Name: ניתוח Synaptic אפנון של תסיסנית קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: חקור אפנון סינפטי בקולטני אור של Drosophila melanogaster לאחר חשיפה לאור ממושך. שיטה זו מאפשרת ניתוח חצי-אוטומטי של מספר ותפוצת אזורים סינפטיים פעילים במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ט סטרנר עבור תיקונים מועילים, דיוני הערות על כתב היד; SL Zipursky למתן מניות לטוס; M Schölling לביצוע עיבוד תמונה. חלק ניתוח התמונה בוצע במעבדה של א Kakita. עבודה זו נתמכה על ידי אלכסנדר פון הומבולדט קרן JSPs מלגות למחקר בחו&quot;ל (AS), עמיתי JSPs (SH-S.), גרנט-in-Aid עבור Start-up (24,800,024), על תחומים חדשניים (25,110,713), Mochida, טאקדה, Inamori, Daiichi Sankyo-, יסודות אליפות טוראי (TS), מימון הליבה DZNE (GT) ו DZNE מתקן מיקרוסקופית אור (CM).

הפרוצדורות המתוארות בפרוטוקול זה כרוך עובדים אך ורק עם תסיסנית ואינם כפופות לחוקים רווחים בעלי חיים בגרמניה וביפן. 1. תנאי חשיפה לאור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן זבובים שנושאים-flippase sensless (sens-FLP) ו bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 המאפשר הדמיה BRP-GFP בנוירונים R8 קולטי האור (R8s). BRP קידוד מוקד גנומית בתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) שונה כדי ליצור מבנה זה BRP-FSF-GFP. בשנת הזבובים הנושאים BAC השונה זה הביטוי של BRP-GFP נמצא תחת השליטה של הרצפים רגולטוריים אנדוגני, אבל מוגבל קולטני אור R8 לאחר הסרה בתיווך sensless-flippase של קלטת FRT-STOP-FRT 15. שים לב sens-FLP לעתים רחוקות מבטא flippase ב R7s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על זבובי li h 12ght / 12 שעות חושך מחזור (LD) במהירות של 25 ° C משלב הזחל עד eclosion (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הזבובים 6 - 0 שעות לאחר eclosion ולהכניס אותם לתוך בקבוקון חדש המכיל אוכל לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צלוחיות לתוך מתלה שקוף עשוי שרף אקרילי עם שלושה שלבים (לגובה של 41 ס&quot;מ, בסיס של 21 ס&quot;מ, עובי של 4 ס&quot;מ וגובה של 13 ס&quot;מ לכל שלב) (איור 1 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המרחק בין המתלה ולוח LED לספק את התאורה בעצמה ממוצעת של 1,000 לוקס באמצעות מד אור דיגיטלי (התרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על זבובים 1 - 3 ד תחת אחד מהתנאים הבאים: בחשכה מתמדת (DD), 12 אור H / 12 שעות חושך מחזור (LD), או אור קבוע (LL) של 25 מעלות צלזיוס חממה קטנה (איורים 1 א ו 1C). </li></ol> 2. Dissection, אימונוהיסטוכימיה והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח מוחות זבוב עם מלקחיים, לתקן אותם עם 4% FOrmaldehyde ו immunostain עם הנוגדן הראשוני נגד Chaoptin (1:50) ו נוגדן שני להדמיה של קולטני האור המבוסס על פרוצדורות קודמות 25. בקצרה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1% Triton X-100 ב PBS (0.1% PBT). פתרון זה משמש כדי לשפר חדירה לרקמות נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זבובים על כרית CO 2, למיין את הגנוטיפ הנכון ולהעבירם צלחת פטרי המלאה 0.1% PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד המלקחיים מתחת החוטם ולמשוך את העיניים ימינה ושמאלה בהתאמה עם המלקחיים האחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוטם ואת קנה הנשימה המחובר למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המוח עם מלקחיים לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל 150 μL של PBT 0.1% ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 10 דקות חוזרים מ 2.1.3 - 2.1.5 להשיג מוחות רבים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פורמלדהיד 16% לתוך הצינור ומערבבים ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת המוח מקבע ב חדרהטמפרטורה במשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של 0.1% PBT עם micropipette, שם לב לעזוב את המוח בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBT 0.1% ולהוסיף פתרון הנוגדן הראשוני, מוכן כדלקמן: להוסיף 196 μL של 0.3% PBT (0.3% Triton X-100 ב PBS) 4 μL של נוגדנים נגד Chaoptin (דילול סופי 1 : 50) להדמיה של קולטני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת המוח בפתרון הנוגדן הראשוני ב 4 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם 200 μL של PBT 0.1% עם micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להסיר את PBT 0.1% ולהוסיף 200 μL של PBT 0.3% המכיל נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זה בחושך ב 4 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBT 0.1% עם micropipette. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרכבה, לשים שתי טיפות קטנות (2 μL כל אחת) של הרכבה בינונית עם micropipette במרכז של המיקרוסקופ שקופית בכ 2 ס&quot;מ distaNCE אחד מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שתי coverslips, אחד על כל טיפה ולהשאיר רווח צר בין coverslips של כ 0.2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 15 μL של מדיום גובר על גבי coverslip ומוסיף את המוח עם micropipette לתוך המדיום הגובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, מקם את המוח עם הצד הגחוני למעלה אל במרווח הצר שבין שני coverslips (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip על גבי וסוגרים את הקצוות של coverslip באמצעות לק ברור לתקן את הדגימה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תמונות של המוח באמצעות מיקרוסקופ confocal. השתמש עדשה אובייקטיבית טבילת 63X שמן (1.4 NA) ו זום דיגיטלי 2.6X. צור יותר מ -20 חלקים אופטיים של לשד גנגליון השני האופטי עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטר. </li></ol> דור 3. של הכתמים, אובייקטי Surface, Start-נקודות-נקודות קצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את המספר, distribution ורמת delocalization של puncta BRP-GFP, לפתוח את המחסנית מתקבלת על ידי מיקרוסקופיה confocal בתוכנות ניתוח תמונה ולגבש מחדש תמונות 3D (איור 3 א). ראוי לציין, כי הצעד במחקר זה בוצע עם Imaris. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את puncta BRP-GFP על ידי מודול זיהוי נקודה עבור כל מסוף האקסון R8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף כתמים חדשים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מגזר רק אזור של אינטרס&quot; בהגדרות האלגוריתם. בחר מסוף האקסון R8 ב לשד באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ מקור האות BRP-GFP. הערה: אקסונים קולטי האור R7 ו R8 היו immunolabeled עם (איור 3 א) נגד Chaoptin. רק R8, אם כי, מכיל puncta BRP-GFP ויכול ובכך להבחין בקלות (איור 3 א). יתר על כן, נקודת הסיום של R8 יכול להיות מזוהה על ידי הדילול של אקסונים אנטי החיוביים-Chaoptin בנקודת הכניסה לתוך השכבה לשד M3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את t בקוטר XY מוערךo 0.35 מיקרומטר ולטמן &quot;חיסור רקע&quot; באיתור המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;איכות&quot; בסוג לסנן ולסנן באופן אוטומטי. מכן לחץ על סיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מ 3.2.1 T- 3.2.5 עבור אקסונים R אחרים (איור 3 ב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את רמת delocalization של BRP-GFP אקסונים R8, ליצור אובייקטים משטח עם הפונקציה &quot;Surface&quot; לכל האקסון (איור 3 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף משטחים חדשים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מגזר רק אזור של אינטרס&quot; בהגדרות האלגוריתם. ואז לבחור מסופי האקסון R8 ב לשד באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ המקור של קולטני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את &quot;חלקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;אינטנסיביות מוחלטת&quot; הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק &quot;הפעל&quot;. &quot;זרע נקודות קוטר&quot; הוא 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג &quot;איכות&quot; מסנן בחר &quot;מספר ווקסלים&quot;, ולאחר מכן לסנן אוטומציהקאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להקליק על &quot;ערוך&quot; ולמחוק את החלקים של משטחים שנוצרו על אקסונים אחרים שאינם מעניינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מ 3.3.1 - 3.3.8 עבור אקסונים R אחרים (איור 3 ג). הערה כמה חפצי משטח נקטעו בגלל הרזון ואת האות החלשה קולטני אור ב שכבת M2, אבל הם עדיין נחשבו כאובייקט יחיד מהתחילה ועד לנקודות קצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את חלוקת puncta BRP-GFP לאורך כל נוירון neuropil המוארך, להגדיר את נקודת ההתחלה ואת נקודת הסיום עם נקודת פונקציה מדידה (איור 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;. לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ובחר &quot;Surface של אובייקט&quot; כדי לחתוך עם החלק העליון של אובייקטי השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נקודות מדידה על גבי חפצי שטח של אקסונים R בשכבת M1 כדי. אלה מוגדרים כיום-נקודות התחלה (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;.לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ובחר &quot;Surface של אובייקט&quot; כדי לחתוך עם התחתונים של אובייקטי השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים נקודות מדידה על התחתונים של אובייקטי השטח של אקסונים R בשכבת M3 כדי. אלה מוגדרים כיום נקודות קצה (איור 3D). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית את אות הרקע מערוץ GFP, ליצור אובייקטים השטח, כתמים, סטארט-נקודות נקודות קצה עבור שני אקסונים R בשכבה M6 (איור 3E). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף משטחים חדשים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מגזר רק אזור של אינטרס&quot; בהגדרות האלגוריתם. לאחר מכן בחר מסוף האקסון R7 בין שכבת M5 ו M6 ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו בערוץ מקור קולטי האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את &quot;חלקה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;אינטנסיביות מוחלטת&quot; הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סוג מסנן &quot;איכות&quot; ו &quot;מספר ווקסלים&quot;, ואז לסנן באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;הוסף כתמים חדשים&quot;;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;דלג על יצירה אוטומטית, לערוך באופן ידני&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מרכז של אובייקט&quot; ולהוסיף נקודה באזור הפנימי של האובייקט משטח המופק 3.5.1 - 3.5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מ 3.5.1 - 3.5.9 לעוד מסוף האקסון R7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;. לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ולשים נקודות מדידה על גבי שני אובייקטי השטח של קצה האקסון מסוף R7 בשכבת M6. אלה הם עכשיו מוגדר-נקודות התחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הוסף נקודות מדידה חדשות&quot;. לאחר מכן בחר &quot;ערוך&quot; ולשים נקודות מדידה על החלק התחתון של שני אובייקטי השטח של קצה האקסון מסוף R7 בשכבת M6. אלה מוגדרים כיום נקודות קצה (איור 3E). </li></ol></li></ol> 4. חישוב מספר הכתמים, הפצה של תדר ספוט ודרג העשרת BRP-GFP עם תמונה אישית תוכנת ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את הקובץ&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; ואת התיקייה &quot;פונקציות&quot; לתוך תיקיית matlab XT Imaris. ראוי לציין, כי החישוב במחקר זה בוצע באמצעות תוסף אישית מיושם ב- Matlab. הורד את התוסף מהאתר ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח במערך עם n נקודות, n משטחים ו -2 חפצי נקודת מדידה, כל נקודות מדידת n המכילות (שהוכנו 3.1 - 3.4). מטרת נקודת המדידה הראשונה מגדירה את מיקומי ההתחלה עבור כל האקסונים. מטרת נקודת המדידה השנייה מגדירה את מיקום הסיום של כל האקסונים. שני אובייקטים נקודת המדידה צריכים יש את אותו מספר של נקודות המדידה (כלומר מספר אקסונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Execute עיבוד תמונה &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis זיהוי סינפסה Vs 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק metadata ולשנות בגדלי פיקסל תוכנת ניתוח תמונה במקרה זה אינו נכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ עבור Performance של הניתוח העוצם אזורים כתמים ואזורי cytoplasmic (הערוץ עם BRP-GFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שם הקובץ לייצוא התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר פחי ואורך האקסון באחוזים. הזן את מספר הפחים כמו &quot;10&quot; ומגוון פחים כמו &quot;100%&quot; (איורי 4 א ו -4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזורים של הכתמים באזורים ציטופלסמית האחרים לניתוח delocalization BRP-GFP. זן כתמי רדיוס כמו &quot;0.35 מיקרומטר&quot; ורוחב של השטח המקיף אותה כמו &quot;50 מיקרומטר&quot;. רדיוס כתמים מגדיר באזור לאות GFP puncta (0.35 מיקרומטר קוטר, התרכזו פונקטום אחד). רוחב השטח המקיף אותה מגדיר באזור לאות GFP באזור cytoplasmic (50 מיקרומטר קוטר, מרוכז על פונקטום, אבל כולל רק R8 ולמעט בכל תחומי נקודה בציטופלסמה) (תרשימים 4 א ו 4C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שכל מסכות נוירון מעובדותוייצא כקובצי PDF (איורים 4 ב ו 4C) ושולחן CSV לניתוח נוסף בגיליון אלקטרוני. טבלת CSV הכוללת את מספר הנקודות, את עוצמת האות הממוצעת של &quot;שטח cytoplasmic&quot; ואת עוצמת האות המרבית &quot;נקודה&quot; בכל bin עבור כל האקסונים R8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח במערך ערוך 3.5 לגריעת אות הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עיבוד תמונה כמו נפרשים מימי 4.3 - 4.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הממוצע של מספר הכולל והחלוקה של puncta BRP-GFP בתוך (4D דמויות 4E) גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הממוצע של delocalization של האות BRP-GFP בגיליון אלקטרוני על ידי היחס בין עוצמת הממוצע של &quot;שטח cytoplasmic&quot; מחולק העוצמה המקסימלית של &quot;נקודה&quot; מופחתים מעוצמת הממוצע אות הרקע (איור 4F) . </li></ol>

<ol><li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Pools+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Pools and Dynamics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).</li>
<li>Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BSynaptic+vesicles+and+pouches+at+the+level+of+%26%2334%3Bactive+zones%26%2334%3B+of+the+neuromuscular+junction%5D%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">[Synaptic vesicles and pouches at the level of &#34;active zones&#34; of the neuromuscular junction].</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).</li>
<li>Schoch, S., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of the presynaptic active zone.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22794257">The Presynaptic Active Zone.</a> Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).</li>
<li>Owald, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627301001854">Assembling the presynaptic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remodeling+of+the+presynaptic+cytomatrix+upon+homeostatic+adaptation+to+network+activity+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing.</a> J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).</li>
<li>Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+alterations+of+the+active+zone+lead+to+sustained+changes+in+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).</li>
<li>Spangler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liprin-alpha2+promotes+the+presynaptic+recruitment+and+turnover+of+RIM1%2FCASK+to+facilitate+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission.</a> J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).</li>
<li>Sugie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Remodeling+of+the+Presynaptic+Active+Zone+of+Drosophila+Photoreceptors+via+Activity-Dependent+Feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback.</a> Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).</li>
<li>Sigrist, S. J., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+plasticity+of+the+cytoplasmic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+zone+assembly+and+synaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Active zone assembly and synaptic release.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly%2C+Ca2%2B+channel+clustering%2C+and+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li>
<li>Hallermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+dense+bodies+provoke+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Naked dense bodies provoke depression.</a> J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).</li>
<li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot%2C+a+protein+with+homology+to+ELKS%2FCAST%2C+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+labeling+of+synapses+in+vivo+through+synaptic+tagging+with+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination.</a> Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+neuronal+morphology%2C+synapse+number+and+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Danielson, E., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynPAnal%3A+software+for+rapid+quantification+of+the+density+and+intensity+of+protein+puncta+from+fluorescence+microscopy+images+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons.</a> PLoS One. 9 (12), e115298(2014).</li>
<li>Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-guided+automatic+three+dimensional+synapse+quantification+for+drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons.</a> BMC Bioinformatics. 16, 177(2015).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+reconstruction+of+3D+neuron+structures+using+a+graph-augmented+deformable+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model.</a> Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).</li>
<li>Sturt, B. L., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+synaptic+fluorescence+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li>
<li>Kremer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+long-term+changes+at+mushroom+body+input+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural long-term changes at mushroom body input synapses.</a> Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).</li>
<li>Mosca, T. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+the+Drosophila+antennal+lobe+and+its+regulation+by+the+Teneurins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins.</a> Elife. 3, e03726(2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17487202">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure.</a> Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).</li>
<li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732(2013).</li>
<li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר זה, הראינו כיצד להכין את תנאי התאורה לחשוף זבובים אל עוצמת אור שווה. אנחנו לכמת לא רק את המספר של puncta סמן הסינפטי אלא גם יכולים מרחבית לפתור את הצפיפות של סינפסות לאורך אקסונים למדוד את רמת delocalization של חלבון הסמן באזורי cytoplasmic. הערכות שלוש אלה מאפשרים לנו להעריך את הפרטים של דינמיקה הסינפטי ברמת נוירון הבודדה בתנאים סביבתיים שונים. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם חלבונים סינפטיים שונים אלא גם לכל נתונים המכילים אותות punctate. <p class="jove_content" style=...

<html> האפנון של פונקציה סינפטי תורם ליכולת המדהימה של מערכת העצבים להגיב בדיוק או להסתגל לשינוי לגירויים סביבתיים. התאמת הסתברות שחרור שלפוחית presynaptic היא אחת דרכים של שליטת כוח הסינפטי 1. שחרור שלפוחית סינפטית מתקיים האיזור הפעיל (AZ), אזור מיוחד של הקרום presynaptic 2. AZ מאופיין קסטה של חלבונים ספציפיים 3, 4. רוב החלבונים תורמים הרכבת AZ הם שמורים ביותר נמטודות, חרקים ויונקים 5. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי רמת הפעילות העצבית מסדיר את ההרכב המולקולרי של AZ, אשר בתורו תורם הסדרת פלט פונקציונלי הן במבחנה in vivo 6, 7,&gt; 8. מצאנו בעבר כי AZS קולטי האור לעבור שיפוץ מולקולרי תסיסנית לאחר חשיפה ממושכת לאור 9 הסביבה טבעית. במצב זה, צפינו שמספר Bruchpilot (BRP) -positive AZS הופחת אקסונים קולטי האור. החלבונים המשפחה BRP / CAST / Elks הם אבני הבניין הבסיסיות של AZS סינפסות חוליות ונטול עצמות 10. מוטנטים תסיסנית BRP, עורר שחרור שלפוחית מדוכא 11, 12. 17 שאריות חומצת אמינו C- מסוף של BRP חיוניים אשכולות שלפוחית סינפטית בצומת Neuromuscular תסיסנית (NMJ) 13, 14. מחקרים אלה הוכיחו את תפקידה המרכזי של מולקולה זו בארגון AZ ותפקוד. עם כלי גנטי שפותח לאחרונה, Synaptic תיוג עם רקומבינציה (כוכב), BRPניתן להבחין in vivo ב סוגי תאים מסוימים, ברמות ביטוי אנדוגני ברזולוציה סינפסה אחת 15. כלי זה עושה את זה אפשרי להעריך את הדינמיקה אנדוגני של סינפסות כמותית במערכת העצבים המרכזית המורכבת. היו מספר מחקרים כולל quantifications סינפסה על בסיס נתונים המתקבלים מן מיקרוסקופיה confocal. שינויי Synaptic הוערכו על ידי מדידת האורך, באזור, ההיקף, הצפיפות וספירת המספר המבוססים על יישומי תוכנה מתוחכמים. למשל, ImageJ החופשית מספקת שיטת כימות לאזור הסינפטי הכולל ואמצעי צפיפות הסינפטי ב תסיסנית NMJ 16. מספר האתרים colocalization של סמנים טרום postsynaptic כבר לכמת באמצעות התוסף &quot;Analyzer puncta&quot; זמין על פלטפורמת ImageJ תוכנה 17. לחלופין, א-נקוב רבתכנית מבוססת סביבת מחשוב המספרית adigm, גלאי סינפסה (synd), יכולה לעקוב אחר דנדריטים של נוירונים שכותרתו אוטומטית עם סמן פלואורסצנטי, ולאחר מכן מכמתת את רמות החלבון הסינפטי כפונקציה של מרחק מגוף התא 18. תוכנת Synaptic puncta הניתוח (SynPAnal), תוכננה עבור הניתוח המהיר של תמונות 2D של נוירונים רכשו במיקרוסקופ confocal או פלואורסצנטי. התפקיד העיקרי של תוכנה זו היא כימות אוטומטית ומהירה של צפיפות ועוצמת חלבון puncta 19. לאחרונה, אלגוריתם זיהוי סינפסה אוטומטית מבוססי למידה נוצר כימות של מספר הסינפטי ב -3 D 20, ניצול של 3D ויזואליזציה בסיוע ניתוח (Vaa3D) תוכנה 21. תוכנת ניתוח תמונה מסחרית הם גם כלים רבים עצמה עבור quantifications הסינפטי. למשל, fluorescentlyקולטני הנוירוטרנסמיטר שכותרתו או רכיב AZ presynaptic כבר לכמת בשלושה ממדים עם ברזולוציה יחיד סינפסה ב C. elegans 22 או מערכת חוש הריח תסיסנית 23, 24, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות בתוך מדגם יחיד. כאן, אנו מציגים שיטה ידי תוכנת ניתוח תמונה אישית תוספת מיושמת בסביבת מחשוב מספרית רבה הפרדיגמה המאפשרת לנתח חצי אוטומטית מגוון רחב של אספקטי AZS, לרבות מספרם, הפצה ברמת ההעשרה של רכיבים מולקולריים במדריך המפות. לפיכך, ניתוח מורכב זה אפשר לנו להעריך את הדינמיקה של רכיבים סינפטיים במסופי האקסון בתנאים סביבתיים שונים. חקרנו את שפעת חשיפת אור על סינפסות הפלט של קולטני אור זבוב בוגר. ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1)לקראת חשיפה לאור, 2) לנתיחה, אימונוהיסטוכימיה ו הדמיה confocal, ו -3) ניתוח התמונה.

<table><tbody><tr><td>בקבוקון</td><td>הייטק, יפן</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>תקע</td><td>תרמו פישר Sciehtific, ארה"ב</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>מתלה שקוף מותאם אישית עשוי שרף אקרילי&nbsp;</td><td>תאגיד שין-שין, יפן</td><td></td><td>גובה 41 ס"מ, בסיס 21 ס"מ, עובי 4 ס"מ וגובה 13 ס"מ לכל שלב</td></tr><tr><td>אינקובטור מגניב</td><td>מיצובישי אלקטריק, יפן</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>פאנל LED</td><td>MISUMI, יפן</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>מד אור דיגיטלי</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>כרית זבוב</td><td>טוקן, יפן</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי (35 x 10 מ"מ)</td><td>Greiner Bio-One International, גרמניה</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>טבלית PBS</td><td>Takara, יפן</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, יפן</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>צינור 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt, גרמניה</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד 16%</td> <td>NEM, יפן</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>פיפטמן P-200</td><td>גילסון</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד כאופטין</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-Conjugated Anti-Mouse</td><td>Anti-Mouse Technologies</td><td>Life Technologies A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>שקופית מיקרוסקופ H-1000</td><td></td></tr><tr><td>(76 x 26 מ"מ)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslip (18 x 18 מ"מ, 0.17 מ"מ)</td><td>Zeiss, גרמניה</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופים תעשייתיים</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>תאורת מיקרוסקופ סטריאו</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td><td>צייס, גרמניה</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, שוויץ</td><td></td><td>גרסה 7.6.4 ומעלה</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקסל עבור Mac&nbsp;</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

מערכת העצבים יש את היכולת המדהימה להסתגל ולהגיב לגירויים שונים. התאמה עצבית זו מושגת בעיקר באמצעות פלסטיות ברמה הסינפטי. האיזור הפעיל (AZ) הוא האזור על הממברנה presynaptic שמתווך שחרור הנוירוטרנסמיטר והוא מורכב מאוסף צפוף של חלבוני פיגום. AZS של תסיסנית (דרוזופילה) קולטני אור לעבור שיפוץ מולקולרי לאחר חשיפה ממושכת לאור הסביבה טבעי. כך רמת הפעילות עצבית יכולה לארגן מחדש את ההרכב המולקולרי של AZ ולתרום הסדרת הפלט הפונקציונלי. החל מ בהכנת הגדרת חשיפה לאור על אימונוהיסטוכימיה, פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את המספר, את הפריסה המרחבית, ורמת delocalization של מולקולות הסינפטי AZS ב קולטני האור תסיסנית. באמצעות ניתוח תמונה software, אשכולות של רכיב AZ-התמזג GFP Bruchpilot זוהו עבור כל קולטי אור R8 מסוף האקסון (R8). זוהו כתמי Bruchpilot חולקו באופן אוטומטי אקסונים R8 פרט. כדי לחשב את חלוקת תדר נקודה לאורך האקסון, יישמנו תוסף תוכנה מותאם אישית. כל סטארט-נקודת הקצה של האקסון הוגדרו באופן ידני ואת המיקום של כל נקודה ונקודת Bruchpilot היה מוקרן על הקו המחבר בין התחלת נקודת סיום. מלבד מספר אשכולות Bruchpilot, אנחנו גם לכמת את רמת delocalization של Bruchpilot-GFP בתוך אשכולות. מדידות אלה משקפים בפירוט את הדינמיקה הסינפטי נפתרה מרחבית ב נוירון בודד בתנאים סביבתיים שונים לגירויים.

העין המתחמת של תסיסנית מורכבת ~ 780 האומטידיה, שכל אחת מהן מכיל שמונה סוגים של קולטני אור (R1-8). R7 ו R8 פרויקט האקסונים שלהם אל גנגליון השני האופטי, הלשד, שם הם יוצרים סינפסות בשכבות M6 ו M3, בהתאמה 26. כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה ממושכת אור על ההרכב המולקולרי של אזורי R8 קולטי האור פעיל, לקחנו את היתרון של שיטת הכוכבים 15. רמות ביטוי אנדוגני של BRP תויגו fluorescently ידי מרפרף את קודון ע...

כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא להבין את הדינמיקה הסינפטית בנוירון בודד תחת תנאי הפעלה שונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפלסטיות הסינפטית, כגון חשיפת שינויים בהרכב המולקולרי של סינפסות בעקבות הבשלת פעילות הנוירון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח חצי-אוטומטי של היבטים מרובים של סינפסות, כולל מספרן, התפלגותן ורמת ההעשרה של מרכיבים מולקולריים בסינפסות.עבור ניסוי זה, אספו את הזבובים למבחנות רגילות בתוך שש שעות מהבקיעה (eclosion). הכניסו את מבחנות האיסוף למעמד אקרילי שקוף. בתוך דגרה קטנה המכוון ל-25 °C, מקמו את המעמד במרחק מדויק מפאנל LED שבו החשיפה לאור היא בממוצע 1000 lux.לאחר מכן, גדלו את הזבובים למשך יום אחד עד שלושה ימים תחת אחד מהתנאים הבאים: חשיכה קבועה, 12 שעות אור ולאחריהן 12 שעות חשיכה, או אור קבוע. בשלב מאוחר יותר, בצעו דיסקציה וצביעה של המוחות באמצעות טכניקות סטנדרטיות. כדי להכין את מוחות הזבובים למשקף, טענו מיקרופיפט במדיום קיבוע והניחו שתי טיפות של 2 µL במרכז של סמיכה למסננת (microscope slide), במרחק של כ-2 cm אחת מהשנייה.הניחו זכוכית כיסוי על כל טיפה, כך שהמרווח יהיה כ-0.2 mm. לאחר מכן, טפטפו 15 µL של תמיסת קיבוע (mounting medium) מעל זכוכיות הכיסוי ועד למרווח. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), העבירו את המוח אל תוך המרווח באמצעות מיקרופיפט.לאחר מכן, מקמו את המוחות כאשר הצד הוונטרלי (בטני) פונה כלפי מעלה. לבסוף, הצמידו כיסוי זכוכית (cover slip) ואטמו אותו לאורך הקצוות באמצעות לק שקוף. לאחר מכן ניתן לצלם את המוחות בטכניקות סטנדרטיות לשחזור תמונות בתלת-ממד.במקרה זה, לומניסנציית GFP תועדה בתאים בעלי ביטוי פעיל של Brp באמצעות שיטת ה-star. כמו כן, בדוגמה זו, אקסונים של פוטורספטורים R7 ו-R8 סומנו אימונולוגית באמצעות anticiaoptin, אשר נצפה באמצעות נוגדנים משניים המסומנים ב-RFP. כדי לכמת את מספרן, את פיזורן ואת רמת הדלוקליזציה של נקודות (puncta) ה-Brp GFP, טענו תחילה תמונות תלת-ממדיות משוחזרות של המוח שנוצרו מערימות תמונות.נקודות Brp מוצגות בלבן. כעת, אתרו את אזור העניין. במקרה זה, קצות האקסונים של R8 ממוקמים על ידי מעקב אחר ההדקה של האקסונים החיוביים לאנטיסיאופטין בנקודת הכניסה לשכבת ה-M3 של המדולה.בכל קצה של אקסון R8 זהה את נקודות ה-Brp GFP באמצעות מודול זיהוי הנקודות (spot detection). בחר ב-"add new spots" ולאחר מכן בחר ב-"segment only region of interest" בהגדרות האלגוריתם. לאחר הגדרת אזור הניתוח, הגדר את ערוץ המקור ל-Brp GFP ולאחר מכן הגדר את הקוטר המוערך ב-XY ל-0.35 microns.לאחר מכן, סמנו את אפשרות החסרת הרקע (background subtraction) בזיהוי הנקודות (spot detection). בשלב הבא, בחרו ב"איכות" (quality) כסוג המסנן, והפונקטה (puncta) יסוננו באופן אוטומטי. השלימו שלב זה על ידי לחיצה על סיום (finish).חזור על שיטת זיהוי הנקודות עבור כל אקסוני ה-R8 במערך הנתונים. האזור הבא שיש לזהות הוא הציטופלזמה של האקסון. ראשית, צור אובייקטים של פני שטח באמצעות פונקציית surface.לאחר מכן, בחרו בתוספת משטחים חדשים (add new surfaces), ותחת הגדרות האלגוריתם, הפעילו את האפשרות לביצוע סגמנטציה של אזור העניין בלבד (segment only region of interest). כעת, בחרו ידנית את אזור העניין. לאחר מכן, הגדירו את פרמטרי החישוב.כדי למצוא את תעלת הפטורצפטור כמקור, בחרו באפשרות smooth. עבור הסף, בחרו ב-absolute intensity. הפעילו את האפשרות split touching objects.הגדירו את קוטר נקודות המגע (seat points) ל-0.5 microns והשתמשו בהגדרות המסנן ברירת המחדל עבור האיכות ומספר הווקסלים (voxels). המסנן יוחל לאחר מכן באופן אוטומטי. כעת, עבורו לעריכה ומחקו את חלקי הפני השטח שנוצרו מחוץ לאזור העניין (region of interest).במקרה זה, שאר האקסונים. לאחר חזרה על זיהוי אזור האקסון עבור כל אקסוני ה-R8 במערך הנתונים, כל נקודות ה-Brp ואקסוני ה-R8 מזוהים כסט של אובייקטי נקודות (spot objects). והאזורים הציטופלזמיים התואמים מזוהים כאובייקטי שטח (surface objects).כעת, המשיכו להגדיר ידנית את הכיוון והמרחב של כל אקסון. שלב זה חשוב לצורך כימות עתידי של צפיפות Brp GFP לאורך כל נוירון בניורופיל של המדולה. כדי לעשות זאת, הגדירו תחילה את נקודות ההתחלה והסיום שלהם.בחרו באפשרות להוספת נקודות מדידה חדשות (add new measurement points), לאחר מכן בחרו בעריכה (edit) ואז בבחירת פני השטח של האובייקט (select surface of object) כדי לעבוד עם החלק העליון של אובייקטי פני השטח. כדי להגדיר את נקודות ההתחלה, מקמו נקודות מדידה על כל אובייקטי פני השטח של ה-R axons בשכבת ה-M1. מקמו נקודות אלו בסדר שיטתי הניתן לשחזור.בשלב הבא, הגדירו את נקודות הסיום. בחרו ב-"add new measurement points", "edit" ושוב ב-"surface of object". לאחר מכן, תוך חזרה על אותו סדר שיטתי, הניחו נקודות מדידה בחלק התחתון של אקסוני ה-R בשכבה M3.כדי לכמת את עוצמת הרקע של Brp, נתחו את האזורים הציטופלזמיים של שני אקסונים של R7. בחרו באפשרות להוספת משטחים חדשים (add new surfaces) והגדירו ידנית את האזור של אקסון R7 כפי שנעשה עבור אקסוני R8. השתמשו בהגדרות זהות, למעט אפשרות ה-enable split touching objects, אותה אין להפעיל.השאר זאת כבוי. כעת, הוסף אובייקט נקודות דמי (dummy spots) בתוך אזור ציר אקסון R7 מוגדר. בחר באפשרות הוסף נקודות חדשות (add new spots), בחר בדלג על יצירה אוטומטית (skip automatic creation), וערוך ידנית.לאחר מכן, בחרו ב-center of object ולחצו על ה-surface object כדי למקם את ה-dummy spots object בתוך ה-R7 axon. כעת, חזרו על שלבי זיהוי השטח והנקודות עבור R7 axon שני. לאחר מכן, הגדירו את נקודות הקצה ההתחלתית והסופית של ה-R7 axons כפי שנעשה עם ה-R8 axons.עבור ניתוח זה, ודאו שהתוכנה המתאימה מותקנת. פתחו את מערך הנתונים המכיל את נתוני הנקודות (spot data), נתוני המשטחים (surfaces data) ושני אובייקטים של נקודות מדידה, כאשר כל אחד מהם מכיל את אותו מספר של נקודות מדידה. בחנו את הנתונים.שני אובייקטי נקודות המדידה חייבים להכיל מספר זהה של נקודות מדידה כדי שהחישובים יעבדו. לאחר הגדרת הנקודות (spots), אזורי האקסון ונקודות ההתחלה והסיום, הפעילו את התוסף. ראשית, בדקו את המטא-דאטה, ובמיוחד את גודל הווקסל (voxel size).פתחו את מאפייני התמונה (image properties) דרך עריכה (edit), ולאחר מכן בדקו את שלושת ממדי הווקסל (voxel) ואת המיקרונים תחת קואורדינטות (coordinates) בגיאומטריה (geometry). לאחר מכן, בחרו ערוץ לצורך ניתוח העוצמה (intensity analysis). במקרה זה, נבחר הערוץ המציג את Brp GFP.לאחר מכן, הגדירו את שם הקובץ עבור התוצאות. בשלב הבא, הגדירו את מספר הסלים (bins) כ-10, וקבעו את אורך האקסון ל-100%. לאחר מכן, הגדירו את אזורי הפונקטה (puncta) על ידי קביעת רדיוס הנקודה ל-0.35 microns ואת האזור הציטופלזמי המקיף ל-50 microns. לבסוף, הפעילו את פקודת זיהוי הסינפסים, ובשלב מאוחר יותר, בצעו ניתוח סטטיסטי של הפלט.בהתאם לפרוטוקולים המתוארים, נותחו נקודות (puncta) של Brp GFP בסינפסות ה-R8 של זבובים שנחשפו לחושך קבוע, לאור קבוע, או למחזור אור/חושך רגיל. מספר נקודות ה-Brp פחת באופן משמעותי בפוטורצפטורים מסוג R8 של זבובים שנשמרו באור קבוע. התפלגות הנקודות חושבה באמצעות תוסף (plugin) מותאם אישית.סינפסות R8 היו מפוזרות לאורך כל ציר האקסון מהשכבה M1 לשכבה M3, אך צפיפותן הייתה גבוהה יותר בשכבות M1 ו-M3. באופן דומה, חושבו רמות הדילוקליזציה (delocalization) של הפונקטה (puncta). אלו לא השתנו בכל התנאים, אולם רמות הדילוקליזציה של Brp GFP היו שונות ממרקרים אחרים, כגון Brp-short-cherry שנעשה לו מטושטש (defused) באופן ברור תחת תאורה קבועה.ייתכן שקיימת עיבוד שגוי של מקטע ה-Brp הקצר לאחר הפירוק מה-AZ. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מנתחים תכונות פלסטיות סינפטיות בנוירון בודד. תכונות פלסטיות אלו כוללות את מספר הסינפסות, את התהלוכיותן ואת רמת העשרה של רכיב מולקולרי ספציפי בסינפסות.

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוצדורה זו משתמשת ערוץ תכלת המופעל אצות תא ספציפי כלי הביטוי הגנטי לעורר פוטנציאלים סינפטיים עם להבזקי האור בצומת neuromuscular (NMJ)...

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לרישום אלקטרופיזיולוגי של פעילות קולטני אור בעין של דרוזופילה משותקת, המאפשר מדידה מדויקת של שינויי מתח בתגובה לגירויי אור.

רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות מתח של פוטורצפטורים ברשתית דרוזופילה לגירויי אור

סרטון זה מדגים פרוטוקול ניסיוני לחקר פוטנציאל הלוואי הממושך של דה-פולריזציה (PDA) בדרוזופילה לבנה עיניים. עין הזבוב נחשפת לפעימות אור כחול עזות כדי להמיר את רודופסין הפוטופיגמנט למטרהודופסין, מה שגורם למפל איתות שפותח תעלות יונים חיוביות וגורם לדפולריזציה של הממברנה. מאחר שאור כחול מונע המרה מחדש של מטרורודופסין לרודופסין, זרם מתמשך של יונים חיוביים גורם לדפולריזציה מתמשכת, הידועה בשם פוטנציאל לוואי ממושך של דה-פולריזציה (PDA).

חקירת פוטנציאל לוואי ממושך של דה-פולריזציה (PDA) בפוטורצפטורים של דרוזופילה

סרטון זה מדגים את גידולו של Drosophila melanogaster בתנאי אור ספציפיים כדי לחקור את תפקידם של חלבוני Bruchpilot בשחרור מוליכים עצביים ואת המודולציה הנובעת מכך של פעילות סינפטית.

אפנון סינפטי בדרוזופילה לאחר חשיפה לאור ממושך

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחקר מחזור שלפוחית סינפטית בצמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה המבטאים צ'נלרודופסין באמצעות צבע פלואורסצנטי. אור כחול מפעיל את הצ'אנלרודופסינים, גורם לזרימת סידן ולאקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית. הצבע משתלב בקרומים העצביים ומופנם במהלך אנדוציטוזה, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות מוגברת. גירוי נוסף של אור כחול גורם לאקסוציטוזה ולשחרור צבע, אשר מוצג על ידי פלואורסצנטיות מופחתת.

ניתוח מחזור שלפוחית סינפטית וקליטת צבע פלואורסצנטי בזחלי דרוזופילה

כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת מקום קל לחקור התנהגות של דרוזוהילה זחל פוטוטקטיקה. בשיטה זו, נקודת אור נוצרת כגירוי קל, והתהליך של התחמקות מאור הזחל נרשם על-ידי מערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום.

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

חקור אפנון סינפטי בקולטני אור של Drosophila melanogaster לאחר חשיפה לאור ממושך. שיטה זו מאפשרת ניתוח חצי-אוטומטי של מספר ותפוצת אזורים סינפטיים פעילים במערכת העצבים.

ניתוח Synaptic אפנון של

גלה סרטונים נוספים