Name: Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprende a identificar interacciones entre efectores bacterianos y proteínas de Malus domestica mediante cribado de dos híbridos en levadura. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares de la enfermedad de proliferación del manzano.

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Damos las gracias a Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, y Florian Senoner del Centro de Investigación y Laimburg Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG para el apoyo técnico y Julia Strobl para la corrección del manuscrito. Este trabajo se realizó como parte del proyecto APPL2.0 y fue financiado en parte por la Provincia Autónoma de Bolzano / Bolzano, Italia y el Consorcio de Apple del Tirol del Sur.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En la pantalla Y2H, la proteína efectora potencial es co-expresada con diferentes proteínas que interactúan hipotéticos (paso 7). Cada clon de crecimiento de la levadura contiene el cebo, pero un (potencialmente) interactor diferente. Las proteínas que interactúan se codifican en una biblioteca de ADNc que se clonó en plásmidos de presa. El cebo y la presa plásmidos cada código de co-cistronically para una parte de un factor de transcripción de levadura. En el caso de una interacción física entre el cebo (efector) y un interactor codificada por plásmidos presa, las dos partes de factores de transcripción (el dominio de unión a ADN y el dominio de activación) se unen, y se induce la expresión del gen indicador. La levadura es capaz de crecer en placas de selección SD de histidina y adenina-agotado. El tipo de biblioteca de ADNc de presa depende del efector seleccionados y se debe elegir en consecuencia. El vector de presa y cebo, así como la cepa de levadura, deben ser compatibles. En esta pantalla, un ADN LexA y el dominio de activación Gal4 domain se utilizaron como las unidades de factor de transcripción de levadura compatibles. La biblioteca de ADNc puede construirse de forma individual, por encargo, o comercialmente obtenido. La preparación de la biblioteca de ADNc de presa no es parte de este protocolo. En este protocolo, un, biblioteca de ADNc normalizado construido por la propia a partir del ARN de Malus domestica x hojas se utilizó y se clonó en pGAD-HA 41. El efector (cebo) que expresan la cepa de levadura se transformó con la biblioteca de presa, y los clones fueron seleccionados sobre placas de selección SD de histidina y adenina-agotado. Para extraer el ADN plásmido de las colonias de levadura, un plásmido de ADN mini kit basado en columnas para las bacterias se recomienda en combinación con una etapa de rotura mecánica utilizando perlas de vidrio para mejorar la lisis de la levadura (paso 8). En este plásmido la purificación, el cebo y el vector presa se purificaron simultáneamente en concentraciones relativamente bajas. Sin embargo, la cantidad de ADN plásmido es suficiente para identificar la pareja de interacción a través de ingenio secuenciaciónHout propagación plásmido previo (paso 8.4). Como alternativa, el ADN purificado en el paso 8.4 se puede transformar en E. coli competente y se selecciona con resistencia a los antibióticos mediada por vectores presa (por ejemplo, ampicilina el en caso de pGAD-HA). La E. coli seleccionado colonias llevan sólo el plásmido biblioteca pGAD-HA, y el plásmido de purificación de alto rendimiento se puede realizar con estos clones. La transformación exitosa de pLexA-N y pGAD-HA construcciones complementa el triptófano y leucina auxotrofıa de NMY51. Una interacción entre el efector y una proteína (codificada en pGAD-HA) conduce a la activación del sistema reportero en NMY51 cepas. En el caso de la auto-activación, NMY51 transformó con el efector expresar pLexA-N en combinación con el vector de biblioteca vacía pGAD-HA crece en placas selectivas que carecen de trp-leu-his-ade, debido a la activación no deseada del sistema informador NMY51 40. La auto-activación puede ser wEAK y puede ocurrir en ausencia de trp-leu-his, o la activación puede ser fuerte y se caracteriza por crecimiento en placas de trp-leu-his-ade 41. Auto-activación puede causar un fondo masiva de clones falsos positivos en la pantalla de Y2H real. Para evitar esto, una prueba de auto-activación con el cebo debe llevarse a cabo, en el que el vector efector-expresión es co-transformada con el vector de la biblioteca vacía. En este contexto experimental, no debe inducirse la expresión del gen reportero. Si la auto-activación (es decir, el crecimiento en placas selectivas) es visible en la prueba, el medio se puede complementar con diferentes concentraciones de 3-amino-1,2,4-triazol 45 (3-AT). 3-AT es un inhibidor de la deshidratasa imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), una enzima importante durante la biosíntesis de histidina 46. La suplementación con 3-AT puede reducir los efectos débiles de auto-activación durante las pantallas de Y2H 47,48. Diferentes concentraciones de 3-AT deben ser probados. En este protocolo, 1 - Se utilizaron 40 mM de 3-AT. La concentración más baja que conduce a la represión de la auto-activación, posteriormente, se debe utilizar en la pantalla Y2H. Las placas selectivas de ensayo auto-activación sólo puede ser evaluada Si las placas SD-trp-leu de la co-transformación contienen un número suficiente de clones. Como una indicación ≥ 500 colonias por 90 mm (diámetro) placa de Petri son suficientes. Para determinar la eficiencia de transfección exacta, se recomienda para preparar diluciones en serie de la levadura co-transformada y extendió sobre placas SD-trp-Leu. Para reducir la auto-activación, el efector puede ser clonado en pLexA-C, un vector de expresión de cebo que fusiona la etiqueta LexA a la C-terminal de la proteína. La orientación de la Lex-Una etiqueta puede atenuar la autoactivación 24. Sin embargo, no es posible en todos los casos para reducir o suprimir la auto-activación. La formacion decolonias de color rojo o rojizo indica una interacción débil o falsos positivos. El gen informador ade2 de NMY51 sólo se activa cuando se trata de una interacción proteína-proteína, que en vez bloquea la acumulación de un colorante rojo en esta cepa de levadura 40. En ausencia de una interacción, NMY51 son rojizo, mientras que las colonias que llevan interactores fuertes son de color blanco. La observación del color de las colonias en las placas de selección por lo tanto proporciona un indicio importante además para juzgar si las colonias respectivas son interactores TrueType o falsos positivos. Es el tiempo necesario para adaptar o cambiar ciertos ajustes de ensayo con respecto a la naturaleza de la carnada y las características de interacción. Por ahora, una serie de mejoras y técnicas derivadas de la Y2H común se han establecido para permitir el análisis de las interacciones proteína bastante difíciles en diferentes sistemas host. Una revisión por Stynen et al. 49 direcciones de unand se describen diferentes aspectos de Y2H, sus mejoras y adaptaciones, y por lo tanto proporciona información útil acerca de cómo elegir el ensayo de interacción apropiada. Y2H pantallas y técnicas de derivados se han utilizado ampliamente en diferentes campos de investigación, siempre que se requiera la identificación de las interacciones proteína binario. Incluso si se realizan controles críticos, tales como las pruebas de auto-activación de la carnada y uno-a-uno vuelve a las transformaciones de las proteínas que interactúan identificadas, el Y2H es dar lugar a falsos resultados 26, 50, 51. La levadura como modelo no es adecuado para todos los estudios de interacción. La levadura no constituye necesariamente un entorno celular que soporta la modificación posterior a la traducción apropiada y plegado para cada proteína de 24. Por otra parte, en el entorno Y2H, las proteínas se sobre-expresan, y su expresión no es de controlencabezados por su promotor natural. El Y2H obliga a los compañeros de interacción proteínicos al núcleo, que no es necesariamente el destino subcelular natural. Las circunstancias celulares nativas de la interacción por lo tanto no pueden ser reflejados por la levadura y pueden dar lugar a resultados falsos negativos o falsos positivos. La mayoría Y2H se basa en la complementación de levadura auxotrofia como un principio selectivo. Esta selección nutricional se caracteriza por una alta sensibilidad, pero a costa de la selectividad disminuido en comparación con otro (por ejemplo, el reportero cromogénico) ensayos 49. Si la auto-activación irreducible (ver arriba) u otras limitaciones se producen durante un cierto efector, la Y2H no es un ensayo apropiado 25. En la Tabla 1 y la Figura 1, se dan los resultados esperados de la prueba de auto-activación. La ausencia de interacciones reales (es decir, falsos negativos) puede ser causada por la toxicidad de la proteína, la proteína de la traducción incorrectaprocesamiento, el impedimento estérico de la interacción, los compañeros de interacción con baja representación en la biblioteca de la presa, la localización de membrana de la carnada, o que falten componentes necesarios para la interacción 24. Se recomienda de novo amplificar el gen de longitud completa de la proteína de interacción identificado a partir de ADNc, subclonar en pGAD-HA, y llevar a cabo un ensayo de interacción de uno a uno por la transformación de la generada pGAD-HA constructo en el cebo que expresan NMY51 cepa. Esto es necesario ya que el interactor observado presentes en la biblioteca presa solamente podría ser un fragmento de una proteína más grande. Sin embargo, la información para el gen de longitud completa correspondiente sólo se puede acceder si considerables datos de la secuencia genómica y transcriptómica está disponible. El protocolo de transformación para el ensayo de auto-activación descrito aquí se puede aplicar para un ensayo de este tipo uno-a-uno, y la interacción entre el cebo y el interactor debe ser reproducible. <p clculo = &quot;jove_content&quot;&gt; Las interacciones identificadas en una pantalla Y2H siempre debe ser confirmado por otra técnica independiente. Esta técnica independiente debe estar más cerca del entorno natural de la interacción proteína-proteína real. En el caso de la ATP_00189 phytoplasmal efector, la interacción con los factores de transcripción de TCP Malus x domestica se verificó in planta con la complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) en Nicotiana benthamiana protoplastos 28 (no es parte de este protocolo). El ATP_00189 proteína efectora se deriva de la planta patógeno P. mali. En planta BiFC fue elegido tanto para verificar las interacciones con los ATP_00189 Malus x domestica factores de transcripción previamente identificados en el Y2H 28. BiFC es un ensayo de interacción proteína-proteína que no requiere la translocación subcelular de las proteínas que interactúan al núcleo con el fin de activar el sistema reportero &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Por otra parte, los de expresión in planta y maquinaria de modificación imita el entorno de la interacción natural entre el efector bacteriana planta en su planta huésped. Sin embargo, una pantalla global utilizando BiFC no es factible. Hay varios pasos en el protocolo que debe ser tratado con cuidado. Cuando la amplificación del gen de interés (paso 4), es importante para descartar que los cebadores se unen a ADN de la planta. Por lo tanto, el ADN de las plantas no infectadas debe ser incluido como un control negativo. La secuencia del gen de interés no debe contener los sitios de restricción EcoRI y SalI que se utilizan para la clonación direccional de la inserción. Si la secuencia contiene estos sitios, diferentes enzimas de restricción para la clonación deben ser elegidos. transformación de levadura es un método central durante este protocolo. Transfección eficiencia depende de la competencia de las células de levadura, su viabilidad, el estado de crecimiento, y la calidad de la transfección reagent 53, 54. Para el protocolo propuesto, se recomienda utilizar la levadura a partir de placas frescas de no más de dos semanas (se mantiene a 4 ° C) cuando se realizan las transformaciones. A menudo, el crecimiento de la levadura transformada se retrasa cuando se inoculan cultivos líquidos selectivos con las colonias de las viejas placas de agar. También es útil el uso de un cultivo iniciador líquido como inóculo para los experimentos reales y no utilizar la levadura directamente de la placa. La baja eficiencia cuando la transfección de la presa en la levadura que expresan cebo puede conducir a la representación insuficiente de ciertas proteínas presa (posibles interactianos) y por lo tanto puede sesgar toda la pantalla. En este protocolo, una eficiencia de transfección de levadura de ~ 150.000 ufc / g de ADN transfectado en el Y2H funcionó bien. El conocimiento de los defectos e inconvenientes de la técnica Y2H e interpretar los resultados de una manera crítica y adecuada es indispensable para la elaboración de la correct conclusiones. ensayos de Y2H y los derivados se han utilizado durante muchos años y han sido objeto de muchas mejoras y adaptaciones con respecto a las diferentes características de cebo, la localización subcelular de la interacción, las parejas de unión que se espera, y otros factores que podrían ser necesarias para la interacción (ver Y3H 55, 56, 57). Recientemente, pantallas Y2H basadas en matrices se han desarrollado que permite el análisis automatizado, de alto rendimiento de numerosos cebos contra millones de presas 58. El futuro más probable es la automatización y de alto rendimiento enfoques para este ensayo para permitir el esclarecimiento de las vías de señalización complejos y interactomes en diferentes campos de investigación.

<html> De levadura híbrido de dos pantallas (Y2H) fueron desarrollados hace unos 27 años 1 y desde entonces han sido ampliamente utilizados en diversos campos para determinar las interacciones específicas proteína-proteína 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . La interacción física de un efector bacteriana con una proteína diana huésped es a menudo la condición previa para la manipulación funcional de esta proteína diana. El análisis de estas interacciones se ha trasladado al centro de muchos sectores diferentes de la infección biología 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. El principio de la pantalla Y2H es que la interacción de dos proteínas conduce a la reconstitución de un factor de transcripción funcional que impulsa la expresión de genes informadores. El efector conocido (el&quot; cebo &quot;) se fusiona traduccionalmente el dominio de unión a ADN (DBD) del factor de transcripción, y las parejas de interacción potenciales (la &quot;presa&quot;) se fusionan con el dominio de activación (AD) de la respectiva factor de transcripción. Puesto que la interacción socio es desconocida, una biblioteca de potencial interactores se clona en el llamado &quot;presa-biblioteca.&quot; Normalmente, se hace esta biblioteca mediante la clonación de ADNc en un plásmido de expresión presa vector apropiado que codifica la AD que es compatible con el cebo-vector codificado DBD. En el caso de una interacción, la factores de transcripción reconstituidas inducen la expresión de genes indicadores, que generalmente permiten la selección crecimiento de la levadura. laidentificación de interactores se logra mediante la secuenciación del plásmido presa con cebadores plásmido específico. Las bacterias han desarrollado diversas estrategias para manipular y explotar el metabolismo de su anfitrión o para evadir los mecanismos de defensa y secretar moléculas efectoras a través de diferentes sistemas de secreción bacteriana 19, 20, 21. La determinación de las parejas de unión de estos efectores bacterianos es, pues, el primer paso en la identificación de la vía manipulado en el huésped. Esto conduce a una mejor comprensión de los mecanismos de patogenicidad específicos. Pantallas Y2H se llevan a cabo para identificar las interacciones efectoras bacterianas durante phytoplasmoses, y, a menudo, Y2H es un experimento inicial crucial para la caracterización adicional de los mecanismos de patogenicidad moleculares en la investigación fitoplasmas 22, 23. Sin embargo, el MetDescripción artesa en la mayoría de las publicaciones es más bien escasa, y estas técnicas a menudo se subcontrata a empresas de biotecnología. Para llamar la atención sobre la viabilidad de este método, este protocolo proporciona información paso a paso para identificar socios de la interacción de una molécula efectora bacteriana en su huésped natural. A pesar del amplio uso y el enfoque de avance rápido de las pantallas Y2H, no hay que olvidar que ciertas interacciones podrían no ocurrir en el sistema de levadura. Esto es debido al hecho de que la célula de levadura se utiliza como una especie de &quot;recipiente de reacción in vivo&quot; con ciertas limitaciones biológicas. Varios autores han abordado las ventajas y desventajas de Y2H y sus derivados 11, 24, 25, 26, 27. Consideraciones generales son, por ejemplo, que la célula de levadura puede no proporcionar la adecuadala expresión génica, el (post) de traslación, o por translocación condiciones para las respectivas proteínas en estudio. Esto puede dar lugar a resultados falsos negativos en la pantalla. Las interacciones positivas pueden a su vez ser artefactos y podrían no ocurrir en la situación natural (es decir, en el caso de los efectores en el huésped apropiado). Por tanto, es indispensable para confirmar las interacciones del sistema de expresión de levadura heterólogo con un ensayo de interacción independiente en un sistema biológico más estrechamente relacionados. En este estudio, se identificaron las parejas de unión de la ATP_00189 efector de la planta patógeno no cultivables Candidatus Fitoplasmas mali (P. mali). Los resultados proporcionan importantes conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de los síntomas de la proliferación de la manzana 28, una enfermedad que causa grandes pérdidas económicas en las regiones de cultivo de manzanas afectadas en Europa 29.

<table><tbody><tr><td>Bromuro de cetiltrimetilaminomonio (CTAB)</td><td>Applichem</td><td>A6284</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Trishidroximetilaminometano (Tris)</td><td>Applichem</td><td>A2264</td><td>para medios y tampones</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Applichem</td><td>A2942</td><td>para medios y tampones</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético Sal disódica (NaEDTA)</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td>para medios y tampones</td></tr><tr><td>Sal sódica de N-lauroilsarcosina</td><td>Applichem</td><td>A7402</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>, acetato de amonio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>9688</td><td>para la preparación</td></tr><tr><td>de ADN 2-mercaptoetanol</td><td>Applichem</td><td>A1108</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Isopropanol (2-Propanol)</td><td>Applichem</td><td>A3928</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td><td>51976</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>ARNasa</td><td>Applichem</td><td>A2760</td><td>para la preparación</td></tr> <tr><td>de ADNCloroformo:Isoamilo 24:1</td><td>Applichem</td><td>A1935</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Corrección de pruebas Polimerasa (p. ej. iProof)</td><td>Bio-Rad</td><td>203433</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0271</td><td>para clonación</td></tr><tr><td>SalI</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0641</td><td>para clonación</td></tr><tr><td>Kit de purificación de ADN basado en columna (p. ej. QIAquick)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>para la clonación de</td></tr><tr><td>sulfato de kanamicina</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>para la selección microbiológica</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td>para ensayo de autoactivación</td></tr><tr><td>L-Arginina Monoclorhidrato &nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3680</td><td>para cultivo de levadura</td></tr><tr><td>L-Isoleucina&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3642</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-lisina monohidrato&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3448</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-Metionina &nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3897</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-fenilalanina&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3464</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-Treonina&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3946</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-tirosina &nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3401</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-Uracilo</td><td>Applichem</td><td>A0667</td><td>para cultivo</td></tr><tr><td>de levadura L-Valina&nbsp;</td><td>Aplique</td><td>A3406</td><td>para el cultivo</td></tr><tr><td>de levadura Sal de hemisulfato de L-adenina&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A1596</td><td>para cultivo de levadura</td></tr><tr><td>0,22 y micro; m Filtro de poros</td><td>Sartorius</td><td>16541</td><td>para filtración estéril</td></tr><tr><td>L-histidina Monoclorhidrato</td><td>Applichem</td><td>A3719</td><td>para cultivo de levadura</td></tr><tr><td>L-Leucina&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A3496</td><td>para cultivo de levadura</td></tr><tr><td>L-Triptófano&nbsp;</td><td>Aplicación</td><td>A3410</td><td>para cultivo de levadura</td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51483</td><td>para el cultivo</td></tr><tr><td>de levadura D-Glucosa Monohidrato&nbsp;</td><td>Apliquem</td><td>A1349</td><td>para el cultivo de levaduras</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-1</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Applichem</td><td>A2208</td><td>para el cultivo de levaduras</td></tr><tr><td>Polietilenglicol 4000 (PEG)</td><td>Aplichem</td><td>A1249</td><td>para la transformación de levaduras</td></tr><tr><td>Acetato de litio dihidratado (LiOAc)</td><td>Applichem</td><td>A3478</td><td>para la transformación de levaduras</td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón</td><td>Pliego</td><td>A2159</td><td>para la transformación de levaduras</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra la etiqueta Lex-A (p. ej. Región de unión al ADN Anti-LexA)</td><td>Millipore</td><td>06-719</td><td>para Western blot</td></tr><tr><td>Plasmido Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PLN350</td><td>para la purificación de plásmidos a partir de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio lavadas con ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>para la purificación de plásmidos a partir de levaduras</td></tr><tr><td>Ampicilina Sal de sodio</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td>para la selección microbiológica</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td>para cultivo de levadura</td></tr><tr><td>Centrífuga concentradora de vacío (p. ej. Concentrador 5301)</td><td>Eppendorf</td><td>Z368245 (Sigma)</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Vector de cebo (p. ej. pLexA-N)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> para el vector de presas <td>Y2H</td></tr><tr><td>(p. ej. pGAD-HA)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td> para el vector de presas <td>de control Y2H</td></tr><tr><td>( p. ej. pLexA-p53)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>para el vector de</td></tr><tr><td>cebo de control Y2H ( p. ej. pACT-largeT)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>para Y2H</td></tr><tr><td>Electrocompetente E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td><td>Invitrogen</td><td>C640003</td><td>para la clonación Cepa reportera de</td></tr><tr><td>levadura (NMY51:MATahis3&Delta; 200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, p. ej. NMY51)</td><td>Dualsystems</td><td>P01004</td><td>para Y2H</td></tr><tr><td>Película de parafina plástica (p. ej. Parafilm M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Sellador permeable al gas (p. ej. BREATHseal)</td><td>Greiner</td><td>676 051</td><td>para el cultivo de levaduras</td></tr><tr><td>Ciclador de PCR (p. ej. Termociclador T100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>para PCR</td></tr><tr><td>Ciclado de PCR cuantitativo (p. ej. CFX96 Sistema de detección de PCR en tiempo real táctil)</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td>para PCR cuantitativa</td></tr><tr><td>Microcentrífuga (e.g. Centrífuga 5417 R)</td>Equipo de <td>laboratorio</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>general Eppendorf 5417 RCentrífuga (p. ej. Centrífuga 5804 R)</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>Equipamiento general</td></tr><tr><td>de laboratorio Agua libre de nucleasas (sin ADNasa, sin ARNasa, sin proteasa)</td><td>5Prime</td><td>2500010</td><td>para PCR y trabajos de ADN</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Swann-Morton</td><td>0301</td><td>para la preparación de ADN</td></tr><tr><td>Filtro estéril (0,22 y micro; m; Polietersulfona)</td><td>VWR-International</td><td>514-0073 (número de catálogo europeo)</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Placas de Petri y Oslash; 90 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Placas de Petri y Oslash; 150 mm&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639161</td><td>para el cultivo de levaduras</td></tr><tr><td>Fotómetro (p. ej. BioPhotometer)</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td>para cultivo de levaduras</td></tr><tr><td>Fotómetro Cubetas</td><td>de la marca 759015</td><td></td><td>para el cultivo de levaduras</td></tr><tr><td>Baño de agua (p. ej. Baño de agua Memmert WB7)</td><td>Memmert</td><td>WB7</td><td>para la transformación de levaduras</td></tr><tr><td>Equipo Western Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>diverso</td><td>para la detección</td></tr><tr><td>de proteínas dNTPs</td><td>5Prime</td><td>2201210</td><td>para clonación Matraces</td></tr><tr><td>agitadores (Erlenmeyer) (100 mL; 1.000 mL; 2.000 mL) y tapones de algodón transpirables (p. ej. Duran Erlenmeyer matraces de cuello estrecho)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232793, Z232858, Z232866</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Incubadora de agitación (e.g. GFL 3031)</td><td>GFL</td><td>3031</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>aglutinante</td> de<td>incubadora</td><td>KB 53 (E3.1)</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Máquina de hielo (p. ej. máquina de hielo IF 825)</td><td>Omniwash</td><td>IF 825</td><td>Equipos generales</td></tr><tr><td>de laboratorio 0,2 mL, 1,5 mL y 2,0 mL Viales de reacción (polipropileno)</td><td>Eppendorf</td><td>0030.124.332 (0,2 ml); 0030.123.328 (1,5 ml); 0030.123.344 (2,0 ml)</td><td>Equipos generales de laboratorio</td></tr><tr><td>Pipetas y puntas de pipeta desechables (diferentes volumina: 10 - 1.000 y micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>diverso</td><td>equipo general de laboratorio</td></tr><tr><td>Esparcidor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SPR-L-S01</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Agitador de vórtice (p. ej. MS 3 Minishaker)</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>equipo general de laboratorio</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0011</td><td>para clonación</td></tr><tr><td>Nevera (4 &deg; C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr</td><td></td> <td>81.767.580.4</td><td>equipo general de laboratorio</td></tr><tr><td>Congelador (-20 &deg; C) (p. ej. Liebherr Comfort Professional G5216)</td><td>Liebherr</td><td>G5216</td><td>Equipo general de laboratorio</td></tr><tr><td>Cilindro graduado (p. ej. marca</td><td>)Sigma Aldrich</td><td>Z327352; Z327417; Z327441&nbsp; &nbsp;</td><td>Equipo general de laboratorio</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (p. ej. Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S55701</td><td>para el cultivo de levaduras y bacterias</td></tr><tr><td>Pipeta mecánica (p. ej. Pipetboy acu 2)</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155000</td><td>equipo general de laboratorio</td></tr><tr><td>Cubetas para electroporación (1 mm)</td><td>Molecular Bio Products</td><td>5510-11</td><td>para la transformación</td></tr> <tr><td>de bacteriasElectroporador (p. ej. Eporator)</td><td>Eppendorf</td><td>4309000019</td><td>para la transformación de bacterias</td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel y Blot (p. ej. ChemiDoc MP System)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708280</td><td>equipos</td></tr><tr><td>generales de laboratorio Tubos de centrífuga cónicos (polipropileno) (50 mL)</td><td>VWR-International&nbsp;</td><td>525-0403 (Número de catálogo europeo)</td><td></td></tr><tr><td>Equipos generales de laboratorio Tubos de centrífuga cónicos (polipropileno) (13 mL)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>equipos generales de laboratorio</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT; 1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>P2325</td><td>para ligadura</td></tr> de <tr><td>trifosfato de adenosina (ATP, p. ej. Solución de ATP (10 mM)</td><td>)Ambion&nbsp;</td><td>AM8110G (distribuido por Thermo Scientific)</td><td>para la ligadura</td></tr><tr><td>Mezcla de abandono sin histidina, leucina, triptófano y adenina (DO, p. ej. Suplementos de medio de abandono sintético de levadura)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2021 Sigma&nbsp;</td><td>para el cultivo de levadura (mezcla preparada)</td></tr></tbody></table>

desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Desentrañar los mecanismos moleculares de las manifestaciones de la enfermedad es importante comprender las patologías y el desarrollo de síntomas en la ciencia de las plantas. Las bacterias han desarrollado diferentes estrategias para manipular su metabolismo del huésped para su propio beneficio. Esta manipulación bacteriana es a menudo junto con el desarrollo de síntomas graves o la muerte de las plantas afectadas. La determinación de las moléculas bacterianas específicas responsables de la manipulación de acogida se ha convertido en un campo importante en la investigación microbiológica. Después de la identificación de estas moléculas bacterianas, llamados &quot;efectores&quot;, es importante aclarar su función. Un método directo para determinar la función de un efector es identificar su compañero de unión proteico en su huésped natural a través de una pantalla de dos híbridos de levadura (Y2H). Normalmente, el anfitrión alberga numerosas parejas de unión potenciales que no se pueden predecir de manera suficiente por cualquier algoritmo en silico. Por lo tanto, es la mejor opción para perform una pantalla con el efector hipotética contra toda una biblioteca de proteínas del huésped expresadas. Es especialmente difícil si el agente causal es cultivable como fitoplasmas. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para la purificación de ADN a partir de una planta de fitoplasmas infectados de acogida leñosa, la amplificación del efector potencial, y la posterior identificación del compañero de interacción molecular de la planta con una pantalla Y2H. A pesar de que las pantallas Y2H son de uso general, hay una tendencia a externalizar esta técnica para las empresas de biotecnología que ofrecen el servicio a un costo Y2H. Este protocolo proporciona instrucciones sobre cómo realizar una Y2H en cualquier laboratorio de biología molecular decentemente equipado utilizando técnicas de laboratorio estándar.

Antes de la pantalla Y2H real se puede realizar el cebo debe ser probado para la auto-activación. Esto se consigue mediante la transformación del vector de expresión de cebo junto con el vector vacío biblioteca presa y el control de crecimiento en placas selectivas. Para analizar si la proteína ATP_00189 phytoplasmal es auto-activación, se realizó la prueba de auto-activación como se describe en la sección 5. El plásmido cebo está complementando el PRT y la presa plásmido, el leu auxotrofıa de S. cerevisiae NMY51 40. El éxito de co-transformación se caracteriza, pues, por crecimiento en placas selectivas que carecen de trp y leu. La interacción del cebo y presa de proteínas conduce a una complementación de la suya y ade auxotrofıa de NMY51. Si aparece la auto-activación por el cebo en la ausencia de una interacción, la levadura crece en placas selectivas que carecen de él y ade. auto fuerte y débilpuede producirse la activación. Fuerte auto-activación del cebo se caracteriza por el crecimiento de la levadura co-transformada en placas de selección empobrecido trp-leu-his-ADE. autoactivación débil conduce a un crecimiento en trp-leu-la suya, pero no en placas de selección empobrecido trp-leu-su-ade. controles adecuados positivos son indispensables para interpretar los resultados del ensayo de auto-activación. Un resumen de los resultados esperados del ensayo de auto-activación y su interpretación se proporcionan en la Tabla 1 y se visualizan en la Figura 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de cebo de pruebas de auto-activación de un cebo antes de realizar una pantalla Y2H. S. cerevisiae NMY51 se co-transformó con la interacción del cebo (pLEX-p53) y la presa (PACT-Larget) como control positivo (panel izquierdo: ac), una auto-activación más una presa vacía débilmente libravector ry (panel central: df) y un cebo no se auto-activación más un vector de la biblioteca presa vacía (panel de la derecha: gi). La levadura co-transformadas se cultivaron en placas SD que carecen de trp y leu (panel superior: a, d, g), trp, leu y su (panel central: b, e, h) y trp, leu, la suya y ADE (menor Panel: c, f, i). Selección en un medio que carece de trp y leu es un control positivo para el éxito de co-transformación, como el vector de cebo complementa la auxotrofia trp y el vector presa la auxotrofia leu de NMY51 (crecimiento en SD-trp-leu). En caso de una interacción entre el cebo y presa o una auto-activación de la carnada, la expresión del indicador de NMY51 se enciende y se complementa la suya y auxotrofıa ade (crecimiento en SD-trp-leu-su-ADE). Un auto-activación débil se caracteriza por un crecimiento en el SD-trp-leu sus placas (panel central, df). Débil auto-activación de un cebo debe ser disminuida antes de analizar el ceboEn una pantalla de Y2H, por ejemplo, mediante la adición de 3-AT a los medios de comunicación selectiva. agotamientos de aminoácidos se indican con &quot;-&quot; en el nombre del medio respectivo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> ninguna </td><td> colonias </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td></tr><tr><td> ninguna </td><td> pGAD-HA </td><td> sin crecimiento </td><td> colonias </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> ninguna </td><td> colonias </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td></tr><tr><td> pLexA-N </td><td> pGAD-HA </td><td> colonias </td><td> colonias </td><td&gt; colonias </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td></tr><tr><td> pLexA-p53 </td><td> pacto Larget </td><td> colonias </td><td> colonias </td><td> colonias </td><td> colonias </td><td> colonias </td></tr><tr><td> pLexA-N-atp00189 </td><td> pGAD-HA </td><td> colonias </td><td> colonias </td><td> colonias </td><td> sin crecimiento </td><td> sin crecimiento </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Resultados esperados en un ensayo de auto-activación de cebo. La transformación de S. cerevisiae NMY51 rendimientos en crecimiento diferencial en medios selectivos basados en las características de co-transformada cebo y presa. Se evaluó el crecimiento en placas selectivas en la transformación de diferentes combinaciones de vectores (AF) después de 72 h de incubación a 30 ° C. autoactivación débil se caracteriza por el crecimiento de la levadura en el SD-trp-leu-la suya y fuerte auto-activación por crecimiento en SD-trp-leu-su-ade plat selecciónES en la ausencia de una pareja de interacción. El pLexA-N phytoplasmal codificada efector ATP_00189 no presenta la auto-activación, que se caracteriza por la incapacidad del vector cebo transformó NMY51 para crecer en la ausencia de su y ade. Dependiendo del cebo, una pantalla de Y2H puede ganar numerosos clones de levadura que crecen en placas selectivas. Todos los clones deben ser analizados y revisados ​​por posibles redundancias. Incluso si una biblioteca de ADNc normalizado se ha utilizado, es muy probable que un interactor se representa en muchos clones diferentes. Dependiendo de la técnica de clonación de la biblioteca, también es posible que sólo los fragmentos del gen completo se insertan en algunos vectores de presa. Por tanto, es aconsejable de novo amplificar (a partir de cDNA) y subclonar el gen de longitud completa de la interactor y para probar la interacción en un análisis de Y2H uno-a-uno (Figura 2). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Ejemplo de una interacción entre el cebo y presa en un experimento Y2H. Una pantalla de dos híbridos de levadura (Y2H) se realizó y se purificaron los plásmidos de los clones positivos interactor. El vector de la presa se secuenció y se identificaron los socios de la interacción huésped Malus x domestica MdTCP24 y MdTCP25. Como MdTCP34 control negativo (para los que no se identificó ningún elemento interactuante en la pantalla de la biblioteca Y2H) se subclonó en paralelo. Los genes de longitud completa se amplificaron a partir de ADNc de manzana, se subclonó en el vector presa (que expresan co-cistronically el dominio AD de activación) y de novo co-transformada con el vector de cebo que expresa la ATP_00189 efector bacteriana acoplado al dominio de unión a ADN (BD). Esta cifra se toma de 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una más grande</a>versión de esta figura.

proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

El objetivo general de este procedimiento es desentrañar las estrategias de virulencia y los sistemas huésped-patógeno mediante la identificación de la interacción entre una proteína efectora de Candidatus Phytoplasma malefactor y proteínas del huésped provenientes de Malus domestica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en diversos campos de investigación biológica y se utiliza aquí en investigación vegetal para elucidar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la enfermedad de proliferación del manzano. La principal ventaja de esta técnica es que un único efector patógeno puede analizarse frente a miles de posibles interactores, lo que convierte a este método en un punto de partida fácilmente factible en la investigación de infecciones.Para comenzar, identifique árboles infectados con síntomas específicos de proliferación del manzano y árboles control sin síntomas. Utilizando tijeras de podar limpias, corte muestras de raíz de tres sitios diferentes del sistema radicular que tengan un diámetro de 0,5 a 1 cm y una longitud de aproximadamente 5 cm. Coloque las muestras de raíz en bolsas de plástico debidamente etiquetadas.Luego, coloque las muestras en una caja fría con paquetes térmicos enfriados y almacénelas a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento. Enjuague las muestras de raíz con agua para eliminar el suelo. A continuación, transfiera las muestras a una placa de Petri estéril y utilice un escalpelo esterilizado para eliminar la epidermis y el cortex de la raíz.Con un tejido limpio y libre de pelusas, limpie el escalpelo. A continuación, sumerja el instrumento en etanol al 70 % y esterilícelo con calor sobre una llama abierta. Utilice el escalpelo para rayar el floema.Corte la muestra en trozos pequeños y alícuota de 30 a 100 miligramos de los trozos en un tubo de reacción estéril de dos mililitros. Almacene las muestras a 80 grados Celsius o úselas inmediatamente para aislar el ADN, que servirá como molde para la amplificación del gen efector y la posterior clonación del efector en el vector cebo. Después de aislar el ADN poliespecífico de fitoplasma de árboles infectados, clónelo en vectores cebo y pruébelo para autoactivación y expresión según el protocolo descrito en el texto.Siembre por agotamiento el efector transformado NMY51 de Streak plex A ATP 00189 en una placa fresca de SD-trp y cultívelo a 30 grados Celsius durante dos o tres días hasta que aparezcan colonias rojas. Utilice una colonia roja de la placa de agar para inocular tres mililitros de medio SD-trp en un matraz pequeño con agitación y incube el cultivo durante la noche a 30 grados Celsius con agitación a 120-150 rotaciones por minuto. Al día siguiente, con un mililitro del cultivo nocturno, inocular 20 mililitros de SD-trp en un matraz con agitación y déjelo crecer durante ocho horas.Utilice medio SD-trp para ajustar el cultivo a una DO600 de 0,2 e inocule, con diez mililitros del cultivo, dos matraces que contienen 100 mililitros cada uno de medio SD-trp. Incube los cultivos a 30 grados Celsius con agitación durante la noche. A continuación, mida la DO600 del cultivo y peletee 120 unidades de DO600.Por ejemplo, si se mide una DO600 de 1,2, centrifugue 100 mililitros de muestra, deseche el sobrenadante y use 800 mililitros de 2xYPAD precalentado para resuspender el precipitado en dos matraces agitadores e incubar a 30 grados Celsius. Incube la cultura de levadura a 30 grados Celsius y 120-150 rotaciones por minuto. Mida la DO600 aproximadamente cada 1,5 horas según el protocolo descrito hasta alcanzar una DO600 de 0,6.Después de preparar el ADN de esperma de salmón, Te Lithium OAc y PEG Lithium OAc según el protocolo descrito en el texto, centrifugue 800 mililitros de cultivo de levadura a 700 x g durante cinco minutos para obtener el sedimento celular. Retire el sobrenadante y re suspenda los sedimentos en un volumen total de 200 mililitros de agua doblemente destilada estéril. Luego, vuelva a sedimentar las células y deseche el sobrenadante.ReSuspender el precipitado en 16 mililitros de la mezcla Te Lithium OAc y centrifugar la muestra nuevamente. Luego, después de desechar el sobrenadante, usar 9,6 mililitros de Te Lithium OAc para resuspender el precipitado. En recipientes de reacción de tamaño adecuado, preparar doce viales con siete microgramos del vector de la biblioteca de ADN Add HAC pico, 100 microlitros de ADN de esperma de salmón al 2 % y 2,5 mililitros de la mezcla PEG Lithium OAc.Añada 600 microlitros de la suspensión de células de levadura previamente preparada a cada uno de los doce viales y mezcle vigorosamente durante un minuto. A continuación, incube las reacciones en un baño de agua a 30 grados Celsius durante 45 minutos, mezclando cada 15 minutos. Luego, añada 160 microlitros de DMSO a cada vial y mezcle vigorosamente.Luego, incubar los viales a 42 grados Celsius durante 20 minutos adicionales. Después de centrifugar las células, desechar el sobrenadante y utilizar tres mililitros de YPAD 2x para resuspender cada precipitado. Reunir las células de los doce viales en un matraz para agitador de 100 mililitros e incubar la levadura durante 90 minutos a 30 grados Celsius y 120 rotaciones por minuto.Después de la incubación, tras centrifugar las células y descartar el sobrenadante, utilice una pipeta serológica de diez mililitros y 4,5 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9 % para resuspender completamente el precipitado, pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. Retire 50 microlitros de la suspensión y use cloruro de sodio al 0,9 % para preparar diluciones decimales desde 1:10 hasta 1:1000. A continuación, siembre 100 microlitros de cada dilución en placas de Petri de 90 milímetros que contengan agar SD-trp-leu.Extienda el resto de la suspensión de levadura sin diluir sobre placas de Petri de 16x150 milímetros de diámetro con agar SD-trp-leu-His-ade. Incube las placas a 30 grados Celsius durante tres días para las placas SD-trp-leu y durante cuatro días para las placas SD-trp-leu-his-ade. Determine la eficiencia de transfección contando las colonias de las diferentes diluciones en serie sobre las placas de selección SD-trp-leu.Transfiera cada clon utilizando una punta estéril de pipeta para seleccionar y rayar la colonia sobre placas selectivas frescas de SD-trp-leu-his-ade. Incube las placas a 30 grados Celsius durante 24 horas. Repita el traslado de los clones cada día hasta alcanzar un total de cinco pasajes.Para analizar los clones, bajo una campana estéril, prepare un tubo de reacción estéril de dos mililitros con un mililitro de SD-trp-leu-his-ade por cada clon. Utilice una aguja caliente para perforar un orificio en cada tubo y emplee un sellador permeable al gas para cubrir el orificio. Inocule cada vial con material fresco de colonia proveniente de un clon e incube los viales a 30 grados Celsius y 150 rotaciones por minuto durante 24 horas.Después de centrifugar las células y descartar el sobrenadante, reponga el precipitado en el tampón adecuado y transfiéralo a un tubo de reacción fresco de dos mililitros. Añada 100 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido a la suspensión y mezcle el tubo vigorosamente durante cinco minutos. Finalmente, purifique el ADN plasmídico según el protocolo descrito en el texto.En esta tabla y figura se proporciona un resumen de los resultados esperados del ensayo de autoactivación y su interpretación. La autoactivación débil conduce al crecimiento en placas de selección agotadas de trp-leu-his, pero no en placas de selección agotadas de trp-leu-his-ade. Mientras tanto, la levadura transformada con un cebador que presenta una autoactivación fuerte crecería en medio deficiente de trp-leu-his-ade.Una cotransformación exitosa del cebo y la presa se caracteriza por el crecimiento en placas selectivas que carecen de trp y leu. La interacción entre el cebo y una proteína presa conduce a una complementación de la auxotrofía de his y ade de NMY51. Aquí se muestra un ejemplo de una interacción entre el cebo y la presa en un experimento de levadura bifactorial. Se identificaron los socios de interacción del huésped malus domestica, MdTCP24 y MdTCP25, y se confirmó la interacción mediante transformación de cono de novo con el efector.Una vez dominada, la prueba de doble híbrido en levaduras puede realizarse en un día si todos los equipos y materiales necesarios, especialmente las levaduras, se preparan adecuadamente por adelantado. Durante la realización de este procedimiento, es fundamental evitar la contaminación y trabajar siempre bajo condiciones estériles. Tras seguir este protocolo, debe realizarse otro método independiente, como por ejemplo la complementación bimolecular de fluorescencia, para confirmar las interacciones proteína-proteína halladas.Esto es particularmente importante ya que la levadura o el híbrido por sí mismos son relativamente propensos a generar resultados falsos positivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores de muchos campos diferentes pudieran comprender mejor los principios moleculares involucrados en las interacciones proteína-proteína, especialmente en las interacciones huésped-patógeno, y en muchos otros campos de investigación biológica. Además, comprenderá que realizar este método es fácilmente factible en cualquier laboratorio de biología molecular decentemente equipado.No olvide que trabajar con ciertos productos químicos, escalpelos y llamas abiertas puede ser extremadamente peligroso; por lo tanto, al realizar este procedimiento, siempre debe considerar ciertas precauciones. Esto significa usar su equipo de seguridad personal, como guantes y gafas protectoras, y utilizar el equipo general de seguridad del laboratorio.

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Investigación

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Immunology and Infection

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Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

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