Name: Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprende a diferenciar células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos, células endoteliales y musculares lisas para reparación miocárdica. Este método mejora la injertación celular mediante un sistema de liberación de citocinas.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Servicio de Salud Pública de EE. UU. NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120 y UO1 HL100407-proyecto 4 (a JZ), una subvención de desarrollo científico de la American Heart Association (16SDG30410018) y un premio de cupón de investigación del Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Alabama en Birmingham (a WZ).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham. 1. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-CM <ol><li> Escudo los pocillos de una placa de 6 pocillos con una reducción del factor de crecimiento pre-enfriado mezcla de proteína gelatinosa a 4 ° C durante la noche. Aspirar la mezcla de proteína gelatinosa antes de su uso. Sembrar las hiPSCs sobre las placas pre-recubiertas, y cultivar las células (1 x 10 5 células por pocillo) en 5% de CO2 y 37 ° C en mTeSR1 suplemento de medio con el inhibidor de Rock 10 mM. </li><li> Refrescar el medio todos los días hasta que las células alcanzan el 90% de confluencia; a continuación, añadir la reducción del factor de crecimiento mezcla de proteína gelatinosa al medio (0,5 mg mezcla gelatinosa proteína por placa de 6 pocillos, 2 ml de medio por pocillo), y cultivar las células durante 5% de CO2 y 37 ° C dos días más. <ol><li> Para reemplazar el medio, con cuidado aspirar el medio de la placa de Petri con medio de vacíofuera de tocar las células, y añadir nuevo medio utilizando una pipeta de transferencia. </li></ol></li><li> Iniciar la diferenciación mediante la sustitución del medio con medio RPMI1640 suplementado con factor de crecimiento reducido mezcla de proteína gelatinosa, B27 sin insulina, y 100 ng / ml de activina A; cultivar las células en 5% de CO2 y 37 ° C durante 24 horas. </li><li> Reemplazar el medio con medio RPMI1640 que ha sido suplementado con B27 sin insulina, 10 ng / ml de proteína morfogénica ósea 4 (BMP-4), y 10 factor de ng / ml de crecimiento fibroblástico básico (bFGF); cultivar las células en 5% de CO2 y 37 ° C durante 96 horas. </li><li> Reemplazar el medio con medio RPMI1640 suplementado con B27 y continuar cultivar las células en 5% de CO2 y 37 ° C; refrescar el medio cada 3 días. </li><li> Observe grupos de células bajo el microscopio contraer ~ 3 días después de iniciar la diferenciación. Recoge los grupos ~ 7 días después de observar primero las contracciones y lavarlos en solución salina equilibrada de Hanks. <ol><li> Disociar las células agrupadas en la placa mediante su incubación en tampón de Hanks que contiene 100 U / ml de colagenasa IV durante 10 min a 37 ºC con agitación suave; a continuación, añadir 0,25% de tripsina en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 5 min. </li><li> Neutralizar la solución de enzima con suero bovino fetal al 10% en medio RPMI / B27 y luego volver a suspender las células en medio / B27 RPMI. </li><li> Contar el número de células mediante un hemocitómetro. Cultivar las células en placas de 10 cm en 5% de CO2 y 37 ° C durante al menos 3 horas, lo que permitirá que las células no cardiomiocitos a que se adhieran a la superficie de la placa de cultivo. </li></ol></li><li> Recoger la suspensión celular, que contiene el hiPSC-CM, y mantener las células (alrededor de 1 x 10 6 células por placa de 10 cm) mediante el cultivo en una superficie recubierta mezcla de proteína gelatinosa. </li></ol> 2. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-EC <ol><li> Disociar la población hiPSC en células individuales mediante la incubación de THem con el agente quelante en 5% de CO2 y 37 ° C durante 5 min. Transferir las células a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenía medio mTeSR1 fresco. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células en medio mTeSR1 suplementado con inhibidor de Rock 10 mM. Determinar la densidad celular con un hemocitómetro. </li><li> Añadir 250 l de solución de trombina de 20 unidades NIH / ml a un pocillo de una placa de 24 pocillos. </li><li> Añadir 1 x 10 6 hiPSCs a 250 l de una solución de fibrinógeno 12,5 mg / ml. Y añadir los 250 l de solución de fibrinógeno que contiene células de la trombina-cargado también. Observe que la mezcla se solidifique para formar una matriz de fibrina que contiene hiPSC-dentro min. </li><li> La transferencia de los, andamios que contienen células solidificados en los pocillos de una placa de 6 pocillos con las pinzas de vidrio de cubierta, e iniciar la diferenciación mediante el cultivo de los andamios en 2 ml de medio EBM2 suplementado con 2% B27 sin insulina, activina-A (50 ng / ml), y BMP-4 (25 ng / ml) durante 24 horas a 5% de CO <sub&gt; 2 y 37 ° C. <ol><li> Vuelva a colocar suavemente el medio por aspiración de la media de edad a través del vacío sin tocar las células. Añadir nuevo medio EBM2 suplementado con B27 sin insulina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng / ml), eritropoyetina (EPO, 100 ng / ml), y la transformación de β1 de factores de crecimiento (TGFß1, 10 ng / ml), y la cultura de la andamios en 5% de CO 2 y 37 ° C durante 48 horas. </li><li> Refrescar el medio y la cultura de los andamios en 5% de CO2 y 37 ° C durante otras 48 horas; entonces, liberar las células de la andamio mediante la adición de 200 U de colagenasa IV (100 U / ml) al medio. </li><li> Centrifugar las células después de que se liberan. Reemplazar el medio con 2 ml de medio EGM2-MV suplementado con 2% de B27, VEGF-A (50 ng / ml), y SB-431542 (10 mM); refrescar el medio cada dos días. </li><li> Aproximadamente 10 días más tarde (es decir, en ~ Día 14 después de que se inició la diferenciación), disociar las células con 100 U / ml de colagenasa IV, aislar hIPSC-ECs de la población de células diferenciadas a través de citometría de flujo se analizan para la expresión de proteínas marcadoras EC-específicos (por ejemplo, CD31, CD144) 3. </li><li> Ampliar el aislado hiPSC-EC a través de un protocolo establecido 3. </li></ol></li></ol> 3. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-CML <ol><li> Sembrar el hiPSCs en placas que han sido recubiertas con la mezcla de proteína gelatinosa, y cultivar las células en medio mTeSR1 en 5% de CO2 y 37 ° C, con cambios de medio día, hasta la confluencia (~ 2 días). </li><li> Iniciar la diferenciación en células de linaje mesodérmico-cultivando las células con CHIR99021 (5 M) y BMP-4 (10 ng / ml) en medio RPMI1640 y 2% B27 más insulina durante 3 días. </li><li> Para producir hiPSC-CML con un fenotipo predominantemente sintético: <ol><li> Cultivar las células con VEGF-A (25 ng / ml), factor de crecimiento de fibroblastos (β FGFβ, 5 ng / ml) en RPMI1640 me<html> Dium, y 2% B27 menos insulina en 5% de CO2 y 37 ° C durante 4 días. </li><li> Cultivar las células en VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) en medio RPMI1640, y 2% B27 más insulina en 5% de CO2 y 37 ° C durante 2 días. </li><li> Cultivar las células en derivados de las plaquetas del factor de crecimiento β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGF (3 ng / ml) en RPMI1640, y 2% B27 más insulina en 5% de CO2 y 37 ° C durante 4 días. </li></ol></li><li> Para producir hiPSC-CML con un fenotipo predominantemente contráctil: <ol><li> Cultivar las células durante 4 días con VEGF-A (25 ng / ml) y FGFβ (5 ng / ml) en RPMI1640 y 2% de insulina B27 menos. </li><li> Cultivar las células durante 7 días con PDGFβ (5 ng / ml) y TGF (2,5 ng / ml) en RPMI1640 y 2% B27 más insulina. </li></ol></li><li> Se purifica el finales poblaciones hiPSC-SMC cultivando las células en lactato (4 mM) que contenía medio RPMI1640 metabólica para ~ 6 días. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. La creación de las microesferas que contienen IGF- <ol><li> aceite de oliva de calor a 45 ° C en un baño de agua. </li><li> Heat 5 ml de solución de gelatina al 10% a 50 ° C. </li><li> Añadir la gelatina para el aceite de oliva, remover, y luego enfriar rápidamente a 5 ° C mediante la adición de hielo en el baño de agua. </li><li> Veinticinco minutos después, añadir acetona fría (4 ° C) para el aceite de oliva para inducir la formación de microesferas. </li><li> Mantener la temperatura a 5 ° C durante 1 hora; a continuación, recoger las microesferas, ellos lavar 5 veces con acetona enfriada previamente para eliminar el aceite de oliva, y permitir que se seque al aire a 4 ° C. </li><li> Resuspender las microesferas en una solución de 70% de etanol y 0,25% de glutaraldehído durante la noche a 4 ° C para inducir la reticulación y, a continuación neutralizar la mezcla con glicina 100 mM. </li><li> Cargar IGF en las microesferas mediante la mezcla de 5 mg de microesferas con 15 l H 2 O destilada que contenía 5 mg de IGF y 0,1% de albúmina de suero bovino durante 30 min. </li></ol> 5. Creación del parche sobre el sitio de la lesión y inyectando las células <ol><li> Se suspende el derivado de hiPSC CM (2 millones), SMC (1 millón) y EC (1 millón), así como en 1 ml de medio esencial mínimo (MEM). </li><li> Suspender 5 mg de microesferas en 1 ml de solución de fibrinógeno (25 mg / ml). </li><li> Llene una jeringa con la solución que contiene células, otra jeringa con la solución de fibrinógeno / microesfera, y tercera jeringa con 1 ml de solución de trombina (80 unidades NIH / ml, suplementadas con 2 l 400 mM CaCl 2 y 200 mM ε-aminocaproico ácido). </li><li> Quirúrgicamente inducir el infarto de miocardio en el corazón porcina a través de la ligadura de la arteria descendente anterior coronaria como se ha descrito antes 2. NOTA: En breve, cerdos Yorkshire hembra (~ 13 kg, 45 días de edad) son sedados con una inyección intramuscular de zoletil / xilazina (4,4 mg / kg), y fue intubado bajo anestesia general con isoflurano (0,5-5%). Un 4º interctoracotomía ostal se lleva a cabo y se fue arteria coronaria descendente anterior se expone. La arteria coronaria se ocluye por una ligadura para 60 min y luego se elimina la ligadura. desfibrilación eléctrica inmediata se realiza en el caso de la fibrilación ventricular. </li><li> Coloque un anillo de plástico estéril (~ 2,5 cm) en el epicardio de la zona del infarto de corazón de cerdo, y luego inyectar simultáneamente las soluciones de microesferas / fibrinógeno y trombina en el anillo. </li><li> Dejar que la mezcla se solidifique (~ 30 seg), y luego insertar la aguja de la jeringa que contiene células a través de la mezcla solidificada en el miocardio infartado e inyectar las células. Cierre las capas musculares, tejido subcutáneo y de la pared torácica con 3-0 o 2-0 monocryl de sutura según el tamaño del animal. La buprenorfina 0,01-0,02 mg / kg inyección intramuscular se utilizará cada 8 horas para controlar el dolor durante los primeros 3 días después de la cirugía. </li><li> Evaluar la función cardíaca mediante una resonancia magnética cardiacaformación de imágenes (MRI) antes del procedimiento quirúrgico, una semana y cuatro semanas después del procedimiento quirúrgico 2, 3, 4. Después de los estudios finales de resonancia magnética, sacrificar al animal y procesar sus corazones para histología y análisis molecular 2, 3, 4. </li></ol>

<ol><li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+proliferation+time+course+of+stem+cells+transplanted+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium.</a> Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+a+spatiotemporal+3D+environment+on+endothelial+cell+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced-Pluripotent+Stem+Cells+into+Smooth-Muscle+Cells%3A+Two+Novel+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols.</a> PLoS One. 11 (1), e0147155(2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+bodies%3A+a+novel+culture+method+for+enrichment+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Huber, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+selection+of+cardiomyocytes+during+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation.</a> FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).</li>
<li>Kita-Matsuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+protocols+for+creation+of+stable+hESC+lines+for+fluorescent+tracking+and+drug+resistance+selection+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes.</a> PLoS One. 4 (4), e5046(2009).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+and+endothelial+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+promotes+hematoendothelial+cell+development+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (1), 122-131 (2008).</li>
<li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+iPSCS+increase+capillary+density+and+improve+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).</li>
<li>Tang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+administration+of+cardiac+progenitor+cells+alleviates+left+ventricular+dysfunction+in+rats+with+a+30-day-old+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction.</a> Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+myocardial+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF-1%29+delivery+with+biotinylated+peptide+nanofibers+improves+cell+therapy+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+in+mice+protects+from+myocyte+death+after+infarction%2C+attenuating+ventricular+dilation%2C+wall+stress%2C+and+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy.</a> J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).</li>
<li>Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiomyocyte+apoptotic+signaling+by+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I.</a> Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
</ol>

Rendimiento mejorado / pureza de hiPSC-CM protocolos convencionales para la diferenciación de las células madre humanas en los CM son a menudo limitadas por el bajo rendimiento y la pureza; por ejemplo, solo 35-66% de células madre-CM obtiene a través de la separación de Percoll y la formación de cuerpos cardiaca expresado miosina lenta cadena pesada o cTnT 6. La pureza de las poblaciones hiPSC-CM diferenciadas se puede incrementar sustancialmente mediante la selección p...

células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) están entre los agentes más prometedores para la terapia de células regenerativas, ya que pueden ser diferenciadas en una gama potencialmente ilimitado y la cantidad de células que no son rechazadas por el sistema inmune del paciente. Sin embargo, su capacidad de auto-replicación y diferenciación también puede conducir a la formación de tumores y, en consecuencia, hiPSCs necesitar ser totalmente diferenciado en tipos celulares específicos, tales como los cardiomiocitos (CMS), las células endoteliales (EC), y células de músculo liso (SMCs ), antes de la administración. Uno de los métodos más simples y más comunes de administración de las células es la inyección intramiocárdica directa, pero el número de células trasplantadas que se injerta el tejido miocárdico nativa es excepcionalmente bajo. Gran parte de este desgaste se puede atribuir al medio ambiente citotóxica del tejido isquémico; sin embargo, cuando eran células madre embrionarias murinas (CES) inyectados directamente en el miocardio del corazón no lesionados, oólo ~ 40% de los 5 millones de células entregadas fueron retenidas para 3-5 hr 1, lo que sugiere que una proporción sustancial de las células administradas salió del sitio de administración, tal vez porque se exprimen a través del trayecto de la aguja por las altas presiones que se producen durante contracción del miocardio. A continuación, presentamos los métodos novedosos y sustancialmente más eficientes para la generación de cardiomiocitos derivados de hiPSC (hiPSC-CM) 2, las células endoteliales (hiPSC-ECS) 3, y las células musculares lisas (CML) 4. En particular, este protocolo hiPSC-SMC es la primera para imitar la amplia gama de características morfológicas y funcionales observados en somático SMCs 5 por la dirección de las células hacia un fenotipo predominantemente SMC sintético o contráctil. También proporcionamos un método de suministro de células que mejora la tasa de injerto de las células inyectadas por la creación de una que contiene citoquinas fibrina patch sobre el sitio de inyección. El parche parece mejorar tanto la retención de células, mediante el sellado del trayecto de la aguja para evitar que las células salgan del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período de al menos tres días.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Protocolo Sección 1</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medio</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel con factor de crecimiento</td><td>reducido Corning ciencias</td> de la vida <td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Tecnologías de</td><td>células madre</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27, sin suero</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>R& D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solución salina equilibrada (Dextrosa, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhidro)</td><td></td><td>Suero</td> fetal bovino 14175079 <td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific Fisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 6 pocillos</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>plato de 10 cm</td><td>Corning Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>Cell incubadora</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Protocol Section 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 medio</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV medio</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> <td>EppendorffEppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Section 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Sección 4</fuerte>Aceite de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oliva</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R& D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Sección 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949;-ácido aminocaproico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>medio MEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>ventilador de anestesia</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de anestesia</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>Desfibrilador</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1.5 T MRI</td><td></td><td>General Electric Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T MRI</td><td>Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>medio de contraste de gadolinio (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 sutura de seda</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 sutura de seda</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura monofilamento 3-0</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) deben estar completamente diferenciadas en tipos específicos de células antes de la administración, pero los protocolos convencionales para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos (hiPSC-CM), células endoteliales (hiPSC-ECS), y células musculares lisas (CML) son a menudo limitado por bajo rendimiento, la pureza, y / o una pobre estabilidad fenotípica. A continuación, presentamos nuevos protocolos para la generación de hiPSC-CM, -ECs y -SMCs que son sustancialmente más eficiente que los métodos convencionales, así como un método para la combinación de la inyección de células con un parche que contiene citoquinas creado sobre el sitio de administración. El parche mejora tanto la retención de las células inyectadas, sellando el trayecto de la aguja para evitar que las células de ser exprimido hacia fuera del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período prolongado. En un modelo porcino de la lesión por isquemia-reperfusión del miocardio, la tasa de injerto era más de dos veces mayor cuando lalas células se administraron con el parche que contiene citoquinas en comparación con las células sin parche, y el tratamiento tanto con las células y el parche, pero no con las células solas, se asoció con una mejora significativa en la función cardíaca y el tamaño del infarto.

Caracterización de Diferenciada hiPSC-CM, -ECs, y -SMCs La capacidad diferencial de hiPSCs se evaluaron 2, 3, 4. Flujo de análisis de citometría de T expresión troponina cardíaca (cTnT) sugieren que la pureza de la población final hiPSC-CM puede exceder de 90% (Figura 1A, 1B, panel de B1). Casi todas las...

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

El objetivo general de este video es presentar una técnica para diferenciar células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos y demostrar el uso de estas células para estudiar la reparación miocárdica tras una lesión por isquemia-reperfusión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la ingeniería de tejido cardíaco con células iPS humanas derivadas de células cardíacas para la reparación miocárdica. La principal ventaja de este procedimiento es que permite a los científicos obtener cardiomiocitos, células musculares lisas y células endoteliales purificadas, y generar tejido cardíaco con estas células progenitoras.Ling Gao es investigadora postdoctoral en el propio laboratorio del Doctor Zhang en la UAB y Greg Walcott es cardiólogo en el hospital de la UAB. Trina es especialista en resonancia magnética en el hospital de la UAB. Para inducir células madre pluripotentes en cardiomiocitos, primero, recubra las cavidades de una placa de seis pozos con una mezcla proteica gelatinosa reducida en factores de crecimiento enfriada a 4 grados Celsius.Luego, refrigere la placa durante la noche a 4 grados Celsius. Al día siguiente, aspire la mezcla proteica gelatinosa y si

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

La generación de tejido alineado de miocardio es un requisito clave para la adaptación de los recientes avances en la biología de células madre para fines de utilidad clínica. Aquí se describe un enfoque para la impresión por microcontacto el control preciso de la forma y la función celular. Usando poblaciones altamente purificadas de células madre embrionarias derivadas progenitores cardíacos, a continuación, generar anisotrópico tejido miocárdico funcional.

Generación de tejido funcional del miocardio Alineados través de la impresión por microcontacto

De suministro de células intramiocárdica en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o infarto de miocardio, es ampliamente utilizado para poner a prueba el potencial terapéutico de diferentes tipos de células en los estudios de regeneración. Por lo tanto, una descripción detallada y una visualización clara de este procedimiento quirúrgico ayudarán a definir los límites y las ventajas de los análisis de células terapéuticas cardiovasculares en pequeños roedores.

Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

En este protocolo, se ilustrará la derivación de células progenitoras cardíacas a partir de células madre embrionarias de ratón y humanas. Una estrategia importante en este protocolo es enriquecer las células progenitoras cardíacas con citometría de flujo utilizando reporteros fluorescentes diseñados en las líneas de células madre embrionarias.

Derivación de células cardiacas progenitoras a partir de células madre embrionarias

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Este protocolo describe una técnica de diferenciación endotelial de las células progenitoras cardíacas. Se centra especialmente en cómo la concentración del suero y la densidad de siembra de células afectan el potencial de diferenciación endotelial.

Inducción de la diferenciación endotelial en las células cardiacas progenitoras en suero bajo condiciones

Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una instalación experimental para el análisis de la evaluación de la integridad del ADN en células antes del trasplante de la célula.

Evaluar la integridad del ADN de la célula de vástago para terapia celular cardiaca

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

Aquí, presentamos un protocolo para generar y expandir de manera robusta los cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica del paciente.

Generación y expansión de cardiomiocitos humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica de pacientes

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

Aprende a diferenciar células madre pluripotentes humanas en cardiomiocitos, células endoteliales y musculares lisas para reparación miocárdica. Este método mejora la injertación celular mediante un sistema de liberación de citocinas.

Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

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