Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

El objetivo general de este experimento es obtener evidencia cuantitativa, espacial y temporal de la colocalización del lisosoma del receptor de angiotensina tipo uno después del tratamiento con angiotensina dos. Este método fue ideado para detectar diferencias en el procesamiento subcelular de los receptores de tipo Y frente a los mutantes, al igual que durante el proceso de internalización, que se emite en respuesta a la simulación de ligandos. Las ventajas de esta técnica son que la obtención de imágenes de células vivas elimina los artefactos de las células fijas y permeabilizadas con detergente y que los cambios dinámicos en la localización de los receptores se pueden evaluar en tiempo real.

Comience seleccionando un objetivo de apertura numérica de 1,4 apropiado y centrando el objetivo sobre la platina del microscopio. Agregue una gota de aceite de inmersión de alta viscosidad y baja autofluorescencia en el objetivo y transfiera la cámara con las células transfectadas a la etapa del microscopio. Levante suavemente el objetivo hasta que el aceite toque la parte inferior de la primera diapositiva y localice las celdas tenues.

Con una célula de interés sana, en el centro del campo de visión, cambie al modo confocal y confirme que la célula está bien distribuida, con su lado ventral yuxtapuesto estrechamente con el cubreobjetos. Abra el cuadro de diálogo Pila Z, haga clic en En vivo, descéntrese en la parte superior de la celda y, a continuación, haga clic en Comenzar. A continuación, concéntrese en la parte inferior de la celda, introduzca el tamaño de paso Z de 1,00 micrómetros y, a continuación, haga clic en Fin.

A continuación, seleccione Modo XYZT en Configuración de adquisición en la parte superior. Por último, establezca el intervalo de tiempo para la exploración y el período de tiempo para observar la orientación del receptor de angiotensina tipo 1A marcado con GFP a los lisosomas. Luego, para comenzar la estimulación del ligando, agregue tres microlitros de una solución madre de ligando 100 X al pocillo que se está fotografiando y haga clic en Iniciar para obtener una imagen de la respuesta en 3D durante el período y la frecuencia deseados.

Para analizar las imágenes de células vivas, abra el software de cuantificación de imágenes 3D adecuado. En este protocolo, Velocity. Haga clic con el botón derecho dentro del campo de la imagen y seleccione Propiedades.

Introduzca las propiedades de píxel de imagen XY y Z adecuadas para crear una secuencia de medición para analizar las intensidades de las células receptoras marcadas con GFP, vesículas y agujeros en respuesta al tratamiento con ligando. En el menú 2D, seleccione el modo de enfoque extendido para observar la celda. A continuación, use la herramienta de región de estilo libre para dibujar una región de interés alrededor de la celda y haga clic con el botón derecho en la imagen para seleccionar Recortar a selección.

Se generará un nuevo elemento de imagen. Haga clic en el nombre de la imagen para seleccionar la imagen de la celda recortada y abrir la pestaña de medición. Para medir la expresión de GFP de las vesículas internalizadas, arrastre Buscar objetos de Búsqueda al cuadro de secuencia de arriba.

Establezca el canal de búsqueda de objetos en GFP y abra el icono de configuración para establecer el umbral utilizando la desviación estándar y el límite inferior en seis, para seleccionar los objetos con las intensidades de GFP más brillantes. Establezca el tamaño mínimo del objeto en cero micrómetros cúbicos. A continuación, haga clic en medir y seleccione los canales y los tipos de mediciones.

Para definir los umbrales y los filtros para identificar toda la celda y medir la intensidad total de GFP, arrastre un segundo cuadro Buscar objetos. A continuación, establezca el canal Buscar objetos en GFP y establezca la desviación estándar en cero, para seleccionar objetos con cualquier intensidad de GFP y un tamaño mínimo de objeto de dos micrómetros cúbicos. Arrastre Filtrar población al cuadro Buscar objetos de población dos y seleccione un volumen de micrómetros al cubo, superior a 100 para seleccionar toda la celda y eliminar todos los objetos más pequeños.

A continuación, seleccione las medidas y el elemento Realizar medición, para realizar la medición en todos los puntos temporales. Para analizar la expresión de GFP medida en vesículas y en toda la celda a lo largo del tiempo, haga clic en el nombre del archivo del elemento de medición debajo del nombre de la imagen. Para extraer los datos de GFP y vesículas de los datos totales, abra la pestaña sin procesar y seleccione población uno.

A continuación, abra la pestaña analizado y, haga clic con el botón derecho del ratón en los datos, seleccione análisis, seguido de restringir el análisis para seleccionar la población uno. Para medir la cantidad de GFP en toda la célula, cambie ambos a la población dos. En Analizar estos datos y resumir por, seleccione suma, canal de color GFP y suma.

A continuación, en Organizar los datos por y fila, seleccione el punto de tiempo. Para extraer los datos de la cantidad de GFP en los lisosomas, en el de Buscar objetos para la población, establezca el canal de búsqueda de objetos en el canal rojo. En el icono de la rueda dentro del cuadro de diálogo, establezca el umbral usando una desviación estándar, el límite inferior en seis, para seleccionar los objetos rojos con las intensidades más brillantes y el tamaño mínimo del objeto en 0,017 micrómetros cúbicos.

Seleccione las medidas y haga que el elemento de medición se realice para realizar la medición en todos los puntos de tiempo. Para analizar la expresión de GFP medida en los lisosomas, haga clic en el nombre del archivo del elemento de medición debajo del nombre de la imagen. Seleccione la población uno en la pestaña sin procesar y, a continuación, seleccione la población uno y la suma del canal de color GFP y la suma en la pestaña analizar, haciendo clic con el botón derecho como antes para medir la cantidad de GFP en las vesículas rojas.

Antes de la estimulación del ligando, los receptores de angiotensina tipo 1A marcados con GFP se localizan predominantemente en la membrana plasmática. Pero a los 2,5 minutos de la adición de angiotensina dos, estos receptores se internalizan, formando vesículas brillantes y posteriormente agrupaciones y grandes vesículas de paranuclearzoma. El desborde inducido por angiotensina dos complica la cuantificación de la intensidad total de la GFP de la vesícula como se observa para estos datos representativos de medición de la expresión de GFP.

El filtrado de tamaño no discrimina entre los volantes más grandes y las vesículas agrupadas, pero revela que la GFP en objetos más pequeños aumenta antes que la GFP en objetos más grandes. En este curso de tiempo representativo de la expresión de GFP sin enfoque automático, la GFP internalizada se midió como el porcentaje de GFP celular total. El análisis de la GFP total dentro de la célula reveló que esta célula no se fotoblanqueó apreciablemente con el tiempo.

La cuantificación de la GFP en los lisosomas de las células transfectadas también indica que la intensidad del receptor de angiotensina tipo 1A presente en los lisosomas no varía hasta 24 minutos después de la administración de angiotensina dos. Durante este procedimiento, es importante recordar monitorear la salud de las células antes y durante la toma de imágenes, ya que el procedimiento requiere mucho tiempo, el experimento debe abortarse si los cultivos celulares son anormales de alguna manera. Siguiendo este procedimiento, se puede utilizar la inmunotinción y FRET o FLIM para detectar y confirmar la localización subcelular de los receptores.

Las Western blots se pueden realizar para abordar la identidad y los cambios en las moléculas de señalización involucradas durante el tráfico de receptores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes y análisis de células vivas para medir el receptor transmembrana inducido por ligandos que se dirige a los lisosomas, así como a otros compartimentos subcelulares.