Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

El objetivo general de este procedimiento es desentrañar las estrategias virulentas y los sistemas patógenos del huésped mediante la identificación de la interacción de una proteína malhechora del fitoplasma de candidatus con las proteínas del huésped de Malus domestica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en muchos campos de investigación biológica diferentes, y se utiliza aquí en la investigación de plantas para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la enfermedad de proliferación de la manzana. La principal ventaja de esta técnica es que un solo efector de patógeno puede ser evaluado contra miles de posibles interactores, lo que hace que este método sea un punto de partida fácilmente factible en la investigación de infecciones.

Para comenzar, identifique los árboles infectados con síntomas específicos de proliferación de manzanas y controle los árboles que no tengan síntomas. Con tijeras de podar limpias, corte muestras de raíces de tres sitios diferentes del sistema radicular que tengan un diámetro de 0,5 a 1 cm y una longitud de aproximadamente 5 cm. Coloque las muestras de raíz en bolsas de plástico debidamente etiquetadas.

A continuación, coloque las muestras en una caja fría con paquetes térmicos refrigerados y almacene a cuatro grados centígrados hasta su posterior procesamiento. Enjuague las muestras de raíces con agua para eliminar la tierra. A continuación, transfiera las muestras a una placa de Petri estéril y utilice un bisturí esterilizado para extraer la epidermis de la raíz y la corteza.

Con un pañuelo limpio y sin pelusa, limpie el bisturí. A continuación, sumerja el instrumento en etanol al 70% y esterilícelo con calor sobre una llama abierta. Usa el bisturí para rascar el floema.

Picar la muestra en trozos pequeños y alícuota de 30 a 100 miligramos de los trozos en un tubo de reacción estéril de dos mililitros. Almacene las muestras a 80 grados centígrados o utilícelas inmediatamente para aislar el ADN, que sirve como molde para la amplificación del gen efector y la posterior clonación del efector en el vector cebo. Después de aislar el ADN poliespecífico del fitoplasma de los árboles infectados, clonarlo en vectores de cebo y probarlo para su autoactivación y expresión de acuerdo con el protocolo de texto.

Streak plex A ATP 00189 efector transformó NMY51 en una placa SD-trp fresca y la cultivó a 30 grados centígrados durante dos o tres días hasta que aparecieron colonias rojas. Utilice una colonia roja de la placa de agar para inocular tres mililitros de medio SD-trp en un pequeño matraz agitador e incube el cultivo durante la noche a 30 grados centígrados con agitación a 120-150 rotaciones por minuto. Al día siguiente, con un mililitro del cultivo durante la noche, inocular 20 mililitros de SD-trp en un matraz agitador y dejarlo crecer durante ocho horas.

Utilice medio SD-trp para ajustar el cultivo a un OD600 de 0,2, y con diez mililitros del cultivo, inocular dos matraces que contengan 100 mililitros cada uno de medio SD-trp. Incubar los cultivos a 30 grados centígrados agitando durante la noche. A continuación, mida el OD600 del cultivo y pellet 120 unidades OD600.

Por ejemplo, si se mide un OD600 de 1,2, se centrifugan 100 mililitros de muestra, se desecha el sobrenadante y se utilizan 800 mililitros de 2xYPAD precalentado para resuspender el pellet en dos matraces agitadores e incubar a 30 grados centígrados. Incubar el cultivo de levadura a 30 grados centígrados y 120-150 rotaciones por minuto. Mida el OD600 aproximadamente cada 1,5 horas de acuerdo con el protocolo de texto hasta que se alcance un OD600 de 0,6.

Después de preparar el ADN del esperma de salmón, Te Lithium OAc y PEG Lithium OAc de acuerdo con el protocolo de texto, centrifugar 800 mililitros de cultivo de levadura a 700 x G durante cinco minutos para granular las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets en un total de 200 mililitros de agua estéril bidestilada. A continuación, vuelva a pelar las células y deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet en 16 mililitros de mezcla de Te Lithium OAc y vuelva a centrifugar la muestra. Luego, después de desechar el sobrenadante, use 9,6 mililitros de Te Lithium OAc para resuspender el pellet. En recipientes de reacción de tamaño adecuado, prepare doce viales con siete microgramos de vector de biblioteca de ADN Add HAC pico, 100 microlitros de ADN de esperma de salmón al 2% y 2,5 mililitros de mezcla PEG Lithium OAc.

Agregue 600 microlitros de la suspensión de células de levadura previamente preparada a cada uno de los doce viales y mezcle vigorosamente durante un minuto. Luego incubar las reacciones en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 45 minutos, mezclando cada 15 minutos. A continuación, agregue 160 microlitros de DMSO a cada vial y mezcle vigorosamente.

A continuación, incube los viales a 42 grados centígrados durante 20 minutos más. Después de peletizar las células, deseche el sobrenadante y use tres mililitros de 2xYPAD para resuspender cada pellet. Agrupe las células de los doce viales en un matraz agitador de 100 mililitros e incube la levadura durante 90 minutos a 30 grados centígrados y 120 rotaciones por minuto.

Después de la incubación, después de peletizar las células y desechar el sobrenadante, utilice una pipeta serológica de diez mililitros y 4,5 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para resuspender completamente el pellet pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. Retire 50 microlitros de la suspensión y use cloruro de sodio al 0,9% para preparar diluciones diez veces desde 1:10 hasta 1:1000. A continuación, coloque 100 microlitros de cada dilución en placas de Petri de 90 milímetros que contengan agar SD-trp-leu.

Extienda el resto de la suspensión de levadura sin diluir en placas de Petri de 16x150 milímetros de diámetro con agar SD-trp-leu-His-ade. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante tres días para las placas SD-trp-leu y durante cuatro días para las placas SD-trp-leu-his-ade. Determine la eficiencia de la transfección contando las colonias de las diferentes diluciones seriadas en las placas de selección SD-trp-leu.

Transfiera cada clon utilizando una punta de pipeta estéril para recoger y rayar la colonia en placas selectivas frescas de SD-trp-leu-his-ade. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 24 horas. Repita la transferencia de clones todos los días hasta alcanzar un total de cinco pasajes.

Para analizar clones, bajo una campana estéril, prepare un tubo de reacción estéril de dos mililitros con un mililitro de SD-trp-leu-his-ade para cada clon. Use una aguja caliente para perforar un agujero en cada tubo y use un sellador permeable al gas para cubrir el orificio. Inocular cada vial con material fresco de colonia de un clon e incubar los viales a 30 grados centígrados y 150 rotaciones por minuto durante 24 horas.

Después de peletizar las células y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en el tampón apropiado y transfiéralo a un tubo de reacción nuevo de dos mililitros. Agregue 100 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido a la suspensión y mezcle el tubo vigorosamente durante cinco minutos. Finalmente, purifique el ADN plasmídico de acuerdo con el protocolo de texto.

En esta tabla y figura se proporciona un resumen de los resultados esperados del ensayo de autoactivación y su interpretación. La autoactivación débil conduce al crecimiento en trp-leu-his, pero no en las placas de selección agotadas en trp-leu-his-ade. Mientras que la levadura transformada con un fuerte cebo autoactivador crecería en trp-leu-his-ade que carece de medio.

Una cotransformación exitosa de cebo y presa se caracteriza por el crecimiento en placas selectivas que carecen de trp y leu. La interacción del cebo y una proteína de presa conduce a una complementación de la oxitrofia de his y ade de NMY51 Aquí se muestra un ejemplo de una interacción entre el cebo y la presa en un experimento híbrido de levadura 2. Se identificaron los socios de interacción del huésped malus domestica, MdTCP24 y MdTCP25, y la interacción se confirmó mediante transformación de cono denovo con el efector.

Una vez dominado, el híbrido de levadura 2 se puede realizar en un día si todo el equipo y los materiales necesarios, especialmente la levadura, se preparan adecuadamente de antemano. Al intentar este procedimiento, es importante evitar la contaminación y trabajar siempre en condiciones estériles. Siguiendo este procedimiento, se debe realizar otro método independiente como la complementación de fluorescencia bimolecular, por ejemplo, para confirmar las interacciones proteína-proteína encontradas.

Esto es particularmente importante ya que la levadura o el híbrido per se es relativamente propenso a generar resultados falsos positivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en muchos campos de investigación diferentes comprendieran mejor los principios moleculares que involucraban las interacciones proteína-proteína, especialmente en las interacciones huésped-patógeno, y muchos otros campos de investigación biológica. Además, comprenderá que realizar este método es fácilmente factible en cualquier laboratorio de biología molecular decentemente equipado.

No olvide que trabajar con ciertos productos químicos, bisturíes y llamas abiertas puede ser extremadamente peligroso, por lo que al realizar este procedimiento, siempre debe tener en cuenta ciertas precauciones. Eso significa usar su equipo de seguridad personal, como guantes y gafas, y usar el equipo de seguridad general del laboratorio.