No invasiva En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es utilizar imágenes ópticas para visualizar una sonda activable para evaluar la actividad in vivo de las metaloproteasas de matriz clave, o MMP, en modelos experimentales de inflamación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el mecanismo biológico subyacente en las enfermedades inflamatorias. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, barata y fácil de aprender.

Además, se dispone de una gran variedad de sondas para dirigirse a diferentes procesos biológicos. Para la inducción de la artritis reumatoide, primero use un micrómetro para medir todos los diámetros de tobillo de cada animal. A continuación, levante suavemente el primer ratón por la cola e inyecte intraperitonealmente 200 microlitros de suero de ratón KBN diluido que contiene anticuerpos contra la glucosa seis fosfato isomerasa o GPI.

A continuación, vuelva a colocar al animal en su jaula y mida la hinchazón del tobillo diariamente hasta el sexto día. Para la sensibilización por hipersensibilidad de contacto, use un recortador de pelo de animal pequeño para afeitar cuidadosamente un área de dos por dos centímetros del abdomen de un ratón anestesiado y use una pipeta de 100 microlitros para aplicar 80 microlitros de solución de TNCB al 5% recién preparada sobre la piel expuesta. Es muy importante evitar lesionar la piel en cualquier momento durante el procedimiento, ya que esto puede dar lugar a señales fluorescentes inespecíficas dentro del animal y puede afectar los resultados del estudio.

Vuelva a colocar al animal en su jaula, evitando las bajas temperaturas corporales durante la fase de recuperación. Seis días después, use una pipeta para aplicar 20 microlitros de solución de TNCB al 1% en ambos lados del oído derecho, seguido de la aplicación de 100 microlitros de TNCB al 1% cada dos días durante un máximo de 10 días y la medición diaria del grosor del oído. Para medir la actividad de MMP in vivo, primero se debe hacer un vórtice suave con el tinte de imagen óptica activable y cargar una jeringa de insulina de 0,5 mililitros con dos nanomolares del tinte por ratón.

A continuación, equipe otra jeringa con una aguja de calibre 30 conectada a un catéter de polietileno y coloque la cola del primer ratón en agua tibia. Cuando las venas se hayan dilatado, inserte el catéter con el borde cortado de la aguja en un ángulo de 20 grados en el lado distal de la cola en una vena de cola dilatada y vuelva a suspender la jeringa para probar la colocación correcta del catéter. Si el catéter está colocado correctamente, reemplace la jeringa e inyecte dos nanomolares de la sonda.

A continuación, sustituya la jeringa de la sonda de imagen óptica por una jeringa que contenga solución salina al 0,9 % e inyecte 25 microlitros de solución salina en la vena de la cola para eliminar completamente el volumen muerto del tubo de polietileno. A continuación, configure la caja del escáner de imágenes del escáner óptico de imágenes a 37 grados centígrados y coloque hasta cinco ratones en la caja del escáner en el centro del campo de visión. 24 horas después de la inyección, abra el software de imágenes e inicialice el sistema, permitiendo que la cámara CCD se enfríe a la temperatura de trabajo.

Cuando el sistema esté listo, configure las longitudes de onda y los parámetros de imagen apropiados de acuerdo con la fluorescencia de la sonda de imagen. Aparecerá el panel de control de adquisición del sistema de imágenes in vivo. A continuación, haga clic en adquirir secuencia para iniciar la medición.

Para guardar las imágenes adquiridas, seleccione la ubicación de almacenamiento deseada. Además, se puede agregar más información en la ventana de edición de etiquetas de imagen. Aquí, nuestra señal fluorescente claramente mejorada se puede observar en las patas delanteras y los tobillos de ratones con artritis reumatoide en el sexto día después de la inducción de la enfermedad, en comparación con la señal mínima observada en los animales de control.

El análisis de la biodistribución de la actividad de MMP en los órganos de los animales de experimentación y control demuestra una señal fuertemente mejorada en los tobillos y las patas delanteras, exclusivamente en las articulaciones de los ratones con artritis reumatoide. Curiosamente, también se observó una señal de MMP mejorada en ambos riñones de los ratones con artritis reumatoide, mientras que el hígado y los intestinos demuestran una señal de MMP robusta independientemente de su estado de artritis reumatoide. Durante una reacción crónica de hipersensibilidad de contacto inducida por cinco desafíos de TNCB en el oído derecho, se exhibe una actividad de MMP altamente aumentada en el oído derecho inflamado en comparación con el oído de control izquierdo sano.

El análisis semicuantitativo de la intensidad de la señal de los tobillos o patas artríticas y sanas demuestra un aumento de siete veces en la intensidad de la señal MMP en los tobillos artríticos, con una intensidad de señal MMP tres veces mayor detectada en las patas delanteras en comparación con la de los animales sanos. Los oídos con reacción de hipersensibilidad de contacto aguda y crónica también exhiben una señal MMP significativamente aumentada incluso después de un solo desafío que permanece elevado a través del quinto desafío. Este método se puede implementar fácilmente en diferentes modelos animales experimentales y permite un seguimiento a largo plazo de los procesos biológicos subyacentes y las terapias in vivo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada sonda de imagen óptica tiene un procedimiento de inyección y un tiempo de absorción diferentes. Por lo tanto, se deben completar estudios longitudinales para cada nuevo tinte fluorescente y sonda de imagen óptica. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en hasta cinco animales en menos de 10 minutos si se realiza correctamente.

Este método es capaz de proporcionar información sobre los mecanismos in vivo de la inflamación, pero también se puede aplicar para investigar otras enfermedades como el cáncer o la neurodegeneración. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar las imágenes ópticas in vivo con una sonda de imagen activable en modelos de enfermedades inflamatorias.