Name: La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a caracterizar la conectividad estructural y la excitabilidad de neuronas corticales mediante electroporación in utero. Este método permite el etiquetado de poblaciones neuronales dispersas para análisis cuantitativo detallado.

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Estamos muy agradecidos a R. Gutiérrez y A. Morales por su excelente asistencia técnica y a LA Weiss para su edición. CGB está financiado por el Ministerio español de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación BBVA y SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete y por una beca de la Fundación Ramón Areces y subvenciones SAF2014-52119-R y BFU2014-55738-Redt (de MINECO) a M. Nieto.

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<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
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<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
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<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este protocolo describe con detalle cómo etiquetar las neuronas de la corteza somatosensorial de / 6 ratones C75BL con el fin de analizar su conectividad y su excitabilidad. Con respecto a los métodos existentes, visualiza los aspectos discriminatorios de conectividad, tales como el número de ramas axonales por neurona, su topografía precisa, y su localización anatómica. Mediante la alteración de la posición de los electrodos, es posible apuntar a otras poblaciones de neuronas, tales como la corteza cingulada (mantener ...

El desarrollo de estructuras dendríticas y axonales es una faceta importante de la regulación del circuito en el sistema nervioso, incluyendo en la corteza cerebral. Desempeña un papel crítico durante el cableado selectiva de las diversas subpoblaciones neuronales. Varios informes recientes han demostrado que, además de la conectividad, la diversidad molecular de las neuronas se refleja por la adquisición de modos muy específicos de disparo. Sin embargo, los mecanismos que determinan la excitabilidad y la conectividad de los subtipos neuronales distintas durante el desarrollo, así como su grado de coordinación, son aún poco conocidos 1, 2. In vivo deficitaria y ganancia de función analiza permite el estudio de la relación entre el nivel de expresión de genes específicos y su influencia en el desarrollo del circuito. Electroporación en el útero (IUE) es una técnica ampliamente utilizada para estudiarla función de un gen de interés en las poblaciones neuronales específicas y para estudiar los patrones generales de su conectividad. Sin embargo, para determinar las características morfológicas de los axones y dendritas en las capas corticales en ratones vivos, es esencial para etiquetar las neuronas escasamente. Un sistema de recombinación Cre combinado con IUE puede ser utilizado para marcar una población escasa de las neuronas a una densidad suficientemente baja para resolver las proyecciones emitidas por las células individuales de las láminas corticales identificados. Este método etiquetas de un número suficiente de neuronas por la corteza para obtener datos cuantitativos después del análisis de un número razonable de los cerebros de electroporación (Figura 1). Este manuscrito presenta un método para tal análisis fino de la conectividad. También presenta una estrategia similar para analizar, en experimentos separados, las propiedades eléctricas de las neuronas mediante la realización de grabaciones de corriente-clamp en la proteína de fluorescencia verde (GFP) -electroporated células de rodajas corticales agudas. estos protocoles son versátiles y pueden aplicarse al estudio de la excitabilidad y la conectividad de las neuronas de los animales WT y transgénicos, y también de las neuronas en el que las pérdidas y ganancias de la función se introducen por los plásmidos adicionales durante IUE. Aunque este protocolo describe la electroporación de los ratones en el día embrionario (E) 15,5, esta técnica se puede realizar a cualquier edad entre E9.5 y 3 días postnatal (P) 2 4. Mientras que en las primeras etapas de la electroporación se dirige a las neuronas y los precursores del tálamo y las capas profundas de la corteza, una etapa más avanzada marcas de electroporación capas más superficiales (por ejemplo, neuronas E15.5 IUE capa objetivos II-III). En resumen, la combinación de IUE con análisis morfológico de una sola célula y electrofisiología es una herramienta útil para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la enorme diversidad estructural y funcional de las neuronas en el sistema nervioso.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmmido Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Yodada Meda</td><td>694109.6</td><td></td><td>Pomada</td></tr><tr><td>Ocular (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí # 3 - 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí # 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson dentadas - Rectas 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas endurecidas - Rectas 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Mezenbaum-Nelson Curvadas L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Puntas curvas finas - Estilo 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mathieu Portaagujas -</td><td>Dentado Fino Herramientas</td><td>de ciencia 12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de AutoClip</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Suturas - Maquinilla de afeitar eléctrica Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato (100 mm, 1,0/0,58 diámetro exterior/interior)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gauze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón (Star Cott)</td><td></td><td>Albasa-Aguja</td><td></td></tr> <tr><td>25 g (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compuesto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticuerpo policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de platino 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp; para imagen fluorescente - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Vaporizador de isofluorano</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de escaneo láser</td><td></td> <td>Leica-Axiovert</td><td></td></tr> <tr><td>200 Microscopio</td><td>Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td></td> Leica-P-97 <td></td> Extractor de <td></td></tr><tr><td>micropette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de abrazaderas de parche softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>Dispositivos</td> <td>moleculares-Software</td><td></td></tr> <tr><td>de adquisición (MultiClamp 700B Amplifier)</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado + Base giratoria&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aire</td><td>Newport-Bombas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>peristálticas en miniatura</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

la electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y conectividad una sola célula

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

El sistema nervioso se compone de una enorme gama de tipos neuronales distintas. Estas subpoblaciones neuronales se caracterizan por, entre otras características, sus morfologías dendríticas distintas, sus patrones específicos de conectividad axonal, y sus respuestas de disparo selectivo. Los mecanismos moleculares y celulares responsables de estos aspectos de la diferenciación durante el desarrollo son aún poco conocidos. A continuación, describimos los protocolos combinados para el etiquetado y la caracterización de la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales. Modificación del protocolo de electroporación en el útero (IUE) permite el etiquetado de una población escasa de las neuronas. Esto, a su vez, permite la identificación y el seguimiento de las dendritas y axones de las neuronas individuales, la caracterización precisa de la ubicación laminar de proyecciones axonales, y el análisis morfométrico. IUE también se puede utilizar para investigar los cambios en la excitabilidad de lasDe tipo salvaje (WT) o neuronas genéticamente modificadas mediante la combinación con células enteras de grabación de rodajas agudas de cerebros electroporación. Estas dos técnicas contribuyen a una mejor comprensión del acoplamiento de la conectividad estructural y funcional y de los mecanismos moleculares que controlan la diversidad neuronal durante el desarrollo. Estos procesos de desarrollo tienen importantes implicaciones en el cableado axonal, la diversidad funcional de las neuronas, y la biología de los trastornos cognitivos.

Para caracterizar los cambios morfológicos de las neuronas en detalle y en todo el desarrollo, es esencial para etiquetar las neuronas escasamente. Un sistema Cre-recombinasa diluido permite la expresión de un gen de interés en una población escasa de las neuronas, de modo que sólo aquellas neuronas que incorporan esta enzima expresan GFP (Figura 1A). Con esta estrategia, la capa II-III está dirigido y etiquetado por IUE en E15.5. CAG-DsRed2 en 1 g / l, es co-electropora...

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

El objetivo general de este enfoque de electroporación in utero es caracterizar la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales en condiciones normales y experimentales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la neurobiología del desarrollo, como analizar la estructura y la conectividad funcional del cerebro y la biología de los trastornos cognitivos. La principal ventaja de esta técnica es que permite marcar una población escasa de neuronas y facilita el trazado de las dendritas y el acceso a neuronas individuales, lo que conduce a un análisis cuantitativo más eficiente y más fiel.Antes de la inyección, prepare diez microlitros de mezcla de ADN por cirugía, ya sea para etiquetado de una sola célula o para un estudio estándar de parche de voltaje. Luego, manipule suavemente los embriones con los dedos para localizar el telencéfalo. A continuación, coloque una micropipeta de borosilicato preparada en una pipeta de boca.Pase la punta de la aguja a través del útero, evitando los vasos sanguíneos, hasta que alcance el ventrículo lateral. Después, inyecte lentamente aproximadamente un microlitro de solución de ADN teñida con verde rápido hasta

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Investigación

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Neurociencia

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

El control de la expansión de células madre somáticas es un factor importante que impide su estudio y uso en terapia. Aquí se describe un sistema para controlar temporalmente madre neural expansión células durante el desarrollo y la edad adulta, que se puede utilizar para aumentar el número de neuronas generadas en el cerebro de ratón.

La expansión de las células madre embrionarias y adultas neurales por<em&gt; In Utero</em&gt; La electroporación o inyección estereotáxica Viral

Este artículo describe en detalle un protocolo para electroporar en el útero de la corteza cerebral y el hipocampo en E14.5 en ratones. También se muestra que este es un método valioso para estudiar las dendritas y espinas en estas dos regiones cerebrales.

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

El video muestra un método para estudiar la excitabilidad de las células neuronales que expresan proteínas fluorescentes utilizando una pinza amperimétrica de parche de célula completa. En el modo de pinza de corriente, se generan potenciales de acción indicativos de excitabilidad neuronal.

Estudio de la excitabilidad de las neuronas fluorescentes utilizando una pinza de parche de célula completa

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que...

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Este procedimiento muestra cómo dirigirse a las interneuronas en el prosencéfalo del ratón en desarrollo mediante electroporación en el útero. Esta técnica fue particularmente eficiente para lograr la expresión génica selectiva en subtipos de interneuronas destinadas a las capas superficiales de la corteza.

-Subtipo selectivo electroporación de interneuronas corticales

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Aprende a caracterizar la conectividad estructural y la excitabilidad de neuronas corticales mediante electroporación in utero. Este método permite el etiquetado de poblaciones neuronales dispersas para análisis cuantitativo detallado.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula (Video) | JoVE Journal

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

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