bloqueador del ADN.
Las temperaturas de fusión calculadas aparecerán en los cuadros a continuación. Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga una temperatura de fusión de 10 a 15 grados Celsius por encima de la temperatura de extensión durante el termociclado. Aquí, la temperatura de extensión es de 72 grados centígrados.
Para ajustar la temperatura de fusión, agregue, retire o sustituya las bases de bloqueo. Evite tramos largos de tres a cuatro bases de bloqueo C o G. A continuación, para evitar la formación de estructuras secundarias o la autodimerización, vuelva a la pantalla de inicio del sitio web de Oligo Tools y seleccione la herramienta Oligo Optimizer.
Se abrirá una nueva ventana. Pegue la secuencia de la plantilla de tipo salvaje que se va a bloquear en el cuadro. Agregue un signo más para indicar las bases de bloqueo.
Seleccione las dos casillas para estructura secundaria y solo uno mismo y presione el botón analizar para ver las puntuaciones de hibridación y estructura secundaria. Estas puntuaciones representan estimaciones muy aproximadas de las temperaturas de fusión de los dímeros propios y las estructuras secundarias, respectivamente. Las puntuaciones más bajas son óptimas y se pueden lograr limitando el emparejamiento de bloqueadores.
Elimine o reposicione los nucleótidos de bloqueo para lograr puntuaciones más bajas. El nucleótido oligonucleudo bloqueador optimizado para myd88 que se muestra aquí logra un equilibrio entre la temperatura de fusión del híbrido bloqueador del ADN y las puntuaciones de hibridación y estructura secundaria lo suficientemente bajas. Fue diseñado para cubrir los aminoácidos Q262 a I266, y presenta un DT invertido de tres primos para inhibir tanto la extensión por la ADN polimerasa como la degradación por tres exonucleasas principales.
Una vez que se hayan diseñado los cebadores, configure la PCR de bloqueo de tipo salvaje y realice el termociclado como se describe en el documento adjunto. Retire las perlas magnéticas del almacenamiento a cuatro grados centígrados y llévelas a temperatura ambiente. Transfiera 10 microlitros del producto de PCR a una nueva placa de PCR.
Agite las perlas magnéticas vigorosamente para resuspender completamente las partículas magnéticas y luego agregue 18 microlitros de perlas magnéticas a cada pocillo en la nueva placa. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. A continuación, incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Después de la incubación, coloque la placa de PCR en la placa magnética con faldón lateral durante dos minutos para separar las perlas de la solución. Utilice una pipeta multicanal para aspirar el sobrenadante. Tenga cuidado de evitar la bolita de cuentas.
A continuación, dispense 150 microlitros de etanol al 70% en cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante al menos 30 segundos. A continuación, aspire el etanol con una pipeta multicanal y deseche las puntas. Repita este procedimiento de lavado una vez más.
Con una pipeta multicanal de 20 microlitros, aspire el etanol restante de cada pocillo y deseche las puntas. Después de dejar unos 10 minutos para que se sequen los pocillos de la placa, retírelo del imán y agregue 40 microlitros de agua libre de nucleasa a cada pocillo. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 15 veces para mezclar.
A continuación, incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de la incubación, vuelva a colocar la placa de PCR en la placa magnética durante un minuto para separar las perlas de la solución. Transfiera 35 microlitros de producto purificado a una nueva placa de PCR y realice la secuenciación bidireccional como se describe en el documento adjunto.
Una vez realizada la secuenciación bidireccional para purificar los productos de secuenciación, se prepare una solución fresca en 25 de acetato de sodio tres molares a PH 5,2 y etanol al 100%. Prepare también una solución fresca de etanol al 70%. A cada pocillo de las placas de secuenciación directa e inversa, agregue 30 microlitros de acetato de sodio en etanol al 100% y pipetee hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar.
Luego vuelva a sellar la placa e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez transcurridos 20 minutos, centrifugar la placa a 2.250 veces G durante 15 minutos. Después de centrifugar, retire el sellador de placas e invierta la placa una vez sobre un contenedor de desechos.
Si la placa se invierte varias veces, los gránulos pueden aflojarse del fondo del pozo. Coloque la placa invertida sobre una toalla de papel limpia y centrifugue a 150 veces G durante un minuto. A continuación, agregue 150 microlitros de etanol al 70% a cada pocillo y vuelva a sellar la placa.
Girar a 2, 250 veces G durante cinco minutos. Luego repita el proceso de quitar el sellador de placas e invertir la placa. Si los pozos no están completamente secos, déjelos secar al aire a temperatura ambiente.
Asegúrese de que las muestras estén protegidas de la luz. Una vez que los pocillos estén completamente secos, agregue 10 microlitros de formamida a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Vuelva a sellar la placa.
Desnaturalice usando un termociclador a 95 grados Celsius durante tres minutos, seguido de cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de desnaturalizar, reemplace el sellador de placas con un septo y secuencia en una plataforma de secuenciación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el software de análisis de secuencias, visualice las trazas y alinee las secuencias con las secuencias de referencia adecuadas.
Alinee myd88 con la secuencia de referencia NCBI NM002468. El ADN genómico de pacientes con y sin mutaciones se sometió a una PCR de bloqueo convencional y de tipo salvaje y luego se secuenciaron los productos de PCR resultantes. Como se puede ver aquí, el alelo mutante se enriqueció cuando se realizó la PCR de bloqueo de tipo salvaje, y no se observaron falsos positivos en el ADN de tipo salvaje.
A menudo se observa una caída característica en la intensidad de la señal, como se muestra aquí, si se utiliza una concentración demasiado alta de bloqueador, o si la purificación posterior a la PCR no logró eliminar el bloqueador antes de la secuenciación bidireccional. Esto ocurre cuando la purificación enzimática se realiza en lugar de la purificación magnética de perlas. Cualquier ensayo basado en PCR que enriquezca los alelos mutantes detectará artefactos de baja frecuencia.
Estos rastros muestran un aumento en los artefactos de secuenciación de CG, en relación con los artefactos de TA en el tejido FFPE cuando la citosina o la citosina metilada se desaminan mediante infijación formal a uracilo o tiamina, respectivamente. La ADN glicosilasa de uracilo o UDG puede extirpar el uracilo antes de la PCR de bloqueo de tipo salvaje, lo que ayuda a reducir los artefactos de secuenciación. Sin embargo, la tiamina resultante de la cinco metil citosina desaminada, que se encuentra con frecuencia en las islas CPG, no puede ser extirpada por UDG.
La disminución de la concentración de bloqueador utilizada en la PCR de bloqueo de tipo salvaje puede ayudar a reducir la aparición de artefactos de secuenciación que no se remedian con el tratamiento con UDG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar mutaciones somáticas con un alto grado de precisión y sensibilidad, utilizando la técnica de bloqueo de tipo salvaje. El principio de esta tecnología se puede aplicar a la detección de mutaciones en pequeñas subpoblaciones de células.
Por lo tanto, es útil para detectar la enfermedad residual mínima, monitorizar a los pacientes y predecir la recaída temprana en pacientes con diversas neoplasias.
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Descripción general
Este artículo describe un método para detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia mediante PCR con bloqueo del tipo silvestre seguida de secuenciación directa. La técnica es particularmente eficaz para analizar muestras de médula ósea en busca de mutaciones en el gen myd88.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Oncología
- Biología molecular
Antecedentes
- Las mutaciones somáticas pueden ocurrir en bajas frecuencias en diversos tejidos.
- La detección de estas mutaciones es crucial para comprender la biología del cáncer.
- Los métodos tradicionales pueden carecer de la sensibilidad necesaria para la detección de bajas frecuencias.
- La PCR con bloqueo de tipo silvestre ofrece un enfoque novedoso para mejorar las capacidades de detección.
Objetivo del estudio
- Mejorar la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia.
- Dirigirse específicamente a mutaciones en el gen myd88.
- Validar la eficacia del método de PCR con bloqueo del tipo silvestre.
Métodos Utilizados
- Se empleó la PCR de bloqueo de tipo silvestre para amplificar regiones génicas específicas.
- Se realizó secuenciación directa para identificar mutaciones.
- Se analizaron muestras de médula ósea para detectar la presencia de mutaciones.
- Se diseñaron cebadores para asegurar la cobertura del punto caliente L265 en el exón cinco.
Resultados principales
- El método detectó con éxito mutaciones de baja frecuencia en muestras de médula ósea.
- Se logró una alta sensibilidad y precisión en la identificación de mutaciones somáticas.
- Los resultados confirmaron la presencia de mutaciones en el gen myd88.
- La técnica demostró potencial para aplicaciones más amplias en las pruebas de mutaciones.
Conclusiones
- La PCR de bloqueo de tipo silvestre es una herramienta valiosa para detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia.
- Este método puede mejorar nuestra comprensión de las alteraciones genéticas en el cáncer.
- Investigaciones futuras podrían ampliar su uso en entornos clínicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia es fundamental para el monitoreo de la enfermedad residual mínima, la identificación de resistencias emergentes y la orientación de decisiones terapéuticas en el desarrollo de fármacos oncológicos. El método de PCR con bloqueo del tipo silvestre mejora la sensibilidad hasta aproximadamente 1 alelo mutante por cada 1.000 alelos de tipo silvestre, lo que permite la detección temprana de la evolución tumoral. Esta capacidad mejora la confianza predictiva en estudios preclínicos y traslacionales al permitir una evaluación confiable de la heterogeneidad genética en muestras con cantidades limitadas, como células tumorales circulantes o aspirados de médula ósea.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de alelos mutantes de baja abundancia en muestras heterogéneas.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante la cuantificación precisa de la carga de mutaciones en modelos preclínicos.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en los estudios de modulación de dianas al reducir las tasas de falsos negativos en la detección de mutaciones.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera resultados cuantitativos de secuenciación que distinguen mutaciones verdaderas de baja frecuencia del ruido de fondo.
- Valor operativo: Produce amplicones enriquecidos en mutantes estandarizados y reproducibles, adecuados para flujos de trabajo de secuenciación posteriores.
- Utilidad de la plataforma: Facilita la escalabilidad y reutilización del ensayo en múltiples dianas génicas mediante el diseño adaptable de oligonucleótidos bloqueantes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la continuidad traslacional mediante la detección de mutaciones en sistemas relevantes para enfermedades, como muestras de médula ósea.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de la frecuencia del alelo mutante para evaluar la respuesta terapéutica y la aparición de resistencia.
- Reducción de riesgos: Apoya las decisiones preclínicas de continuar o no continuar al proporcionar umbrales medibles para la evolución clonal.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas preclínicas de eficacia, especialmente cuando el monitoreo de alteraciones genéticas guía la selección del compuesto.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir la detección de mutaciones somáticas en vías génicas de interés.
- Detección: Proporciona productos de PCR purificados y listos para ensayos, con menor interferencia del tipo silvestre, para una identificación fiable de variantes.
- Análisis: Ofrece lecturas de secuenciación bidireccionales que permiten la visualización y cuantificación específicas de alelos.
- Investigación Traslacional: Se conecta con la alineación de biomarcadores mediante el seguimiento de mutaciones en tipos de muestras clínicamente relevantes.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma modular de detección aplicable a múltiples oncogenes más allá de MYD88.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la detección de mutaciones y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de resistencia.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad del ensayo mediante la purificación basada en perlas y el diseño controlado de oligonucleótidos de bloqueo.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas de continuar/no continuar al posibilitar la detección temprana de mutaciones que confieren resistencia.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al identificar clones resistentes de baja frecuencia antes de su expansión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de oligonucleótidos y en la optimización de la temperatura de fusión para lograr un bloqueo eficaz del tipo silvestre.
- Depende del acceso a cicladores térmicos, sistemas de purificación con perlas magnéticas y plataformas de secuenciación bidireccionales.
- Necesita la estandarización de la concentración del oligonucleótido bloqueante para minimizar los artefactos de secuenciación.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes tipos de muestras, como tejido FFPE o biopsias líquidas.
- Incluye limitaciones prácticas, como la posibilidad de artefactos de secuenciación residuales derivados de eventos de desaminación que no son completamente resueltos por la uracil ADN glicosilasa.
