Name: Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende a preparar cortes horizontales de retina de ratón adulto para estudios electrofisiológicos. Esta técnica preserva la integridad de neuronas horizontales y amacrinas, permitiendo grabaciones funcionales con patch-clamp.

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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 y FE464/11-1 a A.F. Los autores quieren agradecer la excelente asistencia técnica de Andrea Nerz.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para los experimentos con animales emitidos por la República Federal de Alemania. NOTA: Debido a que el tejido de la retina esté desprovisto de oxígeno durante prolongados partes de este procedimiento, todos los pasos que deben llevarse a cabo lo más rápido posible. Los ratones deben ser adaptados a la oscuridad, al menos 3 horas antes de la disección. Para evitar la adaptación a la luz de la retina, la preparación y el corte debe ser llevado a cabo bajo la luz roja tenue. 1. Preparación de los medios de comunicación y otros productos químicos <ol><li> Preparar Ames &#39;Medium 6. Después de la disección, sumergir tejido de la retina en el medio de Ames &#39;en todo momento. <ol><li> Disolver 2,2 g de Ames medio y 298 mg en HEPES 250 ml de agua destilada. La concentración de HEPES será de 5 mM. Agitar suavemente hasta que se disuelven todas las partículas. </li><li> Medio burbuja Ames &#39;a temperatura ambiente con carbógeno (95% de oxígeno, 5% cochedióxido de Bon) durante al menos 5 min. carbógeno de alimentación con una pipeta Pasteur de vidrio a la solución. Conectar la pipeta Pasteur través de un tubo apropiado a la salida del regulador de gas. </li><li> Añadir 475 mg de sodio-bicarbonato a la solución. La adición de bicarbonato después de burbujeo evita la precipitación de carbonato de calcio. </li></ol></li><li> Preparar agarosa de baja temperatura de gelificación. Se requiere de agarosa para incrustar de tejido de la retina durante el corte vibratome. <ol><li> Disolver 180 mg de agarosa en 9 ml de medio de Ames y 1 ml de agua destilada. Utilizar un microondas para calentar lentamente la solución de agarosa hasta que se disolvieron todos los sólidos. El calor dentro de 5 - 10 seg incrementos para evitar el desbordamiento. Solución debe ser clara y transparente. </li><li> Tienda disolvió agarosa en baño de agua a 37 ° C durante la duración del procedimiento. </li></ol></li></ol> 2. Configuración de la Vibratome NOTA: Todas seccionamiento se ha llevado a cabo con lavibratome enumerados en la Tabla de Materiales. Los ajustes indicados se refieren a este tipo de solamente vibratome. Para más detalles sobre vibratome seccionamiento de tejido neural por favor refiérase a la referencia 7. <ol><li> Coloque la cuchilla vibratome inyector en soporte de la cuchilla. </li><li> Medir la desviación vertical de la hoja con el dispositivo &quot;VibroCheck&quot;. Utilice el tornillo de ajuste en el soporte de la cuchilla para inclinar la pala hasta que quede paralela al plano de corte. La posición exacta de la hoja es necesaria para evitar efectos de persianas venecianas en la superficie de sección y para producir una sección plana que contiene células vivas en su superficie. </li><li> Establecer vibratome a los siguientes parámetros: amplitud, 1,00; velocidad, 0,20; espesor, 180-200 micras. </li></ol> 3. La disección de la retina del ratón <ol><li> Anestesiar a adultos C57BL / 6 ratones por vaporización de aproximadamente 1 ml de isoflurano en un recipiente hermético. Cuando la anestesia es completa, la eutanasia a los animales por dislocación cervical. losratón no debe ser mayor de 3 meses, de lo contrario la calidad de las rodajas se deteriorará. </li><li> Retire la bola del ojo mediante la colocación de una pinza curva debajo del ojo. levantando suavemente la bola del ojo expondrá el nervio óptico. Cortar el nervio óptico con una tijera primavera y transferir la bola del ojo a una placa de Petri de 35 mm que contiene 2 ml de Ames Medium. </li><li> Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes en el escenario de un microscopio estereoscópico. Ajuste el aumento a un valor que permite un control visual óptimo de los siguientes procedimientos (pasos 3.4 a 3.9). </li><li> Perforar la córnea en la transición a la esclerótica con unas pinzas de punta o una aguja 20 G. Durante este paso, estabilizar el globo ocular con otros fórceps. Tenga cuidado de no dañar la retina con el dispositivo de punción. </li><li> Inserte las tijeras de primavera en el pequeño orificio realizado en el paso 3.3 y cortar un círculo alrededor de la córnea. Una vez más, estabilizar la bola del ojo con pinzas durante el corte. Mantenga la incisión muy cerca de la superficie a fin de no cut en la retina. </li><li> Retire cuidadosamente la córnea, el cristalino y el cuerpo vítreo con una pinza. El cuerpo vítreo comprende sólo una fina capa transparente en la parte posterior del ojo. Sin embargo, es esencial para vibratome seccionamiento que el cuerpo vítreo es completamente eliminado. </li><li> En la placa de Petri, la posición de la copa ocular de una manera que se mira a través del agujero hacia abajo sobre la retina. El borde de la abertura debe consistir solamente tejido de la esclerótica. Si el corte circular (paso 3.4) se ha llevado a cabo demasiado cerca del ecuador de la copa ocular, tejido de la retina también estará presente cerca de la incisión. Tenga cuidado de no dañar a continuación, la retina en el paso 3.8. </li><li> Coge la esclerótica con unas pinzas y romper cuidadosamente el tejido de separación. Es esencial no se rompa la retina durante este paso. Si es necesario, separar la retina de la ora serrata estabilizando la parte escleral del tejido con las pinzas y con cuidado despegando de la retina con las otras pinzas. Mantener las pinzas cerradas; Nunca manejar la retina con pinzas ya que el tejido es muy suave y dará paso inmediatamente. NOTA: En este paso, la retina y el resto de la copa ocular se conecta sólo a la cabeza del nervio óptico. </li><li> Cortar el sitio de unión en la cabeza del nervio óptico con las tijeras de primavera. La retina ahora debe estar flotando libremente como una sola pieza de tejido en el medio de Ames. </li><li> Cortar la retina en 4 - 6 pequeños rectángulos de aproximadamente 23 mm utilizando una hoja de bisturí curvo mediante la celebración de la retina a lo largo de los bordes con el fórceps, para manipularlo en su posición. Evitar pellizcar el tejido de la retina dentro de los rectángulos. Tome las piezas de la parte central de la retina, no muy lejos de la periferia. </li><li> Transferencia de piezas de la retina con un diámetro grande pipeta de plástico Pasteur a una placa petri de plástico 35 mm, el fondo de la cual ha sido sustituida por una malla con tamaño de malla de menos de 1 mm. Fijar la placa de Petri en el tercio superior de un matraz de vaso de precipitados o cónica y sumergir piezas de la retina en bu Medium Ames &#39;bbled con Carbógeno. </li></ol> 4. Incorporación de la Retina Piezas de agarosa <ol><li> transferir cuidadosamente 2 - 3 piezas de la retina en una placa Petri de plástico de 35 mm junto con algunos de los Ames &#39;Medium. Es más conveniente usar un plástico de gran diámetro pipeta Pasteur para la transferencia. En este paso, la orientación exacta de las piezas de la retina no importa. </li><li> Eliminar la mayor cantidad posible de Medio el restante Ames &#39;con una pipeta Pasteur de vidrio. Tan pronto como el fluido ha sido retirado continúe con el paso 4.3. No deje que la retina seco del tejido. </li><li> Inmediatamente cubrir piezas de la retina con 2 ml de agarosa disuelto (37 ° C). Dado el tamaño mencionado en el paso 3.10, las piezas no se cerrarán hasta dentro de la agarosa. </li><li> Dentro de la agarosa líquido, empujar suavemente piezas de la retina a la parte inferior de la placa de Petri. La capa de células ganglionares debe estar boca abajo. Use un microscopio estereoscópico para la determinación de la posición exacta. Para el posicionamiento, manejar pi retinaeces con una pequeña espátula. Coloque la retina tan rápido y preciso como sea posible ya que la agarosa se solidifica rápidamente. <ol><li> Organizar piezas retinianas paralelos al fondo de la placa de vidrio; de lo contrario secciones serán tangencial u oblicua. Las piezas individuales no deben tocarse entre sí, sino que además no deben estar demasiado separados. Trate de colocar las piezas de la retina más o menos en el mismo nivel horizontal. </li></ol></li><li> Ponga el vidrio placa de Petri con piezas de retina incrustados en el refrigerador (4 - 6 ° C) durante al menos 2 minutos. Esto se endurecerá rápidamente la agarosa para su posterior procesamiento. Tan pronto como la agarosa ha polimerizado proceder con el paso siguiente. </li></ol> 5. Montaje de la Retina Piezas <ol><li> Retirar con cuidado el bloque de agarosa que contiene piezas de la retina de la placa de Petri. Utilice una espátula o un dispositivo similar para levantar el bloque de agarosa del vidrio. Debido a las fuerzas de adhesión, esto puede llegar a ser bastante difícil. Sin embargo, no romper labloque de agarosa. Llevar a cabo esta y todas las etapas posteriores a la temperatura ambiente. </li><li> Coloque el bloque de agarosa sobre un cubreobjetos de vidrio y ajustar su tamaño con una hoja de bisturí. Deja de 1 - 2 mm de agarosa en cada lado de las piezas de la retina. El tamaño final del bloque debe ser alrededor de 1,066 mm (10 mm se refiere a la altura del bloque, 6 mm a la longitud de la arista). </li><li> Pegue el bloque de agarosa para el soporte de la muestra de la vibratome utilizando un adhesivo instantáneo. piezas de retina se debe colocar en la parte superior de la alta bloque de 10 mm y paralelos orientados a su superficie, mientras que la parte inferior está fijada en el soporte. </li><li> Cubrir el bloque inmediatamente vertiendo el Medio Ames previamente burbujeado &#39;en la bandeja de amortiguamiento de la vibratome. </li></ol> 6. Preparación de Secciones Vibratome Horizontal <ol><li> Empezar a cortar. En primer lugar, establecer el grosor de cortar manualmente hasta fragmentos de tejido de la retina aparecen en el corte. A continuación, cambie a la configuración en el paso 2.3. Dado que laretina del ratón es de sólo 200 m de espesor, habrá no más de 2-3 rebanadas por bloque de agarosa. </li><li> Retire las secciones de la bandeja de tampón con una varilla de vidrio y transferirlos a 2 ml de medio de Ames &#39;en una placa de Petri de 35 mm. </li><li> Secciones de las tiendas inmediatamente en una incubadora a 37 ° C (5% CO2 / 55% O2). La agarosa que rodea las secciones permanecerá sólido en la incubadora y puede ser usado para manipular las secciones sin dañar la retina. se obtiene una mejor calidad de la rebanada al almacenar a 37 ° C dentro de la atmósfera respectivo en comparación con Medio oxigenada Ames &#39;a TA. Las secciones se pueden utilizar inmediatamente o se pueden almacenar hasta 4 horas en la incubadora con buenos resultados fisiológicos. </li><li> Incrustar siguientes piezas de la retina en agarosa y repetir las Secciones 4 - 6. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En contraste con las rebanadas verticales, la morfología dendrítica de las neuronas orientados radialmente, como las células horizontales y amacrinas está bien conservado. En comparación con las preparaciones de retina enteros, estos tipos de células son fácilmente accesibles para los microelectrodos y pueden ser estudiados por ambas técnicas electrofisiológicas y de imagen. Aquí, nos centramos en la retina externa; Sin embargo, un enfoque similar se ha informado sobre todo para las células amacrinas de la retina intern...

La información visual se codifica como un patrón espacio-temporal dinámica de la activación de los fotorreceptores, y la sinapsis cinta entre los fotorreceptores y neuronas de segundo orden determina la transferencia de aguas abajo de la información visual. La preparación rebanada vertical de la retina de mamífero es una herramienta muy valiosa para estudiar el procesamiento de señales en las vías verticales, es decir, entre los fotorreceptores y células bipolares, y entre las células bipolares y algunos tipos de células amacrinas 1, 2, 3, 4. Sin embargo, seccionamiento verticales siempre provoca el truncamiento grave de los campos dendríticas de muchas neuronas de la retina, lo que lleva a una pérdida considerable de los contactos sinápticos. Especialmente en la retina externa, las células horizontales se ven afectados debido a sus campos dendríticas extendidos lateralmente extendidas y sus sistemas de terminales del axón 5. En una línea verticalrodaja de preparación, la entrada sináptica de cientos de terminales de cono fotorreceptores a las dendritas de una célula horizontal se reduce a unos pocos contactos dispersos. Esto podría ser suficiente para estudiar las propiedades de las sinapsis individuales, pero lo hace de ninguna manera representan las capacidades de procesamiento de señal que subyacen a la activación sincronizada de las sinapsis cinta fotorreceptor. Por lo tanto, hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal, lo que deja casi todo el fotorreceptor cono de entrada sináptica a las dendritas de células horizontales intacto y funcional. El plano de carreras de seccionado paralelo a la superficie de la retina, idealmente corte a través de la capa nuclear interna entre las células horizontales y células amacrinas. Por lo tanto, las rebanadas horizontales de la retina externa son creados que contienen, en el sitio presináptico, fotorreceptores con segmentos interior y exterior, así como terminales sinápticas, y células horizontales y células bipolares en el sitio postsináptica. Esta preparación es muy adecuado to investigar las entradas sinápticas coordinadas en las dendritas de células horizontales por todos los conos dentro de su campo dendríticas. Por lo tanto, podría resultar útil para comprender mejor el funcionamiento de la sinapsis cinta fotorreceptor, que es crucial para la transferencia de la información visual de la matriz de la activación de los fotorreceptores en una respuesta postsináptica.

<table><tbody><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Placa de Petri (plástico)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Petri de vidrio plato</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Dispensario de isoflurano</td><td>hospital universitario</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla inyectora de vibratomo</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Microondas Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de agua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas de 20 G Tijeras</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td>resorte</tr><tr><td>Hojas de</td><td></td><td></td><td></td>bisturí curvadas</tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de plástico Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Pasteur de vidrio</td></tr></tbody></table>

preparación de cortes horizontales de ratón adulto retina de estudios electrofisiológicos

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

el tramo preparativos verticales están bien establecidos para estudiar los circuitos y la transmisión de la señal en la retina de mamíferos adultos. El plano de seccionamiento en estas preparaciones es perpendicular a la superficie de la retina, lo que es ideal para el estudio de las neuronas orientados radialmente como fotorreceptores y células bipolares. Sin embargo, las grandes cenadores dendríticas de las células horizontales, células amacrinas de campo amplio, y las células ganglionares son en su mayoría truncado, dejando marcadamente reducida la actividad sináptica en estas células. Mientras que las células ganglionares y células amacrinas desplazadas se pueden estudiar en una preparación de todo ello montado de la retina, células horizontales y células amacrinas ubicadas en la capa nuclear interna sólo son de difícil acceso para los electrodos en el tejido retina conjunto. Para lograr la máxima accesibilidad y la integridad sináptica, hemos desarrollado una rodaja de preparación horizontal de la retina del ratón, y estudiamos la transmisión de señales en la sinapsis entre los fotorreceptores y horizontalCélulas. seccionamiento horizontal permite (1) la identificación visual fácil e inequívoca de los cuerpos celulares horizontales para la orientación del electrodo, y (2) la preservación de los campos dendríticas de células horizontales extendidos, como requisito previo para el cono de entrada sináptica intacta y funcional a las dendritas de células horizontales. Las células horizontales de los cortes horizontales exhibieron actividad sináptica tónica en la oscuridad, y ellos respondieron a breves destellos de luz con una reducción de la actividad sináptica actual y la disminución hacia el interior. pruebas de inmuno indica que casi todos los conos dentro del campo de una célula dendrítica horizontal establecen sinapsis con las dendritas sus periféricos. La preparación rebanada horizontal es por lo tanto muy adecuado para estudiar las propiedades fisiológicas de las neuronas de la retina horizontalmente extendidos, así como la transmisión de la señal sensorial y la integración a través de las sinapsis seleccionados.

<html> En rebanadas horizontales de la retina del ratón, los cuerpos celulares horizontales podrían ser identificados fácilmente de acuerdo con su morfología única con varias dendritas primarias que salen de un cuerpo de células poligonales (Figura 1A). cuerpos celulares horizontales situados cerca de la superficie de la rebanada fueron rutinariamente accesible para los electrodos de patch-clamp. Durante las grabaciones, las células se llenaron con un colorante fluorescen...

Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

El objetivo general de esta preparación de corte horizontal de la retina de ratón es preservar la integridad morfológica y fisiológica de las neuronas orientadas horizontalmente para estudiar su función en los circuitos sinápticos de la retina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del procesamiento de la información visual, como la forma en que las señales sensoriales se codifican e integran en las sinapsis en cinta de la retina repetitiva. La principal ventaja de esta técnica es que las interneuronas orientadas horizontalmente, como las células horizontales y las células amacrinas, se mantienen funcionalmente intactas y accesibles para grabaciones electrónicas.La procedimiento será demostrado por Andrea Nerz, una técnica en mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, retire el globo ocular colocando un par de pinzas curvas debajo del ojo. Levante suavemente el globo ocular para exponer el nervio óptico y córtelo con una tijera de resorte.Luego, transfiera el ojo a una placa de Petri de 35 milímetros que contenga dos mililitros de medio AMS. Bajo el microscopio estereoscópico, ajuste la ampliación a un valor que permita un control visual óptimo. A continuación, sostenga firmemente el ojo con un par de pinzas y perfore la córnea en la transición hacia la esclerótica con otra pinza de punta o con una aguja de calibre 20.Tenga cuidado de no dañar la retina al perforar la córnea. Posteriormente, inserte las tijeras de resorte en el pequeño orificio. Sujete el globo ocular con pinzas mientras corta un círculo alrededor de la córnea y mantenga el corte muy cerca de la superficie para no seccionar la retina.Retire cuidadosamente la lente corneal y el cuerpo vítreo. El cuerpo vítreo comprende solo una capa delgada y transparente en la parte posterior del ojo. Sin embargo, es esencial que el cuerpo vítreo sea completamente eliminado para el corte con vibrátomo.En la placa de Petri, coloque la copa ocular de manera que se muestre un orificio claro hasta la retina. El borde de la abertura debe consistir únicamente de tejido escleral. A continuación, sujete la esclerótica con pinzas y desgarre cuidadosamente el tejido.Es fundamental no romper la retina durante este paso. En este momento, la retina y el resto de la copa óptica deben estar conectados únicamente en el disco óptico. Corte el punto de unión en el disco óptico con tijeras de resorte.La retina debería estar ahora flotando libremente como una única pieza de tejido en medio AMS. A continuación, transfiera la retina a un cubreobjetos con una pipeta Pasteur de diámetro grande y corte la retina en cuatro a seis rectángulos pequeños de aproximadamente dos por tres milímetros cuadrados utilizando una hoja de bisturí curva. Evite aplastar el tejido retiniano dentro de los rectángulos.En este procedimiento, transfiera cuidadosamente dos o tres fragmentos de retina a una placa de Petri de vidrio junto con algo del medio AMS, utilizando una pipeta Pasteur de plástico de gran diámetro. Retire la mayor cantidad posible del medio AMS restante con una pipeta Pasteur de vidrio. Luego, cubra inmediatamente los fragmentos de retina con dos mililitros de agarosa disuelta a 37 grados Celsius.Empuje suavemente los fragmentos de retina hacia el fondo de la placa de Petri. Coloque la capa de células ganglionares mirando hacia abajo lo más rápido y preciso posible, ya que el agarosa se solidifica rápidamente. Al mismo tiempo, disponga los fragmentos de retina paralelos al fondo del recipiente de vidrio para evitar que los cortes resulten tangenciales u oblicuos.A continuación, transfiera los fragmentos de retina incrustados al refrigerador para endurecer el agarosa antes del procesamiento posterior. Ahora, desprenda cuidadosamente el bloque de agarosa que contiene los fragmentos de retina de la placa de Petri. Utilice una hoja de bisturí para levantar con cuidado el bloque de agarosa del vidrio.A continuación, coloque el bloque de agarosa sobre un cubreobjetos de vidrio. Ajuste su tamaño con una hoja de bisturí y deje uno o dos milímetros de agarosa en cada lado de los fragmentos retinianos. Luego, pegue el bloque de agarosa al portaobjetos del vibrátomo utilizando un adhesivo instantáneo.Cubra inmediatamente el bloque vertiendo el medio AMS previamente burbujeado en la bandeja tampón del vibrátomo. En esta figura, se visualizó una célula horizontal ubicada cerca de la superficie del corte con óptica de contraste de puntos. Esta imagen muestra una célula horizontal cargada con Oregon Green 488 BAPTA-1 mediante un electrodo de parche que aún estaba unido a la célula.Se muestra aquí la superposición de una célula horizontal con tinte inyectado y una disposición de pedículos cónicos marcados con manosa fluorada acoplada a aglutinina de maní, lo que revela los contactos sinápticos putativos. En esta figura, el registro en bloqueo de voltaje de toda la célula a un potencial de retención de menos 60 milivoltios muestra una actividad sináptica tónica de alta frecuencia. Con una resolución temporal más alta, los eventos sinápticos presentan formas de onda monofásicas o trayectorias de corriente más complejas.En esta figura se muestra la respuesta de corriente de una célula horizontal a un estímulo luminoso. La luz induce el cierre de canales iónicos y el bloqueo de la actividad sináptica. Y en esta figura, los fotorreceptores de cono fueron estimulados eléctricamente con un electrodo extracelular.Los corrientes excitatorios postsinápticos varían según la intensidad de la estimulación. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en menos de una hora si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la imagen de calcio para responder preguntas adicionales, como el procesamiento de la información visual en redes retinianas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cortar secciones horizontales de la retina de mamíferos con entradas sinápticas funcionales hacia tipos celulares extendidos horizontalmente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina.

Preparación de corte horizontal de la retina

Aquí se describe un procedimiento para la generación adaptada a la oscuridad rebanadas de la retina del ratón de los registros electrofisiológicos.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Este video muestra una técnica de patch-clamp de celda completa para el registro electrofisiológico de la retina de un ratón de montaje plano. Se utiliza una pipeta de vidrio delgada con un electrodo para acercarse a las células amacrinas (SAC) dentro de la retina. Después de formar un sello, se aplica succión para romper la membrana y formar la configuración de abrazadera de parche de celda completa. Finalmente, se mide el flujo de iones a través de los receptores sinápticos SAC utilizando la...

Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de una retina de ratón de montaje plano

El video describe el registro electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón. Los cortes que contienen el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) se colocan en una cámara de registro. Se coloca una pipeta estimulante en el tracto óptico para estimular las células ganglionares de la retina (RGC) e investigar las sinapsis retinogeniculadas o en el núcleo reticularis thalami para estimular las neuronas corticales e investigar las sinapsis...

Un estudio electrofisiológico de las sinapsis retinogeniculadas y corticogeniculadas en cortes de cerebro de ratón

Fuente: Laboissonniere, et. al. Secuenciación de ARN unicelular de subconjuntos definidos de células ganglionares de la retina. J. Vis. Exp. (2017).  Este video muestra una técnica de trazado fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares de la retina (RGC) en la retina de un ratón transgénico. El proceso consiste en asegurar la retina aislada en una cámara de registro, mantener la viabilidad celular con perfusión oxigenada y dirigirse a las RGC marcadas con fluorescencia...

Identificación de subtipos de células ganglionares de la retina de ratón mediante trazado fluorescente

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Se describe un protocolo para supervisar Ca 2+ dinámica en los terminales de los axones de los conos utilizando una preparación rebanada ex-vivo de la retina del ratón. Este protocolo permite estudios completos sobre los conos de señalización de Ca2 + en un importante sistema modelo de mamífero, el ratón.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Una vez retirado del cuerpo, el tejido neuronal se ve afectada en gran medida por las condiciones ambientales, lo que lleva a una eventual degradación de los tejidos después de 6-8 h. Utilizando un método de incubación única, que sigue de cerca y regula el ambiente extracelular de los tejidos, la viabilidad del tejido se puede ampliar de manera significativa para&gt; 24 h.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Aprende a preparar cortes horizontales de retina de ratón adulto para estudios electrofisiológicos. Esta técnica preserva la integridad de neuronas horizontales y amacrinas, permitiendo grabaciones funcionales con patch-clamp.

Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos

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