Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla
20 de enero de 2017
proteínas efectoras bacterianas son importantes para establecer infecciones exitosas. Este protocolo describe la identificación experimental de parejas de unión proteica de una proteína efectora bacteriana en su huésped natural de la planta. La identificación de estas interacciones efectoras a través de levadura híbrido de dos pantallas se ha convertido en una herramienta importante en el descubrimiento de estrategias moleculares de patogenicidad.
El objetivo general de este procedimiento es desentrañar las estrategias de virulencia y los sistemas huésped-patógeno mediante la identificación de la interacción entre una proteína efectora de Candidatus Phytoplasma malefactor y proteínas del huésped provenientes de Malus domestica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en diversos campos de investigación biológica y se utiliza aquí en investigación vegetal para elucidar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de la enfermedad de proliferación del manzano. La principal ventaja de esta técnica es que un único efector patógeno puede analizarse frente a miles de posibles interactores, lo que convierte a este método en un punto de partida fácilmente factible en la investigación de infecciones.
Para comenzar, identifique árboles infectados con síntomas específicos de proliferación del manzano y árboles control sin síntomas. Utilizando tijeras de podar limpias, corte muestras de raíz de tres sitios diferentes del sistema radicular que tengan un diámetro de 0,5 a 1 cm y una longitud de aproximadamente 5 cm. Coloque las muestras de raíz en bolsas de plástico debidamente etiquetadas.
Luego, coloque las muestras en una caja fría con paquetes térmicos enfriados y almacénelas a cuatro grados Celsius hasta su posterior procesamiento. Enjuague las muestras de raíz con agua para eliminar el suelo. A continuación, transfiera las muestras a una placa de Petri estéril y utilice un escalpelo esterilizado para eliminar la epidermis y el cortex de la raíz.
Con un tejido limpio y libre de pelusas, limpie el escalpelo. A continuación, sumerja el instrumento en etanol al 70 % y esterilícelo con calor sobre una llama abierta. Utilice el escalpelo para rayar el floema.
Corte la muestra en trozos pequeños y alícuota de 30 a 100 miligramos de los trozos en un tubo de reacción estéril de dos mililitros. Almacene las muestras a 80 grados Celsius o úselas inmediatamente para aislar el ADN, que servirá como molde para la amplificación del gen efector y la posterior clonación del efector en el vector cebo. Después de aislar el ADN poliespecífico de fitoplasma de árboles infectados, clónelo en vectores cebo y pruébelo para autoactivación y expresión según el protocolo descrito en el texto.
Siembre por agotamiento el efector transformado NMY51 de Streak plex A ATP 00189 en una placa fresca de SD-trp y cultívelo a 30 grados Celsius durante dos o tres días hasta que aparezcan colonias rojas. Utilice una colonia roja de la placa de agar para inocular tres mililitros de medio SD-trp en un matraz pequeño con agitación y incube el cultivo durante la noche a 30 grados Celsius con agitación a 120-150 rotaciones por minuto. Al día siguiente, con un mililitro del cultivo nocturno, inocular 20 mililitros de SD-trp en un matraz con agitación y déjelo crecer durante ocho horas.
Utilice medio SD-trp para ajustar el cultivo a una DO600 de 0,2 e inocule, con diez mililitros del cultivo, dos matraces que contienen 100 mililitros cada uno de medio SD-trp. Incube los cultivos a 30 grados Celsius con agitación durante la noche. A continuación, mida la DO600 del cultivo y peletee 120 unidades de DO600.
Por ejemplo, si se mide una DO600 de 1,2, centrifugue 100 mililitros de muestra, deseche el sobrenadante y use 800 mililitros de 2xYPAD precalentado para resuspender el precipitado en dos matraces agitadores e incubar a 30 grados Celsius. Incube la cultura de levadura a 30 grados Celsius y 120-150 rotaciones por minuto. Mida la DO600 aproximadamente cada 1,5 horas según el protocolo descrito hasta alcanzar una DO600 de 0,6.
Después de preparar el ADN de esperma de salmón, Te Lithium OAc y PEG Lithium OAc según el protocolo descrito en el texto, centrifugue 800 mililitros de cultivo de levadura a 700 x g durante cinco minutos para obtener el sedimento celular. Retire el sobrenadante y re suspenda los sedimentos en un volumen total de 200 mililitros de agua doblemente destilada estéril. Luego, vuelva a sedimentar las células y deseche el sobrenadante.
ReSuspender el precipitado en 16 mililitros de la mezcla Te Lithium OAc y centrifugar la muestra nuevamente. Luego, después de desechar el sobrenadante, usar 9,6 mililitros de Te Lithium OAc para resuspender el precipitado. En recipientes de reacción de tamaño adecuado, preparar doce viales con siete microgramos del vector de la biblioteca de ADN Add HAC pico, 100 microlitros de ADN de esperma de salmón al 2 % y 2,5 mililitros de la mezcla PEG Lithium OAc.
Añada 600 microlitros de la suspensión de células de levadura previamente preparada a cada uno de los doce viales y mezcle vigorosamente durante un minuto. A continuación, incube las reacciones en un baño de agua a 30 grados Celsius durante 45 minutos, mezclando cada 15 minutos. Luego, añada 160 microlitros de DMSO a cada vial y mezcle vigorosamente.
Luego, incubar los viales a 42 grados Celsius durante 20 minutos adicionales. Después de centrifugar las células, desechar el sobrenadante y utilizar tres mililitros de YPAD 2x para resuspender cada precipitado. Reunir las células de los doce viales en un matraz para agitador de 100 mililitros e incubar la levadura durante 90 minutos a 30 grados Celsius y 120 rotaciones por minuto.
Después de la incubación, tras centrifugar las células y descartar el sobrenadante, utilice una pipeta serológica de diez mililitros y 4,5 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9 % para resuspender completamente el precipitado, pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. Retire 50 microlitros de la suspensión y use cloruro de sodio al 0,9 % para preparar diluciones decimales desde 1:10 hasta 1:1000. A continuación, siembre 100 microlitros de cada dilución en placas de Petri de 90 milímetros que contengan agar SD-trp-leu.
Extienda el resto de la suspensión de levadura sin diluir sobre placas de Petri de 16x150 milímetros de diámetro con agar SD-trp-leu-His-ade. Incube las placas a 30 grados Celsius durante tres días para las placas SD-trp-leu y durante cuatro días para las placas SD-trp-leu-his-ade. Determine la eficiencia de transfección contando las colonias de las diferentes diluciones en serie sobre las placas de selección SD-trp-leu.
Transfiera cada clon utilizando una punta estéril de pipeta para seleccionar y rayar la colonia sobre placas selectivas frescas de SD-trp-leu-his-ade. Incube las placas a 30 grados Celsius durante 24 horas. Repita el traslado de los clones cada día hasta alcanzar un total de cinco pasajes.
Para analizar los clones, bajo una campana estéril, prepare un tubo de reacción estéril de dos mililitros con un mililitro de SD-trp-leu-his-ade por cada clon. Utilice una aguja caliente para perforar un orificio en cada tubo y emplee un sellador permeable al gas para cubrir el orificio. Inocule cada vial con material fresco de colonia proveniente de un clon e incube los viales a 30 grados Celsius y 150 rotaciones por minuto durante 24 horas.
Después de centrifugar las células y descartar el sobrenadante, reponga el precipitado en el tampón adecuado y transfiéralo a un tubo de reacción fresco de dos mililitros. Añada 100 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido a la suspensión y mezcle el tubo vigorosamente durante cinco minutos. Finalmente, purifique el ADN plasmídico según el protocolo descrito en el texto.
En esta tabla y figura se proporciona un resumen de los resultados esperados del ensayo de autoactivación y su interpretación. La autoactivación débil conduce al crecimiento en placas de selección agotadas de trp-leu-his, pero no en placas de selección agotadas de trp-leu-his-ade. Mientras tanto, la levadura transformada con un cebador que presenta una autoactivación fuerte crecería en medio deficiente de trp-leu-his-ade.
Una cotransformación exitosa del cebo y la presa se caracteriza por el crecimiento en placas selectivas que carecen de trp y leu. La interacción entre el cebo y una proteína presa conduce a una complementación de la auxotrofía de his y ade de NMY51. Aquí se muestra un ejemplo de una interacción entre el cebo y la presa en un experimento de levadura bifactorial. Se identificaron los socios de interacción del huésped malus domestica, MdTCP24 y MdTCP25, y se confirmó la interacción mediante transformación de cono de novo con el efector.
Una vez dominada, la prueba de doble híbrido en levaduras puede realizarse en un día si todos los equipos y materiales necesarios, especialmente las levaduras, se preparan adecuadamente por adelantado. Durante la realización de este procedimiento, es fundamental evitar la contaminación y trabajar siempre bajo condiciones estériles. Tras seguir este protocolo, debe realizarse otro método independiente, como por ejemplo la complementación bimolecular de fluorescencia, para confirmar las interacciones proteína-proteína halladas.
Esto es particularmente importante ya que la levadura o el híbrido por sí mismos son relativamente propensos a generar resultados falsos positivos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores de muchos campos diferentes pudieran comprender mejor los principios moleculares involucrados en las interacciones proteína-proteína, especialmente en las interacciones huésped-patógeno, y en muchos otros campos de investigación biológica. Además, comprenderá que realizar este método es fácilmente factible en cualquier laboratorio de biología molecular decentemente equipado.
No olvide que trabajar con ciertos productos químicos, escalpelos y llamas abiertas puede ser extremadamente peligroso; por lo tanto, al realizar este procedimiento, siempre debe considerar ciertas precauciones. Esto significa usar su equipo de seguridad personal, como guantes y gafas protectoras, y utilizar el equipo general de seguridad del laboratorio.
Resumen
Este protocolo describe la identificación de interacciones proteicas entre una proteína efectora bacteriana y proteínas del huésped en Malus domestica. Mediante el uso de ensayos de doble híbrido en levadura, los investigadores pueden explorar los mecanismos moleculares de la patogenicidad relacionados con la enfermedad de proliferación del manzano.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Fitopatología
- Interacciones Microbianas
- Biología Molecular
Antecedentes
- Las proteínas efectoras bacterianas desempeñan un papel crucial en las infecciones.
- El entendimiento de estas interacciones puede revelar estrategias de virulencia.
- Las pruebas de doble híbrido en levadura son efectivas para identificar interacciones proteicas.
- Este estudio se centra en las interacciones en un huésped vegetal natural.
Objetivo del estudio
- Identificar los factores que se unen a una proteína efectora bacteriana.
- Elucidar los mecanismos moleculares de la enfermedad de proliferación del manzano.
- Proporcionar un método para analizar los efectores de patógenos frente a numerosos interactores.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de muestras de raíz de árboles infectados y controles.
- Aislamiento de ADN y clonación de genes efector en vectores señuelo.
- Transformación de levadura y cultivo para la detección de interacciones.
- Selección de colonias y determinación de la eficiencia de transfección.
Resultados principales
- Identificación exitosa de interacciones proteicas.
- Establecimiento de un protocolo para la detección de proteínas efectoras.
- Conocimientos sobre la base molecular de la patogenicidad en plantas.
- Demuestra la aplicabilidad del método en diversos campos biológicos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un marco robusto para estudiar las interacciones de los efectores.
- Identificar estas interacciones es fundamental para comprender las enfermedades de las plantas.
- Este método puede facilitar investigaciones adicionales sobre la dinámica planta-patógeno.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación de interacciones entre efector de patógeno y proteína hospedadora proporciona una validación crítica de dianas para estrategias antimicrobianas y anti-virulencia. Este enfoque de levadura en dos híbridos permite la eliminación mecanicista de riesgos al revelar los determinantes moleculares de la manipulación del hospedador en patógenos no cultivables. El método apoya los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al generar hipótesis comprobables sobre la función del efector y la modulación de las vías del hospedador.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la asociación de interacciones de efectores con vías del huésped implicadas en la susceptibilidad a enfermedades.
- Valor operativo: Proporciona un sistema escalable para priorizar efectores según la intensidad de interacción y la relevancia biológica.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de la confianza en dianas al vincular la actividad del efector con fenotipos del huésped medibles.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos de interacción a partir de proteomas complejos del huésped, lo que permite la estandarización de ensayos para campañas de cribado de efectores.
- Valor operativo: Establece flujos de trabajo reproducibles para los pasos de clonación, transformación y selección, compatibles con cribados de mediana escala.
- Preparación del ensayo: Produce bibliotecas de presas validadas que pueden reutilizarse en múltiples cribados de efectores, reduciendo la construcción redundante de bibliotecas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Identifica proteínas del huésped que podrían servir como biomarcadores traducibles para la gravedad de la infección o la modulación de la respuesta del huésped.
- Valor operativo: Crea sistemas relevantes para la enfermedad que conectan hallazgos in vitro con resultados fenotípicos in planta.
- Reducción de riesgos: Permite la eliminación previa de riesgos en etapa preclínica al validar si la interrupción de interacciones específicas entre efectores y el huésped atenúa la patogenicidad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se ajusta a las etapas iniciales del descubrimiento hasta la identificación de compuestos activos, particularmente para dianas en las que la manipulación genética es limitada y se requiere un mapeo de interacciones para inferir la función.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al revelar qué vías del huésped son diana de los efectores, aportando información para estudios sobre el mecanismo de acción.
- Selección: Proporciona datos de interacción listos para ensayos que pueden orientar la selección de compuestos frente a las interfaces entre efectores y huéspedes.
- Análisis: Ofrece lecturas binarias y semicuantitativas (crecimiento en medios selectivos) que permiten comparar la intensidad de las interacciones entre distintas variantes de efectores.
- Investigación Traducional: Conecta las interacciones moleculares con resultados fenotípicos en Malus domestica, favoreciendo la continuidad desde el blanco hasta el fenotipo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de Y2H que puede implementarse en múltiples pares efector-blanco sin necesidad de rediseñar los flujos de trabajo principales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la selección de objetivos al reducir la dependencia exclusiva de predicciones in silico.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de aislamiento de ADN, clonación y manipulación de levaduras.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos empíricos sobre la esencialidad del efector y la dependencia del huésped.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos antimicrobianos basada en la centralidad y conservación dentro de redes de interacción.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular, manipulación de levaduras y sistemas de marcadores de selección.
- Depende del acceso a cepas de levaduras, medios selectivos e infraestructura de incubación que mantenga condiciones de 30 °C y 42 °C.
- Necesita la estandarización entre equipos de controles de calidad del ADN y de parámetros de eficiencia en el clonado de efectores.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros sistemas huésped debido a la compatibilidad de las bibliotecas y la variabilidad en la expresión.
- Incluye limitaciones prácticas, como tasas de falsos positivos que requieren validación ortogonal y la incompatibilidad de proteínas de membrana en sistemas estándar de Y2H.
