Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

El objetivo general de este experimento es obtener evidencia cuantitativa espacial y temporal de la colocalización del receptor de angiotensina tipo uno con lisosomas tras el tratamiento con angiotensina dos. Este método fue diseñado para detectar diferencias en el procesamiento subcelular de receptores de tipo Y frente a receptores mutantes, como durante el proceso de internalización, que se activa en respuesta a la estimulación con ligando. Las ventajas de esta técnica son que el uso de imágenes en células vivas elimina los artefactos provenientes de células fijadas y permeabilizadas con detergentes, y que los cambios dinámicos en la localización del receptor pueden evaluarse en tiempo real.

Comience seleccionando un objetivo con una apertura numérica de 1,4 adecuado y centre el objetivo sobre la platina del microscopio. Añada una gota de aceite de inmersión con alta viscosidad y baja autofluorescencia sobre el objetivo y transfiera la cámara con las células transfectadas a la platina del microscopio. Eleve suavemente el objetivo hasta que el aceite toque apenas la parte inferior del primer portaobjetos y localice las células tenues.

Con una célula sana de interés situada en el centro del campo de visión, cambie al modo confocal y confirme que la célula esté bien extendida, con su lado ventral adyacente estrechamente al cubreobjetos. Abra el cuadro de diálogo de corte Z, haga clic en Vivo, enfoque en la parte superior de la célula y luego haga clic en Iniciar. A continuación, enfoque en la parte inferior de la célula, introduzca un tamaño de paso Z de 1,00 micrómetro y luego haga clic en Finalizar.

Luego, seleccione el modo XYZT en la configuración de adquisición en la parte superior. Por último, establezca el intervalo de tiempo para el escaneo y la duración del escaneo para observar la localización del receptor de angiotensina tipo 1A marcado con GFP hacia los lisosomas. A continuación, para iniciar la estimulación con el ligando, agregue tres microlitros de una solución stock 100 X del ligando al pocillo que se está observando y haga clic en Iniciar para registrar la respuesta en 3D durante el período y la frecuencia deseados.

Para analizar las imágenes de células vivas, abra el software adecuado de cuantificación de imágenes 3D. En este protocolo, Velocity. Haga clic con el botón derecho dentro del campo de la imagen y seleccione Propiedades.

Introduzca las propiedades adecuadas de píxeles de imagen en XY y Z para crear una secuencia de medición destinada a analizar la intensidad de las vesículas del receptor marcadas con GFP y de las células completas en respuesta al tratamiento con ligando. En el menú 2D, seleccione el modo de enfoque extendido para observar la célula. A continuación, utilice la herramienta de región libre para dibujar una región de interés alrededor de la célula y haga clic derecho en la imagen para seleccionar Recortar a la selección.

Se generará un nuevo elemento de imagen. Haga clic en el nombre de la imagen para seleccionar la imagen de la célula recortada y abra la pestaña de mediciones. Para medir la expresión de GFP en las vesículas internalizadas, arrastre Buscar Objetos desde Búsqueda hasta el cuadro de secuencia anterior.

Establezca el canal de búsqueda de objetos en GFP y abra el icono de configuración para ajustar el umbral utilizando la desviación estándar y el límite inferior a seis, con el fin de seleccionar objetos con las intensidades más brillantes de GFP. Establezca el tamaño mínimo del objeto en cero micrómetros cúbicos. A continuación, haga clic en medir y seleccione los canales y los tipos de mediciones.

Para definir el umbral y los filtros para identificar la célula completa y medir la intensidad total de GFP, arrastre una segunda caja Buscar Objetos. A continuación, establezca el canal Buscar Objetos en GFP y fije la desviación estándar en cero, para seleccionar objetos con cualquier intensidad de GFP y un tamaño mínimo de objeto de dos micrómetros cúbicos. Arrastre Filtrar Población a la caja Población dos Buscar Objetos y seleccione un volumen en micrómetros cúbicos mayor que 100 para seleccionar la célula completa y eliminar todos los objetos más pequeños.

A continuación, seleccione mediciones y el elemento Realizar medición para obtener mediciones en todos los puntos de tiempo. Para analizar la expresión de GFP medida en las vesículas y en toda la célula a lo largo del tiempo, haga clic en el nombre del archivo del elemento de medición que aparece debajo del nombre de la imagen. Para extraer los datos de GFP y de las vesículas a partir de los datos totales, abra la pestaña de datos brutos y seleccione la población uno.

A continuación, abra la pestaña analizada y, haciendo clic derecho sobre los datos, seleccione análisis, seguido de restringir el análisis a la población uno. Para medir la cantidad de GFP en toda la célula, cambie ambas a la población dos. En Analizar estos datos y Resumido por, seleccione el canal de color GFP total y suma.

Luego, en Organizar los datos por, y fila, seleccione punto temporal. Para extraer los datos sobre la cantidad de GFP en lisosomas, en Encontrar objetos para la población uno, establezca el canal de búsqueda de objetos en el canal rojo. En el icono de rueda dentro del cuadro de diálogo, configure el umbral utilizando la desviación estándar, el límite inferior en seis, para seleccionar objetos rojos con las intensidades más brillantes, y el tamaño mínimo del objeto en 0,017 micrómetros cúbicos.

Seleccione mediciones y cree un elemento de medición para realizar la medición en todos los puntos de tiempo. Para analizar la expresión medida de GFP en los lisosomas, haga clic en el nombre del archivo del elemento de medición debajo del nombre de la imagen. Seleccione la población uno en la pestaña raw y luego seleccione la población uno y el canal de color GFP sum y sum en la pestaña analyze, haciendo clic derecho como antes para medir la cantidad de GFP en las vesículas rojas.

Antes de la estimulación con ligando, los receptores de angiotensina tipo 1A marcados con GFP se localizan predominantemente en la membrana plasmática. Sin embargo, dentro de los 2,5 minutos posteriores a la adición de angiotensina dos, estos receptores se internalizan, formando vesículas brillantes y posteriormente agrupándose en vesículas paranucleares grandes. Las ondulaciones inducidas por la angiotensina dos complican la cuantificación de la intensidad total de GFP en las vesículas, como se observa en estos datos representativos de medición de expresión de GFP.

La filtración por tamaño no discrimina entre las arrugas más grandes y las vesículas agrupadas, pero sí revela que la GFP en objetos más pequeños aumenta antes que la GFP en objetos más grandes. En este curso temporal representativo de expresión de GFP sin enfoque automático, se midió la GFP internalizada como el porcentaje de GFP celular total. El análisis de la GFP total dentro de la célula reveló que esta célula no presentó fotoblanqueo apreciable a lo largo del tiempo.

La cuantificación de la GFP en los lisosomas de células transfectadas también indica que la intensidad del receptor de angiotensina tipo 1A presente dentro de los lisosomas no varía durante los primeros 24 minutos tras la administración de angiotensina II. Durante este procedimiento, es importante recordar monitorear la salud de las células antes y durante la adquisición de imágenes, ya que el procedimiento es largo; el experimento debe interrumpirse si los cultivos celulares presentan alguna anormalidad. Tras este procedimiento, se puede utilizar inmunotinción junto con FRET o FLIM para detectar y confirmar la localización subcelular de los receptores.

Se pueden realizar transferencias Western para abordar la identidad y los cambios en las moléculas de señalización implicadas durante el tráfico de receptores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes y análisis en células vivas para medir la localización inducida por ligandos de receptores transmembrana hacia los lisosomas, así como hacia otros compartimentos subcelulares.