Name: La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a caracterizar la conectividad estructural y la excitabilidad de neuronas corticales mediante electroporación in utero. Este método permite el etiquetado de poblaciones neuronales dispersas para análisis cuantitativo detallado.

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Estamos muy agradecidos a R. Gutiérrez y A. Morales por su excelente asistencia técnica y a LA Weiss para su edición. CGB está financiado por el Ministerio español de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación BBVA y SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete y por una beca de la Fundación Ramón Areces y subvenciones SAF2014-52119-R y BFU2014-55738-Redt (de MINECO) a M. Nieto.

<ol><li>Dehorter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+fast-spiking+interneuron+properties+by+an+activity-dependent+transcriptional+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch.</a> Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).</li>
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<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Woodworth, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip1+Regulates+the+Balance+between+Specification+of+Distinct+Projection+Neuron+Subtypes+in+Deep+Cortical+Layers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers.</a> Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Dev Growth Differ. , (2015).</li>
<li>Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+I.+A+quantitative+study+of+Golgi-impregnated+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons.</a> J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).</li>
<li>Miller, M., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+rat+visual+cortex.+II.+A+combined+Golgi-electron+microscope+study+of+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).</li>
<li>Cubelos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cux-2+controls+the+proliferation+of+neuronal+intermediate+precursors+of+the+cortical+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone.</a> Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).</li>
<li>Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Control+of+a+Neuronal+Protein+Using+a+Genetically+Encoded+Unnatural+Amino+Acid+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrinsic+properties+and+excitability+of+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+during+a+critical+period+for+sensory+maps+in+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex.</a> J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).</li>
<li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este protocolo describe con detalle cómo etiquetar las neuronas de la corteza somatosensorial de / 6 ratones C75BL con el fin de analizar su conectividad y su excitabilidad. Con respecto a los métodos existentes, visualiza los aspectos discriminatorios de conectividad, tales como el número de ramas axonales por neurona, su topografía precisa, y su localización anatómica. Mediante la alteración de la posición de los electrodos, es posible apuntar a otras poblaciones de neuronas, tales como la corteza cingulada (mantener ...

El desarrollo de estructuras dendríticas y axonales es una faceta importante de la regulación del circuito en el sistema nervioso, incluyendo en la corteza cerebral. Desempeña un papel crítico durante el cableado selectiva de las diversas subpoblaciones neuronales. Varios informes recientes han demostrado que, además de la conectividad, la diversidad molecular de las neuronas se refleja por la adquisición de modos muy específicos de disparo. Sin embargo, los mecanismos que determinan la excitabilidad y la conectividad de los subtipos neuronales distintas durante el desarrollo, así como su grado de coordinación, son aún poco conocidos 1, 2. In vivo deficitaria y ganancia de función analiza permite el estudio de la relación entre el nivel de expresión de genes específicos y su influencia en el desarrollo del circuito. Electroporación en el útero (IUE) es una técnica ampliamente utilizada para estudiarla función de un gen de interés en las poblaciones neuronales específicas y para estudiar los patrones generales de su conectividad. Sin embargo, para determinar las características morfológicas de los axones y dendritas en las capas corticales en ratones vivos, es esencial para etiquetar las neuronas escasamente. Un sistema de recombinación Cre combinado con IUE puede ser utilizado para marcar una población escasa de las neuronas a una densidad suficientemente baja para resolver las proyecciones emitidas por las células individuales de las láminas corticales identificados. Este método etiquetas de un número suficiente de neuronas por la corteza para obtener datos cuantitativos después del análisis de un número razonable de los cerebros de electroporación (Figura 1). Este manuscrito presenta un método para tal análisis fino de la conectividad. También presenta una estrategia similar para analizar, en experimentos separados, las propiedades eléctricas de las neuronas mediante la realización de grabaciones de corriente-clamp en la proteína de fluorescencia verde (GFP) -electroporated células de rodajas corticales agudas. estos protocoles son versátiles y pueden aplicarse al estudio de la excitabilidad y la conectividad de las neuronas de los animales WT y transgénicos, y también de las neuronas en el que las pérdidas y ganancias de la función se introducen por los plásmidos adicionales durante IUE. Aunque este protocolo describe la electroporación de los ratones en el día embrionario (E) 15,5, esta técnica se puede realizar a cualquier edad entre E9.5 y 3 días postnatal (P) 2 4. Mientras que en las primeras etapas de la electroporación se dirige a las neuronas y los precursores del tálamo y las capas profundas de la corteza, una etapa más avanzada marcas de electroporación capas más superficiales (por ejemplo, neuronas E15.5 IUE capa objetivos II-III). En resumen, la combinación de IUE con análisis morfológico de una sola célula y electrofisiología es una herramienta útil para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la enorme diversidad estructural y funcional de las neuronas en el sistema nervioso.

<table><tbody><tr><td>pCAG-Cre</td><td>Addgene</td><td>13775</td><td></td></tr><tr><td>pCALNL-GFP</td><td>Addgene</td><td>13770</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>15777</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Carl Roth</td><td>301.1</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmmido Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>1615 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (IsoFlo)</td><td>Abbott (Esteve)</td><td>1385 ESP</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Imalgene)</td><td>Merial</td><td>2528-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Xilagesic)</td><td>Calier</td><td>0682-ESP</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Yodada Meda</td><td>694109.6</td><td></td><td>Pomada</td></tr><tr><td>Ocular (Lipolac)</td><td>Angelini</td><td>65.277</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí # 3 - 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí # 10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson dentadas - Rectas 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas endurecidas - Rectas 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Mezenbaum-Nelson Curvadas L=14,5 cm</td><td>Teleflex</td><td>PO143281</td><td></td></tr><tr><td>Puntas curvas finas - Estilo 7 Dumoxel</td><td>Dumont</td><td>0303-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mathieu Portaagujas -</td><td>Dentado Fino Herramientas</td><td>de ciencia 12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de AutoClip</td><td>Braintree scientific, Inc</td><td>ACS&nbsp; APL</td><td></td></tr><tr><td>9 mm AutoClips</td><td>MikRon Precision, Inc.</td><td></td><td></td>205016</tr><tr><td>Suturas - Maquinilla de afeitar eléctrica Polysorb 6-0</td><td>Covidien</td><td>UL-101</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Panasonic</td><td>ER 240</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato (100 mm, 1,0/0,58 diámetro exterior/interior)</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Gauze (Aposan)</td><td>Laboratorios Indas, S.A.U.</td><td>C.N. 482232.8</td><td></td></tr><tr><td>Hisopos de algodón (Star Cott)</td><td></td><td>Albasa-Aguja</td><td></td></tr> <tr><td>25 g (BD Microlance 3)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compuesto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>GFP Tag Anticuerpo policlonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador ECM 830&nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de platino 650P 7 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P7</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp; para imagen fluorescente - MZ10F</td><td></td> <td>Leica-VIP</td><td></td></tr> <tr><td>3000 Vaporizador de isofluorano</td> Matrx-TCS-SP5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de escaneo láser</td><td></td> <td>Leica-Axiovert</td><td></td></tr> <tr><td>200 Microscopio</td><td>Zeiss-Cryostat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- CM 1950</td><td></td> Leica-P-97 <td></td> Extractor de <td></td></tr><tr><td>micropette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Análisis de abrazaderas de parche softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3)</td><td>Dispositivos</td> <td>moleculares-Software</td><td></td></tr> <tr><td>de adquisición (MultiClamp 700B Amplifier)</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>DD1440A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado + Base giratoria&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aire</td><td>Newport-Bombas</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>peristálticas en miniatura</td><td>WPI</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

la electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y conectividad una sola célula

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

El sistema nervioso se compone de una enorme gama de tipos neuronales distintas. Estas subpoblaciones neuronales se caracterizan por, entre otras características, sus morfologías dendríticas distintas, sus patrones específicos de conectividad axonal, y sus respuestas de disparo selectivo. Los mecanismos moleculares y celulares responsables de estos aspectos de la diferenciación durante el desarrollo son aún poco conocidos. A continuación, describimos los protocolos combinados para el etiquetado y la caracterización de la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales. Modificación del protocolo de electroporación en el útero (IUE) permite el etiquetado de una población escasa de las neuronas. Esto, a su vez, permite la identificación y el seguimiento de las dendritas y axones de las neuronas individuales, la caracterización precisa de la ubicación laminar de proyecciones axonales, y el análisis morfométrico. IUE también se puede utilizar para investigar los cambios en la excitabilidad de lasDe tipo salvaje (WT) o neuronas genéticamente modificadas mediante la combinación con células enteras de grabación de rodajas agudas de cerebros electroporación. Estas dos técnicas contribuyen a una mejor comprensión del acoplamiento de la conectividad estructural y funcional y de los mecanismos moleculares que controlan la diversidad neuronal durante el desarrollo. Estos procesos de desarrollo tienen importantes implicaciones en el cableado axonal, la diversidad funcional de las neuronas, y la biología de los trastornos cognitivos.

Para caracterizar los cambios morfológicos de las neuronas en detalle y en todo el desarrollo, es esencial para etiquetar las neuronas escasamente. Un sistema Cre-recombinasa diluido permite la expresión de un gen de interés en una población escasa de las neuronas, de modo que sólo aquellas neuronas que incorporan esta enzima expresan GFP (Figura 1A). Con esta estrategia, la capa II-III está dirigido y etiquetado por IUE en E15.5. CAG-DsRed2 en 1 g / l, es co-electropora...

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

El objetivo general de este enfoque de electroporación in utero es caracterizar la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales en condiciones normales y experimentales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la neurobiología del desarrollo, como analizar la estructura y la conectividad funcional del cerebro y la biología de los trastornos cognitivos. La principal ventaja de esta técnica es que permite marcar una población escasa de neuronas y facilita el trazado de las dendritas y el acceso a neuronas individuales, lo que conduce a un análisis cuantitativo más eficiente y más fiel.Antes de la inyección, prepare diez microlitros de mezcla de ADN por cirugía, ya sea para etiquetado de una sola célula o para un estudio estándar de parche de voltaje. Luego, manipule suavemente los embriones con los dedos para localizar el telencéfalo. A continuación, coloque una micropipeta de borosilicato preparada en una pipeta de boca.Pase la punta de la aguja a través del útero, evitando los vasos sanguíneos, hasta que alcance el ventrículo lateral. Después, inyecte lentamente aproximadamente un microlitro de solución de ADN teñida con verde rápido hasta observar una mancha azul grande. Un paso crítico en este procedimiento es la inyección del ADN.Esto debe hacerse de la manera más suave posible. Ahora, coloque los electrodos de platino de siete milímetros lateralmente en la cabeza de un embrión y aplique voltaje mediante los electrodos de platino. En este procedimiento, crioproteja los cerebros fijados en diez mililitros de sacarosa al 30 % en PBS a cuatro grados Celsius durante uno a dos días hasta que se hundan.Luego prepare cubos de papel de aluminio de un centímetro cúbico y llene los cubos hasta 2/3 partes con OCT. Posteriormente, coloque los cerebros dentro de los cubos y congélelos en hielo seco. A continuación, almacene los cerebros congelados a 80 grados Celsius.Para seccionar los cerebros en el criostato, coloque una gota de OCT sobre la superficie del disco de muestra. Retire el papel de aluminio del bloque de histología y coloque el bloque en la orientación deseada encima del OCT líquido. Aplique presión firme hasta que el bloque de histología quede fijo.Luego, inserte el disco de la muestra en la cabeza de la muestra del criostato y oriente la muestra para el corte. A continuación, corte secciones de 50-100 micrómetros de grosor y transfiera las criosecciones flotantes al PBS utilizando un pincel fino. Posteriormente, bloquee las secciones durante una hora a temperatura ambiente con suero bovino fetal al 5% en PBS, que contiene Triton X-100 al 0,5%.A continuación, incubar durante la noche a cuatro grados Celsius con anticuerpo primario en dilución 1:500 en solución bloqueadora. Al día siguiente, lavar las secciones tres veces con PBS. Añadir anticuerpo secundario en dilución 1:500 en solución bloqueadora e incubar las secciones durante una hora a temperatura ambiente.Luego lave las secciones tres veces con PBS. Posteriormente, contratiña las secciones con dapE en PBS que contenga 0,5 % de Triton X-100 durante diez minutos. Enjuague las secciones con PBS y monte con medio de montaje.Para reconstruir las neuronas, adquiera imágenes de las secciones cerebrales con alta magnificación y alta resolución. A continuación, seleccione Escaneo de Mosaico en el software de adquisición para cubrir el área de interés, abarcando todas las dendritas y los procesos axónicos. Adquiera un número suficiente de cortes en el eje Z para evitar la pérdida de información.A continuación, abra la imagen y seleccione la opción de línea segmentada desde el menú. Dibuje una línea siguiendo la estructura del neutrón. Posteriormente, vaya a Analizar, Herramientas, seguido por Administrador de ROI y luego Agregar para guardar la línea.Repita este proceso para cada axón o dendrita de la neurona analizada. En el menú del Administrador de ROI, presione Medir para obtener la longitud. Exporte las mediciones a un archivo de texto o una hoja de cálculo para su análisis.Para realizar una grabación de una neurona que expresa GFP a partir de un ratón electroporado con GFP, coloque el cerebro en una placa de cultivo enfriada. Corte el cerebelo con unas tijeras pequeñas. Luego, tome el cerebro con una espátula y séquelo suavemente sobre una toalla de papel.Pegue el plano caudal ventral del cerebro en un soporte para vibrátomo. Coloque el soporte en un vibrátomo lleno con ACSF frío con hielo y asegúrese de que la cámara del vibrátomo tenga una carbogenación continua. A continuación, obtenga cortes agudos realizando secciones coronales de 300 micrómetros dentro de los 15 minutos.A continuación, incube los cortes agudos a 25 grados Celsius durante al menos 60 minutos en ACSF mientras se burbujea con carbógeno. Después de 60 minutos, transfiera un corte a la cámara de registro utilizando una pipeta de Pasteur o un pincel pequeño. Sujete el corte con una parrilla y perfúndalo con ACSF a un ritmo de dos mililitros por minuto.Para realizar un parche en una neurona GFP positiva, localice el área de interés mediante el microscopio a 10x. Luego, encuentre una célula GFP positiva utilizando el objetivo de 60x. A continuación, llene el electrodo de registro con la solución intracelular.Posteriormente, coloque una pipeta de vidrio en el porta-pipetas. Después, coloque la punta de la pipeta en el baño y enfoque la punta. Una vez que la pipeta esté en el baño, aplique presión positiva mediante el sistema de control de presión posterior.Acerque la pipeta a la célula de interés bajo orientación visual mientras mantiene presión hacia atrás en la pipeta. Al aparecer un pequeño hundimiento en la superficie de la célula, libere la presión. En este momento, puede formarse un sello hermético con una resistencia mayor a un gigaohmio.De lo contrario, aplique una ligera presión negativa para facilitarlo. Mientras se forma el sello, lleve el voltaje de sujeción del amplificador de voltaje a 60 milivoltios. Una vez formado el sello de gigaohmio, aplique un pulso de succión para romper la membrana celular e ingresar al modo de célula completa.Una vez que esté en modo de célula completa, cambie del modo de bloqueo de voltaje al modo de bloqueo de corriente e inicie la grabación. Estas imágenes muestran la administración de vectores a neuronas de la capa 2/3 mediante electroforesis intrauterina en el día embrionario 15,5, y las secciones coronales se prepararon en el día postnatal 16. El vector CAG DsRed2 se cotransfectó como control.La GFP se expresa únicamente en aquellas neuronas que también incorporaron cre, permitiendo la recombinación de los sitios LoxP en el vector CALNL GFP. A continuación se muestra una imagen confocal con alto aumento de los arborizaciones dendríticas de otra neurona GFP marcada escasamente. Se trata de una neurona piramidal electroporada con GFP que fue observada en condiciones de campo claro y fluorescencia verde.Aquí se muestra una respuesta típica de disparo regular de una neurona control electroporada con CAG-GFP en la capa 2/3. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos para electroporaciones in utero y medio día para el registro mediante parche si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar la cirugía lo más rápido posible para reducir el estrés de la madre y aumentar las probabilidades de supervivencia de las crías.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la expresión, para responder preguntas adicionales, como la relación entre la expresión de genes específicos y su influencia en el desarrollo del hospedador. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia del desarrollo exploraran la conectividad y la morfología de las neuronas en ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la operación in utero para describir la estructura y conectividad de las neuronas a nivel individual y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia.

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Investigación

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Neurociencia

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Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

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Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

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La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula (Video) | JoVE Journal

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

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