El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

El objetivo general de este procedimiento es detectar mutaciones somáticas de baja frecuencia en una variedad de tipos de muestras. Esta metodología puede ayudar a responder preguntas clave en las pruebas de mutaciones somáticas al facilitar la detección de mutaciones de muy baja frecuencia. Aquí buscaremos mutaciones en el gen myd88 en muestras de médula ósea.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información muy precisa y sensible sobre la presencia de mutaciones somáticas, incluso con muy pocas células neoplásicas. Este ensayo de secuenciación basado en PCR de bloqueo de tipo salvaje se desarrolló para amplificar parte del exón cinco en el gen myd88, lo que garantiza la cobertura del punto caliente L265. Los cebadores hacia adelante y hacia atrás se diseñaron con una secuencia M13 de cinco números primos para permitir que los cebadores de secuenciación complementarios se arrodillaran.

Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga aproximadamente de 10 a 15 bases de longitud y complemente la plantilla de tipo salvaje donde se desea el enriquecimiento mutante. Un oligonucleótido más corto mejorará la discriminación de desajustes. Para lograr una alta especificidad del objetivo, es importante no utilizar demasiado nucleótidos bloqueantes, ya que esto dará lugar a oligonucleótidos muy pegajosos.

Para diseñar el oligonucleótido bloqueante, comience navegando al sitio web de Oligo Tools. Seleccione la herramienta de predicción Oligo TM. Se abrirá una nueva ventana.

Pegue la secuencia de la plantilla de tipo salvaje que se va a bloquear en el cuadro de secuencia de oligonucleótidos. Agregue un signo más delante de las bases de los bloqueadores para marcarlos. Haga clic en el botón calcular para determinar la TM aproximada del híbrido bloqueador del ADN.

Las temperaturas de fusión calculadas aparecerán en los cuadros a continuación. Diseñe el oligonucleótido de bloqueo para que tenga una temperatura de fusión de 10 a 15 grados Celsius por encima de la temperatura de extensión durante el termociclado. Aquí, la temperatura de extensión es de 72 grados centígrados.

Para ajustar la temperatura de fusión, agregue, retire o sustituya las bases de bloqueo. Evite tramos largos de tres a cuatro bases de bloqueo C o G. A continuación, para evitar la formación de estructuras secundarias o la autodimerización, vuelva a la pantalla de inicio del sitio web de Oligo Tools y seleccione la herramienta Oligo Optimizer.

Se abrirá una nueva ventana. Pegue la secuencia de la plantilla de tipo salvaje que se va a bloquear en el cuadro. Agregue un signo más para indicar las bases de bloqueo.

Seleccione las dos casillas para estructura secundaria y solo uno mismo y presione el botón analizar para ver las puntuaciones de hibridación y estructura secundaria. Estas puntuaciones representan estimaciones muy aproximadas de las temperaturas de fusión de los dímeros propios y las estructuras secundarias, respectivamente. Las puntuaciones más bajas son óptimas y se pueden lograr limitando el emparejamiento de bloqueadores.

Elimine o reposicione los nucleótidos de bloqueo para lograr puntuaciones más bajas. El nucleótido oligonucleudo bloqueador optimizado para myd88 que se muestra aquí logra un equilibrio entre la temperatura de fusión del híbrido bloqueador del ADN y las puntuaciones de hibridación y estructura secundaria lo suficientemente bajas. Fue diseñado para cubrir los aminoácidos Q262 a I266, y presenta un DT invertido de tres primos para inhibir tanto la extensión por la ADN polimerasa como la degradación por tres exonucleasas principales.

Una vez que se hayan diseñado los cebadores, configure la PCR de bloqueo de tipo salvaje y realice el termociclado como se describe en el documento adjunto. Retire las perlas magnéticas del almacenamiento a cuatro grados centígrados y llévelas a temperatura ambiente. Transfiera 10 microlitros del producto de PCR a una nueva placa de PCR.

Agite las perlas magnéticas vigorosamente para resuspender completamente las partículas magnéticas y luego agregue 18 microlitros de perlas magnéticas a cada pocillo en la nueva placa. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. A continuación, incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Después de la incubación, coloque la placa de PCR en la placa magnética con faldón lateral durante dos minutos para separar las perlas de la solución. Utilice una pipeta multicanal para aspirar el sobrenadante. Tenga cuidado de evitar la bolita de cuentas.

A continuación, dispense 150 microlitros de etanol al 70% en cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante al menos 30 segundos. A continuación, aspire el etanol con una pipeta multicanal y deseche las puntas. Repita este procedimiento de lavado una vez más.

Con una pipeta multicanal de 20 microlitros, aspire el etanol restante de cada pocillo y deseche las puntas. Después de dejar unos 10 minutos para que se sequen los pocillos de la placa, retírelo del imán y agregue 40 microlitros de agua libre de nucleasa a cada pocillo. Pipetea hacia arriba y hacia abajo 15 veces para mezclar.

A continuación, incubar a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de la incubación, vuelva a colocar la placa de PCR en la placa magnética durante un minuto para separar las perlas de la solución. Transfiera 35 microlitros de producto purificado a una nueva placa de PCR y realice la secuenciación bidireccional como se describe en el documento adjunto.

Una vez realizada la secuenciación bidireccional para purificar los productos de secuenciación, se prepare una solución fresca en 25 de acetato de sodio tres molares a PH 5,2 y etanol al 100%. Prepare también una solución fresca de etanol al 70%. A cada pocillo de las placas de secuenciación directa e inversa, agregue 30 microlitros de acetato de sodio en etanol al 100% y pipetee hacia arriba y hacia abajo cinco veces para mezclar.

Luego vuelva a sellar la placa e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez transcurridos 20 minutos, centrifugar la placa a 2.250 veces G durante 15 minutos. Después de centrifugar, retire el sellador de placas e invierta la placa una vez sobre un contenedor de desechos.

Si la placa se invierte varias veces, los gránulos pueden aflojarse del fondo del pozo. Coloque la placa invertida sobre una toalla de papel limpia y centrifugue a 150 veces G durante un minuto. A continuación, agregue 150 microlitros de etanol al 70% a cada pocillo y vuelva a sellar la placa.

Girar a 2, 250 veces G durante cinco minutos. Luego repita el proceso de quitar el sellador de placas e invertir la placa. Si los pozos no están completamente secos, déjelos secar al aire a temperatura ambiente.

Asegúrese de que las muestras estén protegidas de la luz. Una vez que los pocillos estén completamente secos, agregue 10 microlitros de formamida a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Vuelva a sellar la placa.

Desnaturalice usando un termociclador a 95 grados Celsius durante tres minutos, seguido de cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Después de desnaturalizar, reemplace el sellador de placas con un septo y secuencia en una plataforma de secuenciación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el software de análisis de secuencias, visualice las trazas y alinee las secuencias con las secuencias de referencia adecuadas.

Alinee myd88 con la secuencia de referencia NCBI NM002468. El ADN genómico de pacientes con y sin mutaciones se sometió a una PCR de bloqueo convencional y de tipo salvaje y luego se secuenciaron los productos de PCR resultantes. Como se puede ver aquí, el alelo mutante se enriqueció cuando se realizó la PCR de bloqueo de tipo salvaje, y no se observaron falsos positivos en el ADN de tipo salvaje.

A menudo se observa una caída característica en la intensidad de la señal, como se muestra aquí, si se utiliza una concentración demasiado alta de bloqueador, o si la purificación posterior a la PCR no logró eliminar el bloqueador antes de la secuenciación bidireccional. Esto ocurre cuando la purificación enzimática se realiza en lugar de la purificación magnética de perlas. Cualquier ensayo basado en PCR que enriquezca los alelos mutantes detectará artefactos de baja frecuencia.

Estos rastros muestran un aumento en los artefactos de secuenciación de CG, en relación con los artefactos de TA en el tejido FFPE cuando la citosina o la citosina metilada se desaminan mediante infijación formal a uracilo o tiamina, respectivamente. La ADN glicosilasa de uracilo o UDG puede extirpar el uracilo antes de la PCR de bloqueo de tipo salvaje, lo que ayuda a reducir los artefactos de secuenciación. Sin embargo, la tiamina resultante de la cinco metil citosina desaminada, que se encuentra con frecuencia en las islas CPG, no puede ser extirpada por UDG.

La disminución de la concentración de bloqueador utilizada en la PCR de bloqueo de tipo salvaje puede ayudar a reducir la aparición de artefactos de secuenciación que no se remedian con el tratamiento con UDG. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo probar mutaciones somáticas con un alto grado de precisión y sensibilidad, utilizando la técnica de bloqueo de tipo salvaje. El principio de esta tecnología se puede aplicar a la detección de mutaciones en pequeñas subpoblaciones de células.

Por lo tanto, es útil para detectar la enfermedad residual mínima, monitorizar a los pacientes y predecir la recaída temprana en pacientes con diversas neoplasias.