Name: Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a producir anticuerpos terapéuticos a gran escala usando células HEK-293 en medio libre de suero. Este protocolo establece líneas celulares estables y optimiza la purificación por cromatografía de afinidad.

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La investigación fue apoyada por la Universidad de Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ fue un regalo de Andrew Beavil (plásmido Addgene # 61883). Agradecemos a Tihomir S. Dodev por sus útiles discusiones sobre pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

NOTA: Un vector de expresión de mamífero adecuada debe ser utilizado para este protocolo. Aquí, se utiliza una única construcción que contiene dos casetes de expresión (es decir, expresión de la cadena pesada y ligera es impulsado por promotores separados). cadenas pesada y ligera se clonaron Trastuzumab previamente en el vector. Este vector fue un regalo de Andrew Beavil, obtenida a través de una organización sin fines de lucro plásmido repositorio 13. 1. La recuperación y ampliación del ADN del vector NOTA: El ADN del vector fue recibido como un cultivo de agar blando de arma blanca en la cepa de Escherichia coli XL-1 Blue; vector lleva resistencia a la higromicina. <ol><li> Inserte una puñalada inoculación estéril o bucle en el agar suave de la cultura puñalada entonces consecutivas una placa de agar Luria Bertani (LB) preparado con 75 mg / ml de higromicina para colonias aisladas. Incubar la placa a 37 ° C durante 18-24 horas. </li><li> Se inocula una sola colonia en 5 ml de caldo Terrific (TB) que contiene 75 mg / ml de higromicina. Incubate el cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas con agitación 225 rpm. </li><li> Utilice el cultivo de una noche para preparar un stock de glicerol de DNA vector mediante la mezcla suavemente a 800 l de cultivo con 200 l 80% de glicerol en un criovial y se congelan a -80 ° C. <ol><li> Añadir 100 ml de cultivo de una noche a 100 ml de TB que contenía 75 mg / ml de higromicina en un matraz agitador desconcertado (dilución es decir, 1 / 1.000). Incubar el cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas con agitación 225 rpm. </li></ol></li><li> Después de cultivo durante la noche, extraer y purificar el ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante de kit de preparación de midi / maxi con la siguiente excepción; durante la última etapa del ADN, o volver a suspender eluyen con agua (pH 7,0-8,5). </li><li> Compruebe concentración y pureza del ADN por lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm entonces almacenar ADN a -20 ° C. NOTA: Opcional (muy recomendable): Secuencia de ADN utilizando cebadores específicos del vector para confirmar la identidad. </li></ol> 2. Transfección estable de células HEK-293 <ol><li> Crecer y mantener las células HEK-293 (células en suspensión) de acuerdo con protocolos estándar en medio libre de suero suplementado con agente tensioactivo no iónico 0,1% en matraces Erlenmeyer. Mantener a 2 x 10 5 células / ml y subcultivo cada cuatro días. Células de cultivo a 37 ° C con 5% de CO2 y 120 rpm de rotación. Nota: Las celdas deberían haber estado en cultivo durante no menos de 4 días y no más de 4 semanas antes de la transfección. células HEK-293 que crecen como monocapas en medios que contienen suero también se pueden utilizar para este procedimiento. </li><li> En el día antes de la transfección, las células de semillas HEK-293 a 3 x 10 5 células / ml en pocillos de una placa de 12 pocillos en 2 ml de Dulbecco modificado de Eagle Media (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% ( FBS). En el día de la transfección, comprobar que las células han alcanzado el 80-90% de confluencia </li><li> Diluir el ADN y polietilenimina (PEI) por separado en el medio de transfección a continuación, mezclar juntos.<ol><li> Diluir 1,25 g vector de ADN por pocillo (15 g de 12 pocillos) en 300 l medio de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Diluir 2,5 l de 1 mg / ml solución PEI (30 l para 12 pocillos, es decir, proporción de 1: 2 de ADN para PEI) en 300 l medio de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir DNA diluido para diluida PEI, mezclar suavemente y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. </li></ol></li><li> Añadir 50 l de ADN / PEI mezcla gota a gota a cada pocillo de la placa. Oscilar suavemente la placa para distribuir la mezcla de transfección y posicionar la placa a 37 ° C, 5% de CO2 durante 24 horas. </li><li> Añadir 50 g / ml de higromicina B por pocillo y la placa de volver a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 días. NOTA: Para el día 10, las células transfectadas-un habrán muerto y separado de la superficie de la placa, mientras que las células transfectadas establemente serán viables y unida a la placa. </li><li> Vuelva a colocar los medios de comunicación en los pozos con1/4 medio libre de suero de volumen y 3/4 volumen de DMEM suplementado con FBS al 10% (es decir, 0,5 ml de medio libre de suero + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentración final de suero) y se incuba durante 4 días. </li><li> Reemplazar los medios de comunicación en los pozos con 1/2 medio libre de suero y de volumen medio DMEM volumen suplementado con 10% FBS (medio libre de suero es decir, 1 ml + 1 ml de DMEM = 5% de concentración final de suero) y se incuba durante 4 días. </li><li> Reemplazar los medios de comunicación en los pozos con 3/4 medio libre de suero de volumen y 1/4 volumen de DMEM suplementado con FBS (+ 0,5 ml de DMEM = concentración sérica es decir, 1,5 ml de medio libre de suero 2,5% final) 10% e incubar durante 4 días. </li><li> Reemplazar los medios de comunicación en los pocillos con 2 ml de medio libre de suero suplementado con 0,1% de tensioactivo no iónico (concentración final de suero es decir, 0%) y se incuba durante 4 días. NOTA: Mantener 50 mg / presión selectiva ml higromicina B en las células durante la adaptación libre de suero. Las células adaptadas a medios libres de suero se desprenden de la superficie de los pozos y pueden agruparse in suspensión. Consulte el paso 2.1 para las condiciones de cultivo con el suplemento adicional de 50 mg / ml de higromicina B. </li><li> Con una pipeta, mezclar suavemente los cultivos en suspensión en las células de la placa y la piscina de 12 pocillos en un tubo separado. <ol><li> El uso de un hemocitómetro, enumerar células agrupadas y semilla en 30 ml de medio libre de suero en un matraz Erlenmeyer a 2 x 10 5 células / ml. Células de cultivo a 37 ° C con 5% de CO2 y 120 rpm de rotación. Subcultura y ampliar cada cuatro días. </li></ol></li><li> Continuar ampliando el tamaño de la cultura a la densidad celular requerida para obtener 10 viales a las células 1 x 10 7 / vial de crioconservación en nitrógeno líquido. Congelar las células en medio libre de suero que contiene 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: acondicionado medios que contienen anticuerpos pueden ser cosechadas en cada subcultivo para confirmar la producción de proteínas o se utilizan para optimizar las condiciones de purificación. Para cosechar los medios condicionados y mantener las células de la subcultura, centrifugar el cultivo a300 xg durante 5 min luego filtrar-esterilizar sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras. sobrenadante filtrado puede mantenerse a 4 ° C durante 1-2 semanas o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 3. Gran Escala Producción de anticuerpos a partir de lotes overgrow Cultura NOTA: La producción de anticuerpos se puede seguir en el paso de 2.11 donde las células existentes se expanden a la densidad celular requerida sobre la base del volumen de cultivo por lotes overgrow ser de configuración. De lo contrario, las células que han sido descongelados de criopreservación comienzan en esta etapa una vez expandido a una densidad celular apropiada y volumen. Varios suplementos de cultivo se pueden usar para optimizar la producción de anticuerpos; el uso de triptona para aumentar el rendimiento del anticuerpo se demuestra en este protocolo. <ol><li> Se siembran las células a 2 x 10 5 células / ml en medio libre de suero de 100 ml en dos matraces Erlenmeyer (para comparar los rendimientos de anticuerpos a partir de cultivos de la ONU-complementado y completado en nutrientes). Cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2 </sub&gt; y 120 rpm. </li><li> Después de 24 h, añadir triptona a una concentración final de 0,5% a cultivo nutriente suplementado. Igualar el volumen de la cultura no-suplementado con medio libre de suero. </li><li> De día 8, lleve a cabo los recuentos de células de los cultivos diariamente usando un hemocitómetro para monitorizar la viabilidad celular. Recoger los sobrenadantes de cultivo una vez que la viabilidad celular es menor que 80%. <ol><li> Cosecha sobrenadante por centrifugación de los cultivos a 3.000 xg durante 15 min a continuación, filtrar-esterilizar el sobrenadante (que contiene el anticuerpo) a través de un filtro de 0,22 micras. Almacenar los sobrenadantes a 4 ° C (a corto plazo) o se congelan a -20 ° C (a largo plazo). </li></ol></li></ol> 4. Purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad El uso de una cromatografía de líquidos automatizado de proteínas Fast System (FPLC) NOTA: El siguiente procedimiento general se puede aplicar a sistemas más automatizados. La purificación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 ° C (si el sistema de FPLC se mantiene en una habitación fresca).Una serie de pruebas de exploración se puede realizar para identificar las condiciones óptimas de purificación incluyendo matriz de columna apropiada, tampón, tampón de elución y pH de unión para asegurar la máxima recuperación de anticuerpo purificado a partir de medio condicionado (consulte la sección Resultados). Las condiciones óptimas dependen del anticuerpo o proteína que se purifican. Las purificaciones se realizaron en un sistema de FPLC automatizado. Las purificaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente usando una proteína de 5 ml una columna. <ol><li> Preparar los siguientes tampones usando agua ultrapura y ajustar el pH recomendado para luego filtrar a través de un filtro de 0,22 micras. <ol><li> Preparar 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (tampón de unión) mediante la mezcla de los siguientes: M NaCl 0,14, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 y 0,001 M KH 2 PO 4. Ajustar el pH si es necesario antes de filtrar la memoria intermedia. </li><li> Preparar 500 ml de pH 2,7 (tampón de elución) 0,1 M glicina-HCl. Ajustar el pH antes de filtrar la piel de anteer. </li><li> Preparar 50 ml de M Tris pH (tampón de neutralización) 9,0 1. </li></ol></li><li> Asegurar que todas las conexiones de alimentación y del sistema de comunicación con el ordenador se realizan. Los dispositivos deben ser visibles en el módulo &quot;Control System &#39;software. Asegúrese de célula UV se fija en 280 nm longitud de onda. Opcional: Calibre metros pH si está conectado y para ser utilizado. </li><li> Sumergir los tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura para lavar el sistema. Purgar las bombas con una jeringa si hay aire en el tubo o una sospecha de aire en el sistema. Lavar el sistema con agua por la operación manual a través del controlador del sistema o a través de un método automatizado. Observe que la presión, conductividad, pH y rastreo UV280 se mantienen consistentes y que el límite de presión de la columna no se excede según la especificación del fabricante. NOTA: Las anomalías pueden indicar el aire o el bloqueo en el sistema que debe ser tratada antes de continuar. </li><li> En el módulo controlador del sistema, inicie el caudal a 1ml / min de forma manual a través de la bomba A, ya sea en la carga (sin pasar por el loop de muestra) o inyectar (a través de la muestra circular) condiciones de iniciar la conexión de la columna. sistema de tubos de desconexión en la entrada de posición de la columna y retirar el tapón conectado a la entrada de la columna. <ol><li> Permitir que el agua fluya desde el tubo de gota a gota sistema en la parte superior de la columna a continuación, conectar el tubo del sistema a la columna. Tener la entrada de la columna y el accesorio de entrada desbordante de gotas de agua asegura una conexión libre de burbujas de aire. </li></ol></li><li> Una la salida de la columna en la salida de aguas abajo y verifique que todos los accesorios están bien apretados. Con la columna que ahora se atribuye al sistema, no superarán los límites aplicables límite máximo de presión y caudal como se indica en las especificaciones de las columnas. </li><li> Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (CV) de agua. Si es necesario, continúe hasta que la columna de lavado UV280 trazado se ha estabilizado. </li><li> Sumergir los tubos de entrada de A en tampón de unión, B en el tampón de elución y la bomba de la muestra en tampón de unión to equilibrar el sistema en tampones correctos. Llenar los tubos de entrada con tampón utilizando PumpWash por la operación manual. </li><li> En el módulo del software del &#39;Editor de métodos&#39;, utilice el asistente método para configurar un método de cromatografía de afinidad por la columna que está destinado a ser utilizado. NOTA: Los sistemas automatizados de FPLC vienen con métodos pre-llenados con la configuración recomendada (es decir, caudal y presión límite) y ejecutar medidas en base a la columna (fabricante, matriz y tamaño) seleccionada para la purificación. <ol><li> Utilice los siguientes pasos de ejecución para la proteína A cromatografía de afinidad: <ol><li> el sistema se equilibre con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un contenedor de residuos. </li><li> Cargar la muestra en la columna (volumen se va a cargar manualmente se especifica en el método) y recoger caudal contínuo en un recipiente separado. </li><li> Sistema de lavado con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un recipiente separado. </li><li> la columna se eluye con 5 CV isocratfraccionamiento ic usando tampón de elución y tomar la muestra anticuerpo purificado como fracciones de colector de fracciones. </li><li> el sistema se equilibre con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un contenedor de residuos. </li></ol></li></ol></li><li> Una vez que el método ha sido configurado, especificar el volumen de medio acondicionado que ha de aplicarse a la columna y guardar el método. Nota: El volumen especificado en el método debe ser 5 a 10 ml menor que el volumen real para evitar la introducción de aire durante la carrera de la muestra. El volumen específico utilizado en este protocolo es de 90-120 ml. </li><li> Sumergir el tubo de la bomba de la muestra en el recipiente que contiene el medio condicionado. </li><li> Preparar un recipiente separado para recoger flujo a través de la muestra a través de la tubería de salida especificado. NOTA: Es importante recoger el caudal contínuo en el caso de que ocurra un error durante la ejecución o la capacidad de fijación de la columna se supera el caudal contínuo que requiere volver a aplicar a la columna o la purificación repeated. </li><li> Preparar los tubos de recogida en el colector de fracciones. Añadir 100 l de tampón de neutralización por 1 ml de volumen de fracción. El sistema FPLC se eluir automáticamente las fracciones en los tubos de recogida. </li><li> En el módulo del software del &quot;Sistema de Control&quot;, abra el método que se ejecute. NOTA: El desarrollo del método se inicia en una serie de páginas que incluyen la comprobación de las variables del método, la configuración de colector de fracciones y la definición de nombre de archivo de resultados y la ubicación de almacenamiento. </li><li> Haga clic en Inicio para iniciar la carrera. La carrera se puede controlar en el módulo &quot;Control System &#39;. </li><li> En la terminación de la ejecución de la purificación, comprobar el cromatograma resultante en el módulo &quot;Evaluación&quot; en el software del sistema. </li><li> Combinar todas las fracciones que contienen proteínas en un tubo, intercambio de tampón separar y concentrar en PBS usando un dispositivo de filtración centrífuga con 30 kDa de peso molecular de corte. Realice los pasos de centrifugación de acuerdo con el fabricante delinstrucciones. </li><li> Medir la concentración de anticuerpos usando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante. </li><li> Si otro purificación de ejecución se va a realizar, el primer tubo de la bomba de la muestra en tampón de unión y repita los pasos 4.9 a 4.14. </li><li> En la terminación de carreras de purificación, sumergir tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura y se lava el sistema y la columna tal como se realizó en el paso 3. </li><li> Sumergir A, B y tubería de la bomba de la muestra en un 20% de etanol y repita el procedimiento de lavado para el almacenamiento del sistema y la columna. </li><li> Desconectar la columna de la toma de corriente abajo y vuelva a colocar el tapón de columna, a continuación, desconecte la columna en la entrada y vuelva a colocar el tapón, vuelva a conectar la tubería al sistema. Almacenar la columna a 4 ° C. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo se detalla la transfección, la expresión estable y la purificación de un anticuerpo terapéutico en las células HEK-293. La expresión estable de genes de anticuerpos es el primer paso en la generación de una línea celular productora de anticuerpos para el desarrollo y fabricación de un anticuerpo terapéutico. Mientras ovario de hámster chino (CHO) siguen siendo la plataforma de expresión de elección para proteínas terapéuticas, la línea celular HEK-293 está ganando importancia con la comprensión de que las...

El éxito de anticuerpos terapéuticos continúa impulsando la inversión sustancial en el desarrollo de anticuerpos como comienza una ola de terapias de próxima generación. Se espera que el mercado de anticuerpo que se ha reformado por fragmentos de anticuerpos 1, conjugados de anticuerpo-fármaco 2, anticuerpos biespecíficos 3 y anticuerpos diseñados con propiedades favorables 4. Otra clase ganando interés farmacéutico son bioequivalentes. anticuerpos biosimilares son &quot;muy similares&quot; replicar productos de un anticuerpo terapéutico que ya ha recibido la aprobación regulatoria. A biosimilar propuesto debe ser comparable con el anticuerpo iniciador con respecto a su estructura, la función, la toxicidad animal, la seguridad clínica y eficacia, farmacocinética (PK) humanos, la farmacodinámica (PD) y la inmunogenicidad 5, 6. La aprobación rAtes de anticuerpos biosimilares han sido lentos debido a las limitaciones estrictas sobre la calidad final del producto. Los procesos de fabricación exactas tales como líneas celulares y condiciones de cultivo específico a través de las etapas de procesamiento finales pueden permanecer propietario. Lo que es más, la fabricación de anticuerpos implica inherentemente un grado de variabilidad que se puede agregar al desafío de producir un producto muy similar. Una caracterización fisicoquímica y biofísica exhaustiva y la comparación es bastante difícil, sin embargo, una serie de estudios que demuestran las características de los anticuerpos biosimilares están surgiendo en la literatura 7, 8, 9. Generación de un anticuerpo terapéutico comienza con la transfección de células huésped de mamífero con un vector que lleva los genes para el anticuerpo respectivo. diseño del vector, de línea y de cultivo celular condiciones son consideraciones clave para la creación de la exsistema de compresión. Las secuencias de ADN de anticuerpos pueden ser obtenidos de Banco de Drogas (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o publicaciones de investigación, incluidas las patentes. Por ejemplo, la secuencia de trastuzumab está disponible a través del Banco de Drogas (DB ID: DB00072). La secuencia de aminoácidos de las regiones variables puede someterse a diseño y optimización de genes para la síntesis en las especies huésped deseadas. Es importante para un anticuerpo biosimilar que ninguna modificación se hace a la secuencia de aminoácidos. Una vez sintetizados, los genes de anticuerpos se pueden subclonar en el vector apropiado de elección. anticuerpos IgG humanos consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Expresión estrictamente regulados de ambas cadenas es esencial para la producción óptima de la proteína heteróloga IgG en células de mamíferos 10. Intra, así como enlaces disulfuro entre cadenas tienen que ser formado y una serie de modificaciones posteriores a la traducción tiene que estar enintrodujo durante la biosíntesis de proteínas. Una serie de vectores están disponibles que se han diseñado específicamente para expresar genes de anticuerpos (consulte la Tabla de Materiales). Estos vectores en anticuerpos específicos por lo general expresan las regiones constantes de las cadenas tanto pesada y ligera de modo que sólo las regiones variables de cada cadena requieren clonación. La transfección de células con dos constructos independientes (co-transfección) es el método más común para la entrega de genes pesados ​​y ligeros de la cadena que codifica. Es decir, cada gen es conducido por su propio promotor y transcribe como cadenas de anticuerpo separados antes de ser montado en el retículo endoplásmico. Por otra parte, los vectores de multi-cistrónicos tienen elementos internos sitio de entrada al ribosoma (IRES) incorporados que permiten la expresión de múltiples genes como un único transcrito de ARNm con la traducción permitida de las regiones internas del mRNA 11. En este caso, los genes de cadena pesada y ligera que codifica se acoplan en un arrangement para lograr la co-expresión de ambas cadenas de anticuerpo 10, 12. Mientras que las células transfectadas transitoriamente rendimiento de proteína suficiente para realizar un número limitado de experimentos, las líneas celulares transfectadas de manera estable que han sido sometidos a selección para la integración del genoma pueden ofrecer rendimientos más altos. Las cantidades de proteína más altos permiten para el desarrollo del ensayo relativo a la caracterización in vitro y pueden proporcionar una indicación de la calidad del anticuerpo en consideración para aplicaciones posteriores tales como la línea celular clonal y la selección de candidatos de plomo. El objetivo de este artículo es describir la expresión estable y purificación de un anticuerpo terapéutico producido en un sistema de expresión de mamífero. De hecho, este método se puede aplicar a la expresión de un anticuerpo biosimilar. El método puede ser utilizado para la caracterización inicial de los anticuerpos antes de proceder a la crítica, aunque ste tiempops de identificar un clon deseable para la fabricación a mayor escala. Por otra parte, este método se puede utilizar para expresar otras proteínas y no sólo los anticuerpos. El siguiente protocolo describe la expresión detallada de trastuzumab anticuerpo terapéutico. Esta consiste en la preparación de ADN del vector seguido de transfección estable en la línea celular HEK-293 y la purificación de la proteína de anticuerpo por un método de cromatografía automatizado.

<table><tbody><tr><td>Serie de vectores pFUSE</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Genes de anticuerpos pesados y ligeros expresados en vectores separados que requieren co-transfección.</td></tr><tr><td>Serie de vectores mAbXpress</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Genes de anticuerpos pesados y ligeros expresados en vectores separados que requieren co-transfección. Véase: Jones, M. L. et al. Método para el reformateo rápido e independiente de la ligadura de anticuerpos monoclonales recombinantes. J Métodos Immunol. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>Vector pVITRO1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Los genes de anticuerpos pesados y ligeros son impulsados cada uno por un promotor separado en un solo vector. Consulte: Dodev, T. S. et al. Un kit de herramientas para la clonación rápida y la expresión de anticuerpos recombinantes. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr>Vector multicistrónico <td>Lonza</td><td></td> de la serie de vectores <td>GS</td><td>con genes de anticuerpos pesados y ligeros coexpresados y traducidos como transcripción única.</td></tr><tr><td>Serie de vectores multicistrónicos 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vector multicistrónico con genes de anticuerpos pesados y ligeros coexpresados y traducidos como transcripción única. Véase: Li, J. et al. Un estudio comparativo de diferentes diseños de vectores para la expresión de anticuerpos IgG recombinantes en mamíferos. J Métodos Immunol. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Serie de vectores multicistrónicos 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vector multicistrónico con genes de anticuerpos pesados y ligeros coexpresados y traducidos como transcripción única. Consulte: Ho, S. C. et al. Vectores tricistrónicos mediados por IRES para mejorar la generación de líneas celulares de alta expresión de anticuerpos monoclonales CHO. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Vector de expresión de mamíferos que contiene genes de anticuerpos de trastuzumab con gen de resistencia a la higromicina; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa; fue un regalo de Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Agar Hygro de medios rápidos</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Se utiliza para preparar agar LB bajo en sal que contiene 75 y micro; g/ml de higromicina.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Se utiliza para preparar caldo de TB bajo en sal que contiene 75 y micro; g/ml de higromicina.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol, BioXtra, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Preparar al 80% con agua y autoclave. Almacene a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; eluir o resuspender el ADN en agua (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 línea celular adaptada al cultivo en suspensión en medios sin suero.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Medios sin suero especialmente formulados para mantener la línea celular 293-F y la alta expresión de proteínas.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Surfactante no iónico; plurónico F-68; preparar al 10% en agua y filtrar-esterilizar usando 0.22 &mu; Filtro M. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, lineal, MW 25,000&nbsp;</td><td>Policiencias, Inc.</td><td>23966</td><td>Preparar hasta 1 mg/ml en agua. Ajustar a pH 7.0 con 1 M HCl (la solución se vuelve transparente) y filtrar-esterilizar usando 0.22 &mu; Filtro M. Almacenar a -80 &deg; C hasta su uso.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM Life</td><td>Technologies</td><td>12309-050</td><td>Medios sin suero formulados por transfección</td></tr><tr><td>Solución de higromicina B Jomar</td><td>Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> AJA2225 <td></td></tr><tr><td>Triptona (peptona de caseína)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare al 20% en PBS y filtre-esterilice usando 0.22 &mu; Filtro M. Almacenar a 4 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 columna de 5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Sistema FPLC automatizado, que puede incluir una bomba de muestra P-960 y un colector de fracciones Frac-920.</td></tr><tr><td>Glicina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico, monohidrato</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio, sal trisódica dihidratada&nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M solución de Tris-HCl pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Filtros centrífugos (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Se utiliza para amortiguar, intercambiar y concentrar proteínas purificadas.</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) Pierce</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrumento utilizado para mediciones de interferometría de biocapa (BLI).</td></tr><tr><td>Biosensores de proteína A</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida/Bisacrilamida (37.5:1), solución al 40%</td><td>Persulfato</td> de amonio Astral Scientific <td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>(APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brillante R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Proteína de doble color </td><td>1610374</td><td></td> <td>Bio-Rad</td> estándar</tr></tbody></table>

laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Asegurar la producción exitosa de un anticuerpo terapéutico comienza temprano en el proceso de desarrollo. La primera etapa es la expresión vectorial de los genes del anticuerpo, seguida de una transfección estable en una línea celular adecuada. Los clones estables se someten a cribado con el fin de seleccionar aquellos clones con las características de producción y crecimiento deseadas. Este es un paso crítico, aunque requiere mucho tiempo. Este protocolo considera la selección de vectores y la obtención de secuencias de anticuerpos para la expresión de un anticuerpo terapéutico. Los métodos describen la preparación de ADN vectorial para la transfección estable de una variante en suspensión de la línea celular de riñón embrionario humano 293 (HEK-293), utilizando polietilenimina (PEI). Las células se transfectan como células adherentes en medios que contienen suero para maximizar la eficiencia de la transfección y, posteriormente, se adaptan a condiciones sin suero. La producción a gran escala, configurada como cultivos de crecimiento excesivo por lotes, se utiliza para producir proteínas de anticuerpos que se purifican mediante cromatografía de afinidad utilizando un instrumento automatizado de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). Los rendimientos de anticuerpos producidos por este método pueden proporcionar suficiente proteína para comenzar la caracterización inicial del anticuerpo. Esto puede incluir el desarrollo de ensayos in vitro o la caracterización fisicoquímica para ayudar en la laboriosa tarea de cribado clonal de los candidatos principales. Este método puede ser transferible al desarrollo de un sistema de expresión para la producción de anticuerpos biosimilares.

Producción estable de trastuzumab por las células HEK-293 transfectadas se confirmó usando interferometría bio-capa (BLI) tal como se presenta en la Figura 1. Una curva estándar de IgG se generó mediante la medición de la tasa de unión entre un estándar de anticuerpo IgG y proteína A biosensor (Figura 1A). La muestra de sobrenadante crudo se midió de manera similar, a continuación, su concentración interpolada a partir de la curva estándar (Figur...

Este protocolo describe la producción de un anticuerpo terapéutico en un sistema de expresión de mamífero. Los métodos descritos incluyen la preparación del ADN del vector, transfección estable y la adaptación libre de suero de una línea celular de riñón embrionario humano 293, puesta en marcha de cultivos a gran escala y la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

El objetivo general de este método es desarrollar un sistema de expresión libre de suero con alto rendimiento para la producción a escala de laboratorio de un anticuerpo terapéutico. Este método puede abordar aspectos clave en el diseño de un sistema de expresión de anticuerpos, como la producción de una línea celular estable, la adición de suplementos y la optimización de estrategias de purificación. La principal ventaja de esta técnica es que la producción de una línea celular estable adaptada a medios sin suero generará cantidades robustas y reproducibles de anticuerpo terapéutico.Para comenzar, cultive células HEK-293 según protocolos estándar en medio libre de suero suplementado con 0,1 % de surfactante no iónico, en matraces Erlenmeyer. Incube las células a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono a 120 rotaciones por minuto. Mantenga el cultivo a dos veces 10 a la quinta células por mililitro y realice subcultivos cada cuatro días.El día anterior a la transfección, siembre las células HEK-293 a una concentración de tres veces 10 a la quinta células por mililitro en los pocillos de una placa de 12 pocillos con dos mililitros de DMEM que contenga 10% de SFB inactivado por

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

Este vídeo muestra una técnica para estudiar la localización in vivo de anticuerpos específicos de tumor en un modelo de xenoinjerto tumoral de ratón. Al inyectar células cancerosas por vía subcutánea en ratones para la formación de tumores, se inyectan anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a los receptores específicos del tumor, lo que permite la evaluación in vivo de la localización de anticuerpos mediante imágenes.

Una técnica para evaluar la localización in vivo de anticuerpos específicos contra tumores

El video explica el proceso de producción de anticuerpos en células huésped de mamíferos, desde la expresión génica hasta la secreción. Implica la transcripción, la traducción, el reconocimiento de señales, el plegamiento correcto y la eventual liberación en el medio extracelular a través de vesículas secretoras.

Producción y purificación de anticuerpos recombinantes a partir de células de mamíferos

Este video muestra un ensayo para purificar anticuerpos monoclonales a partir de líquido de cultivo celular recolectado de células de ovario de hámster chino. Emplea una resina de vidrio porosa con proteína A inmovilizada, que se une a la región Fc de los anticuerpos en la muestra, separándolos efectivamente de los contaminantes. El uso de un tampón de elución de pH bajo debilita la interacción, facilitando la recuperación de anticuerpos purificados.

Una técnica para purificar anticuerpos monoclonales producidos por células de ovario de hámster chino

El video muestra un método para producir anticuerpos terapéuticos utilizando células de mamíferos transfectadas de manera estable. La suplementación con triptonas estimula la división celular, lo que resulta en un crecimiento excesivo y apoya una mayor producción de anticuerpos. El medio que contiene anticuerpos se recolecta, se filtra y se almacena para su uso posterior.

Producción de anticuerpos a partir de un cultivo de sobrecrecimiento por lotes de células de mamíferos transfectadas

Este video muestra una técnica para purificar anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo obtenido de un cultivo celular productor de anticuerpos. El proceso implica el uso de una matriz de perlas de agarosa reticuladas con proteína A conjugada, que inmoviliza los anticuerpos en el sobrenadante de las perlas, lo que permite una separación efectiva de los contaminantes. Al aplicar un tampón de elución con pH bajo, se afloja la interacción proteína-anticuerpo, lo que facilita la...

Una técnica de cromatografía de afinidad para la purificación de anticuerpos monoclonales

Este video muestra un método para detectar las cepas de cianobacterias en una muestra ambiental utilizando un chip de microarray de anticuerpos. Las muestras portadoras de varias bacterias interactúan con los anticuerpos impresos, y la inmunotinción con anticuerpos anticianobacterianos marcados con fluoróforos revela la presencia de cepas específicas de cianobacterias a través de la fluorescencia en distintos puntos.

Una técnica para detectar cepas de cianobacterias utilizando un chip de micromatriz de anticuerpos

La presencia de toxinas cianobacterianas en los embalses de agua dulce para consumo humano es una gran preocupación para las autoridades de gestión del agua. Para evaluar el riesgo de contaminación del agua, este artículo describe un protocolo para la detección en campo de cepas de cianobacterias en muestras líquidas y sólidas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos.

Protocolo Experimental para la detección de Las cianobacterias En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

Se ha descrito un protocolo detallado para la purificación y posterior análisis posterior de un anticuerpo monoclonal a partir del fluido de cultivo celular cosechado (HCCF) de microbiorreactores automatizados. También se presenta el uso de análisis para determinar los atributos de calidad críticos (CQA) y maximizar el volumen de muestra limitado para extraer información vital.

Purificación y análisis de un anticuerpo monoclonal de células de ovario de hámster chino utilizando un sistema automatizado de microbiorreactores

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Aprende a producir anticuerpos terapéuticos a gran escala usando células HEK-293 en medio libre de suero. Este protocolo establece líneas celulares estables y optimiza la purificación por cromatografía de afinidad.

Laboratorio de producción a gran escala y purificación de un anticuerpo terapéutico

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