La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

El objetivo general de este enfoque de electroporación en el útero es caracterizar la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales en condiciones normales y experimentales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la neurobiología del desarrollo, como diseccionar la estructura y la conectividad funcional del cerebro y la biología de los trastornos cognitivos. La principal ventaja de esta técnica es que permite el marcado de una población dispersa de neuronas y permite vestir las dendritas y acceder a las neuronas individuales, lo que conduce a un análisis cuantitativo más eficiente y más fimético.

Antes de la inyección, prepare diez microlitros de mezcla de ADN por cirugía para el marcaje de una sola célula o el estudio estándar de pinza de parche. A continuación, manipula los embriones suavemente con los dedos para localizar el telencéfalo. A continuación, coloque un capilar de borosilicato preparado en una pipeta bucal.

Pasar la punta de la aguja a través del útero, evitando los vasos sanguíneos, hasta llegar al ventrículo lateral. Después de eso, inyecte lentamente aproximadamente un microlitro de solución de ADN de color Fast Green hasta que se observe una gran mancha azul. Un paso crítico en este procedimiento es la inyección del ADN.

Esto debe hacerse con la mayor delicadeza posible. Ahora, coloque los electrodos de platino de siete milímetros lateralmente en la cabeza de un embrión y aplique voltaje a través de los electrodos de platino. En este procedimiento, se crioprotegen los cerebros fijos en diez mililitros de sacarosa al 30% en PBS a cuatro grados centígrados durante uno o dos días hasta que se hundan.

Luego prepare cubos de papel de aluminio de un centímetro en cubos y llene los cubos 2/3 o de la manera con OCT. Después, coloque los sesos en los cubos y congélelos en hielo seco. Posteriormente, almacene los cerebros congelados a 80 grados centígrados.

Para seccionar los cerebros en el criostato, coloque una gota de OCT en la superficie del disco de muestra. Pele el papel de aluminio del bloque de histología y coloque el bloque en la orientación deseada sobre el OCT líquido. Aplique una presión firme hasta que el bloque histológico quede fijado.

A continuación, inserte el disco de muestra en la cabeza de la muestra del criostato y oriente la muestra para el corte. A continuación, corte secciones de 50-100 micrómetros de grosor y transfiera las criosecciones flotantes a PBS con un cepillo fino. Posteriormente, bloquee las secciones durante una hora a temperatura ambiente con 5% de suero fetal bovino en PBS, que contenga 0,5% de Triton X-100.

A continuación, incubarlos durante la noche a cuatro grados centígrados con un anticuerpo primario 1:500 diluido en una solución bloqueante. Al día siguiente, lave las secciones tres veces en PBS. Añadir anticuerpo secundario 1:500 diluido en solución bloqueante e incubar las secciones durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, lave las secciones tres veces en PBS. A continuación, contratiñir las secciones con dapE en PBS que contenga 0,5%Triton X-100 durante diez minutos. Enjuague las secciones con PBS y móntelas con medio de montaje.

Para reconstruir las neuronas, adquiera imágenes de las secciones del cerebro con gran aumento y alta resolución. A continuación, seleccione Escaneo de mosaicos en el software de adquisición para cubrir el área de interés, que abarca todas las dendritas y los procesos axonales. Adquiera un número suficiente de pilas en el eje Z para evitar la pérdida de información.

Después de eso, abra la imagen y seleccione la opción de línea segmentada en el menú. Dibuja una línea siguiendo la estructura de la neurona. Posteriormente, vaya a Analizar, Herramientas, seguido de Administrador de ROI, luego Agregar para guardar la línea.

Repita este proceso para cada axón o dendrita de la neurona analizada. En el menú Administrador de ROI, presione Medir para obtener la longitud. Exporte las mediciones a un archivo de texto o a una hoja de cálculo para su análisis.

Para realizar un registro de la neurona expresada por GFP de un ratón electroporado con GFP, coloque el cerebro en una placa de cultivo refrigerada. Corta el cerebelo con unas tijeras pequeñas. A continuación, recoge el cerebro con una espátula y sécalo con una toalla de papel.

Pega el plano ventral caudal del cerebro en un soporte de vibratome. Coloque el soporte en un vibratomo lleno de ACSF helado y asegúrese de que la cámara del vibratomo tenga una carbogenación continua. A continuación, obtenga cortes agudos cortando secciones coronales de 300 micrómetros en 15 minutos.

A continuación, incube las rodajas agudas a 25 grados centígrados durante al menos 60 minutos en ACSF mientras burbujea con carbógeno. Después de 60 minutos, transfiera una rebanada a la cámara de grabación con una pipeta Pasteur o un cepillo pequeño. Sujete la rebanada con un arpa y profusa con ACSF a una velocidad de dos mililitros por minuto.

Para parchear una neurona GFP positiva, localice el área de interés a través del microscopio a 10x. A continuación, encuentre una celda GFP positiva utilizando el objetivo 60x. A continuación, llene el electrodo de registro con solución intracelular.

A continuación, coloque una pipeta de vidrio en el soporte de pipetas. A continuación, coloque la punta de la pipeta en la bañera y concéntrese en la punta. Una vez que la pipeta esté en el baño, aplique presión positiva a través del sistema de control de contrapresión.

Acérquese a la célula de interés bajo guía visual mientras mantiene la contrapresión en la pipeta. Ante la aparición de un pequeño hoyuelo en la superficie de la celda, libere la presión. En este punto, se puede formar un sello hermético con una resistencia superior a un giga-ohmio.

De lo contrario, aplique una ligera presión negativa para facilitarlo. Mientras se forma el sello, lleve la pinza de voltaje de retención a 60 milivoltios. Una vez que se forma el sello de giga-ohmios, aplique un pulso de succión para romper la membrana celular y entrar en el modo de celda completa.

Una vez que esté en modo de celda completa, cambie del modo de pinza de voltaje al modo de pinza de corriente y comience a grabar. Estas imágenes muestran la entrega de vectores a las neuronas de la capa 2/3 por electroporación en el útero en el día embrionario 15.5, y las secciones coronales se prepararon en el día postnatal 16. El vector CAG DsRed2 se cotransfectó como control.

La GFP se expresa solo en aquellas neuronas que también incorporaron cre, permitiendo la recombinación de los sitios LoxP en el vector GFP CALNL. Aquí hay una imagen confocal de gran aumento de los árboles dendríticos de otra neurona GFP escasamente marcada. Se trata de una neurona piramidal electroporada con GFP que se observó en condiciones de campos brillantes y fluorescencia verde.

A continuación, se muestra una respuesta de pico típica y regular de una neurona de control electroporada CAG-GFP en la capa 2/3. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos para las electroporaciones en el útero y medio día para la grabación de la pinza del parche si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar la cirugía lo más rápido posible para reducir el estrés de la madre y aumentar las posibilidades de supervivencia de los cachorros.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la expresión, para responder a preguntas adicionales, como la relación entre la expresión de genes específicos y su influencia en el desarrollo del sustituto. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia del desarrollo exploraran la conectividad y la morfología de las neuronas en ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la operación en el útero para describir la estructura y la conectividad de las neuronas a nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia.