Name: Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende la síntesis de 1,2-azaborinas y la preparación de complejos proteicos con mutantes de lisozima T4. Este método confiable permite funcionalizar precursores para aplicaciones biomédicas avanzadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud NIGMS (R01-GM094541) y Boston College.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

Todos los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos en este manuscrito.

En la primera parte de este protocolo, se describe una síntesis modificada de 1,2-azaborines basadas en métodos reportados previamente 12, 13. Triallylborane 22 fue utilizado como un sustituto de las rutas usando allyltriphenyl estaño o de potasio allyltrifluoroborate para preparar N -allyl- N -TBS- B alil aducto de cloruro de (1). Este método permite un enfoque más átomos-económica y respetuosa...

El boro-heterociclos que contienen nitrógeno (es decir, 1,2-azaborines) recientemente han llamado la atención significativa como isosteras de arenos. Este isosterism puede conducir a la diversificación de los motivos estructurales existentes para ampliar el espacio químico 2, 3, 4. Azaborines tienen utilidad potencial para la aplicación en la investigación biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente en el área de la química médica en la que los químicos llevar a cabo la síntesis de bibliotecas de moléculas estructuralmente y funcionalmente relevantes. Significativamente, sin embargo, si bien hay numerosas rutas sintéticas bien desarrollados a moléculas que contienen areno-disponibles, se han reportado sólo un número limitado de métodos para la síntesis de azaborines 9, 10, </shasta&gt; 11, 12, 13. Esto se debe principalmente a un número limitado de opciones para la fuente de boro y el aire y la naturaleza sensible a la humedad de la molécula en la fase inicial de la secuencia sintética. En la primera parte de este artículo, describiremos una síntesis escala multi-gramo de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) usando técnicas sin aire estándar. Este compuesto sirve como un intermedio versátil que puede ser además funcionalizado para estructuralmente más complejas moléculas 14, 15. A partir de 3, se describirán la síntesis y purificación de N -H- B etil-1,2-azaborine (5) para su uso en estudios de unión a proteínas. Debido a la volatilidad de 5, su aislamiento eficiente requiere un control preciso de la temperatura de reacción, tiempo, y distillation condiciones. En la segunda parte, los protocolos para la expresión de proteínas y el aislamiento de mutantes T4 lisozima (L99A y L99A / M102Q) 17, 18, 19, se presentarán 20, seguido de la cristalización de proteínas y la preparación de los complejos de cristal de proteína-ligando. Mutantes de lisozima T4 L99A y L99A / M102Q fueron elegidos como modelo de los sistemas biológicos para examinar la capacidad de enlace de hidrógeno de las moléculas que contienen NH azaborine 17. El uso de un protocolo de biología molecular estándar, la proteína se expresa en la cepa Escherichia coli RR1 y indujo con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Purificación de proteínas se lleva a cabo usando cromatografía en columna de intercambio iónico. cristalización de proteínas se lleva a cabo con una solución altamente concentrada y purificada de proteínas (&gt; 95% de pureza por electroforesis en gel) usando el colgantedeje caer método de difusión de vapor. Debido a la sensibilidad de los ligandos de este estudio para el oxígeno, los complejos proteína-ligando se preparan en condiciones libre de aire.

<table><tbody><tr><td>Tetrahidrofurano (THF), sin inhibidores, para HPLC, &ge; 99.9%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico (Et2O), para HPLC, &ge; 99.9%, sin inhibidores</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de metileno&nbsp; (CH2Cl2), (Estabilizado/Certificado ACS)</td><td>Fisher</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Fisher</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>Pentano, HPLC</td><td>Fisher</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>Hidruro de calcio (CaH2), grado reactivo, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208027</td><td>Paladio pirofórico</td></tr><tr><td>sobre carbón activado (Pd/C), 10 % en peso de Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Solución de tricloruro de boro en hexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>211249</td><td>Trietilamina altamente tóxica/pirofórica</td></tr><tr><td>, &ge; 99.5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st generación de catalizadores&nbsp;</td><td>materia</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>Acetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol, anhidro, 99.8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>solución de etilitio, 0.5&nbsp; M en benceno/ciclohexano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>561452</td> Solución de HCl <td>altamente tóxico/pirofórico</td></tr><tr><td>, 2.0 M en Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano, anhidro, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli, (Migula) Castellani y Chalmers (ATCC&reg; 31343&trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lisozima WT* (L99A)</td><td>Addgene</td><td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 lisozima mutante (S38D, L99A, M102Q, N144D)</td><td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina, sal sódica</td><td>Sigma Aldrich</td>, <td>A0166</td><td></td></tr>, <tr><td>isopropil-&beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico anhidro</td><td>Fisher</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro</td><td>Fisher</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Fisher</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4880</td><td>Corrosivo</td></tr><tr><td>Perforación termocientífica DNaseI</td><td>Fisher</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; Medios de intercambio catiónico de flujo rápido Sepharose</td><td>Fisher</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td> altamente tóxico <td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp; Vivaspin 20 Concentradores centrífugos</td><td>Fisher</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-disulfuro de hidroxietilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratono&nbsp;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC Tubo de membrana de diálisis 12,000 a 14,000 Dalton MWCO&nbsp;</td><td>Pescador</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>tubo criogénico en forma de bucle</td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Pinza criogénica</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td></td><td></td><td>Las imágenes de densidad de electrones se generan a partir del software</td></tr></tbody></table>

síntesis de 1,2-azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima t4 mutantes

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Describimos una síntesis general de 1,2-azaborinas utilizando técnicas estándar de aire libre y preparación de complejos de proteínas con mutantes de lisozima T4 por difusión de vapor. Los compuestos sensibles al oxígeno y a la humedad se preparan y aíslan bajo una atmósfera inerte (N2) utilizando un colector de gas de vacío o una guantera. Como ejemplo de síntesis de azaborina, demostramos la síntesis y purificación del volátil N-H-B-etil-1,2-azaborina mediante una secuencia de cinco pasos que incluye destilación y cromatografía en columna para el aislamiento de productos. Los mutantes de lisozima T4 L99A y L99A/M102Q se expresan con la cepa RR1 de Escherichia coli. Los protocolos estándar para la lisis celular química seguida de purificación mediante una columna de intercambio iónico de carboximetilo proporcionan proteínas de pureza suficientemente alta para la cristalización. La cristalización de proteínas se realiza en varias concentraciones de precipitante a diferentes rangos de pH utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante. La preparación compleja con las moléculas pequeñas se lleva a cabo mediante el método de difusión de vapor bajo una atmósfera inerte. El análisis de difracción de rayos X del complejo cristalino proporciona evidencia estructural inequívoca de interacciones de unión entre el sitio de unión a la proteína y las 1,2-azaborinas.

La vía de síntesis esquemático para 1,2-azaborines se muestra en la Figura 1. Este protocolo se aplica a la síntesis de cinco moléculas de nitrógeno que contiene boro diferentes. La Figura 2 representa los espectros de 11 B NMR medida durante el curso de la etapa 1.3 para monitorizar la formación del producto deseado (3). Purificación de proteínas se realizó mediante el uso de sistema de cromatografía de baja presión y un crom...

Se presenta un protocolo para la síntesis de 1,2-azaborinas y la preparación de sus complejos proteicos con mutantes de lisozima T4.

Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

El objetivo general de este protocolo es describir un método general para sintetizar 1,2-azaborinas y su posible aplicación en la investigación biomédica. La principal ventaja de esta técnica es que permite una síntesis segura de compuestos de 1,2-azaborina, que son isósteros que contienen boro del omnipresente motivo bencénico. El precursor descrito puede funcionalizarse aún más en moléculas potencialmente más complejas.La preparación de complejos proteicos con 1,2-azaborina proporcionará cierta información sobre aplicaciones futuras en la investigación biomédica. Para comenzar este procedimiento, prepare el producto con anillo cerrado según se describe en el protocolo escrito. Añada 14 gramos de paladio sobre carbono a este producto preparado en tolueno.A continuación, retire el matraz del recipiente. Coloque en el matraz un condensador de reflujo de 24/40 secado en estufa y purgado con nitrógeno, equipado con agua fría. Coloque el matraz en un baño de aceite y caliente la reacción hasta alcanzar un reflujo vigoroso a 135 grados celsius, agitando al mismo tiempo.Mantenga la reacción en reflujo durante 16 horas. Después de esto, retire el matraz del baño de aceite para enfriar la reacción a temperatura ambiente. Una vez enfriado, sustituya el condensador de reflujo por el septo en el matraz de reacción.Utilizando una jeringa equipada con una aguja Luer Lock secada en horno, retire una alícuota de 5 mililitros. Transfiera la alícuota a un tubo para RMN con tapón roscado. Analice la muestra mediante RMN de Boro-11.Si la reacción es incompleta, transfiera el matraz de reacción a una caja de guantes. Luego, agregue tres gramos adicionales de paladio sobre carbón. A continuación, retire el matraz de la caja de guantes.Coloque en el matraz un condensador de reflujo 24/40 que haya sido purgado con nitrógeno y equipado con agua fría. Mediante un baño de aceite, caliente la reacción hasta alcanzar un reflujo vigoroso a 135 grados celsius, agitando durante 24 horas. Utilizando resonancia magnética nuclear de boro-11, analice otra alícuota para asegurarse de que la reacción esté completa.Después de esto, transfiera el matraz de reacción de vuelta a la caja de guantes. Pase la mezcla de reacción a través de una columna de cromatografía flash empaquetada con toallitas de papel. Luego, recoja el filtrado en un matraz redondo de un litro equipado con una barra de agitación.Lave la columna con 50 mililitros de tolueno. Retire el recipiente del filtrado de la caja de guantes y conéctelo a un sistema de vacío equipado con una línea de nitrógeno. Coloque un baño de agua debajo del matraz y un recipiente Dewar que contenga nitrógeno líquido para atrapar el disolvente.Abrir la válvula de alto vacío para comenzar la eliminación de todos los volátiles del filtrado. Luego, devolver la mezcla de reacción a la caja de guantes. Transferir la mezcla a un matraz redondo de 250 mililitros con junta 24/40 secado en estufa y provisto de una barra de agitación.Lave la mezcla de reacción residual con diclorometano y transfiérala al matraz. Tape el matraz con un septum. Saque el matraz de la caja de guantes y llévelo al sistema de vacío, y conéctelo.Abra la válvula de alto vacío para eliminar el disolvente residual. A continuación, retire rápidamente el septo y agregue hidruro de calcio utilizando una espátula. Conecte el matraz de fondo redondo al aparato de destilación descrito en el protocolo del texto y ajuste la temperatura del baño de aceite a 100 grados Celsius.Una vez finalizada la destilación, retire la fuente de calor y enfríe el aparato a temperatura ambiente. Re-pressurice el aparato enfriado con nitrógeno, y cierre firmemente la válvula de tapón en el frasco de almacenamiento libre de aire. Después de transferir el producto aislado del frasco a un vial en una caja de guantes, almacene el vial en el congelador de la caja de guantes.Después de purificar la proteína, transfiera la solución purificada a un tubo de membrana de diálisis. Coloque el tubo de diálisis en un recipiente que contenga una solución de cuatro litros de fosfato de sodio 100 milimolar, cloruro de sodio 550 milimolar y azida de sodio 0,2%. Agite durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, agregue 2-mercaptoetanol a la muestra dializada, de modo que la concentración final sea de cinco milimolares. Luego, utilice un concentrador centrífugo para concentrar la solución hasta 40 miligramos por mililitro. Gire la muestra a 5.000 RPM y seis grados centígrados, y elimine cualquier precipitado después de la concentración.A continuación, en una placa de 24 pocillos, prepare diversas condiciones con la solución de depósito, tal como se describe en el protocolo del texto. Utilice grasa para lograr un sellado hermético, aplicándola sobre el borde de cada pocillo. Mezcle cinco microlitros de la solución concentrada de proteína con cinco microlitros de la solución de depósito sobre un portaobjetos de vidrio siliconizado.Coloque la cubeta boca abajo sobre los pocillos que contienen la solución reservorio. Almacene la placa a 4 grados centígrados para el crecimiento de cristales. Utilizando un lazo de tubo criogénico, retire los cristales formados y colóquelos en un tubo microcentrífugo de 6 mililitros.Añada 50 microlitros de licor madre. Luego, transfiera el tubo a una caja de guantes. Transfiera cinco microlitros del ligando azaborina preparado al interior de la tapa roscada del tubo.Cierre el tubo y almacénelo en un refrigerador dentro de la caja de guantes durante dos a siete días para la equilibración por difusión de vapor. Después de este tiempo, coloque una gota de N Paratone sobre un portaobjetos de vidrio. Utilizando una micropipeta, transfiera un cristal al portaobjetos.A continuación, utilice un lazo de tubo criogénico para recoger el cristal y transferirlo desde la solución acuosa al N Paratone. Sumerja el cristal protegido con N Paratone en un depósito que contenga nitrógeno líquido. Con pinzas criogénicas, monte el cristal congelado por choque en el lazo.Luego, analice los datos cristalinos recopilados según se describe en el protocolo del texto. En este estudio, se presenta una síntesis modificada de 1,2-azaborinas basada en métodos previamente reportados. Se utiliza tri-alelo borina para preparar el aducto de cloruro de N-alelo NTBSB-alelo.Se emplea una secuencia de una sola etapa y dos pasos para la síntesis de NTBS BCl 1,2-azaborina, lo que proporciona un rendimiento aislado más alto que los métodos anteriores. La síntesis de N-H-B-etil-1,2-azaborina se lleva a cabo en dos pasos, utilizando etillitio en lugar del complejo de cromo empleado en métodos previamente descritos. La proteína se purifica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión.Un cromatograma realizado a 280 nanómetros muestra un pico consistente con el mutante de la lisozima T4, L99am102q. Luego, la proteína se cristaliza y se compleja con ligandos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la síntesis de azaborina requiere condiciones libres de aire, como una caja de guantes y un manifold de vacío y gases, para prevenir la descomposición de los compuestos.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para explorar las propiedades químicas y físicas únicas de las azaborinas en comparación con los aromáticos carbonosos en los bolsillos clásicos de recuperación biológica de áreas.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Partículas de adenovirus se han diseñado para contener la natural azidohomoalanine análogo del ácido amino o el azúcar...

Modificación de superficies quimioselectiva virales a través de Química Haga clic en Bioorthogonal

Un protocolo para la preparación de un solo recipiente diastereoselectiva de cis - N-TS-iodoaziridines se describe. La generación de diiodomethyllithium, además de la N-Ts aldiminas y ciclación de la gema diyoduro intermedio a iodoaziridines amino se demuestra. También se incluye un protocolo para evaluar rápidamente y cuantitativamente la fase estacionaria más apropiado para la purificación por cromatografía.

Síntesis y purificación de Iodoaziridines Involucrar cuantitativa Selección de la fase estacionaria óptima para cromatografía

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

Se generan iones aziridinium bicíclica como 1-azoniabicyclo [4.1.0] heptano tosilato de 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl] aziridine, que fue utilizada para la preparación de piperidinas substituidos y azepanes través de regio y estereoespecífica anillo de expansión con diferentes nucleófilos. Este protocolo muy eficiente nos permitió preparar diversas azaheterocycles como productos naturales como la fagomina, análogo de la febrifugine y balanol.

Preparación de iones Aziridinium bicíclica estable y su apertura para la síntesis de Azaheterocycles

3-Aroyl-N-hidroxi-5-nitroindoles fueron sintetizados por cicloadición de 4-nitronitrosobenceno con un alquinona terminal conjugado en un procedimiento térmico de un solo paso. La preparación del nitrosoareno y de los alquinones se notificó adecuadamente y, respectivamente, a través de procedimientos de oxidación en la anilina correspondiente y en el alquinol.

Una síntesis directa, regioselectiva y atómica de 3-Aroyl-N-hidroxi-5-nitroindoles por Cycloaddition de 4-Nitronitrosobenzene con Alkynones

En este estudio, preparamos ambos enantiómeros de aziridina-2-carboxilato, que se utilizan en la síntesis asimétrica de alcaloides, incluyendo biemamida B y D, y (-)-epiallo-isomuscarina.

Preparación de aziridinas no activadas enantiopure y síntesis de biemamida B, D y epiallo-isomuscarina

Este protocolo describe cómo realizar el marcado de proteínas específicas del tipo celular con azidonorleucina (ANL) utilizando una línea de ratón que expresa una sintetasa de ARNt de L274G-Metionina mutante (MetRS*) y los pasos necesarios para el aislamiento de proteínas específicas de tipo celular marcadas. Describimos dos posibles vías de administración de ANL en ratones vivos mediante (1) agua potable y (2) inyecciones intraperitoneales.

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

Las bisaziridinas contiguas que contenían aziridinas no activadas y activadas se sintetizaron mediante aziridinaciones organocatalíticas asimétricas y luego se sometieron a reacciones quimioselectivas de apertura de anillo en condiciones ácidas o básicas. El anillo de aziridina no activado se abre con nucleófilos menos reactivos en condiciones ácidas, mientras que el anillo de aziridina activada se abre con nucleófilos más reactivos en condiciones básicas.

Preparación de bisaziridinas contiguas para reacciones regioselectivas de apertura de anillo

Este protocolo describe un método para producir y evaluar la actividad antimicrobiana y la citotoxicidad del péptido catiónico Mel4 y el mímico del péptido RK758. Al integrar síntesis química, expresión recombinante y ensayos funcionales estandarizados, proporciona un flujo de trabajo optimizado para la producción y prueba de péptidos y mimetizadores de pequeñas moléculas.

Producción y pruebas de péptidos antimicrobianos y sus imitadores

Describimos procedimientos para la preparación y administración de microcristales de proteínas de membrana en fase cúbica lipídica para cristalografía en serie en láseres de electrones libres de rayos X y fuentes de sincrotrón. Estos protocolos también se pueden aplicar para la incorporación y administración de microcristales de proteínas solubles, lo que reduce sustancialmente el consumo de muestras en comparación con la inyección líquida.

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Aprende la síntesis de 1,2-azaborinas y la preparación de complejos proteicos con mutantes de lisozima T4. Este método confiable permite funcionalizar precursores para aplicaciones biomédicas avanzadas.

Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

Explorar más videos