Name: No invasiva En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprende a visualizar la actividad de metaloproteinasas de matriz en modelos de inflamación mediante sondas ópticas activables. Esta técnica permite estudiar mecanismos biológicos en vivo de forma rápida y económica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a Daniel Bukala, Natalie Altmeyer y Funda Cay por su excelente soporte técnico. Agradecemos a Jonathan Cotton, Greg Bowden y Paul Soubiran por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Werner Siemens-Fundación y la Facultad de Medicina de la Universidad Eberhard Karls de Tübingen (&#39;&#39; Promotionskolleg &#39;&#39;) y por el DFG a través de la CRC 156 (proyecto C3).

Todos los procedimientos descritos en este documento siguieron las directrices y estándares internacionales de cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Bienestar y Ética Animal de la Comisión Nacional de Tuebingen, Alemania. Se mantuvieron ratones BALB / c y C57BL / 6 de 8 - 12 semanas de edad en un ciclo de luz: oscuridad de 12 h: 12 h y se alojaron en IVCs y condiciones ambientales estandarizadas a 22 ± 1ºC en grupos de 2 - 5 con agua y Acceso al alimento ad libitum . 1. Preparación del material <ol><li> Diluir el colorante OI para la obtención de imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano de acuerdo con la hoja de datos respectiva directamente antes de la inyección. El colorante OI activable (sonda comercial con una excitación a 680 nm) para medir las MMP in vivo está listo para su uso a una concentración de 20 nmol en 1,5 ml 1x PBS. Agite suavemente o vórtice la solución antes de usarla. El colorante OI puede almacenarse a 2-8 ° C durante hasta 6 meses cuando está protegido de la luz. </li&gt; <li> Para la administración intravenosa (iv) las inyecciones se preparan de un catéter venoso. Use un 20 U (0,5 ml) jeringa de insulina lleno de solución salina al 0,9% (que contiene 10 unidades de inyección de heparina en 50 ml), y una aguja de calibre 30 unida a un catéter de polietileno. Inyectar la dosis recomendada de 2 nmol por ratón del colorante OI. </li></ol> 2. La inducción de la artritis reumatoide y la reacción de contacto hipersensibilidad crónica <ol><li> Artritis reumatoide: <ol><li> Diluir 100! L de suero (a base de ratones K / BxN 10) anticuerpos que contienen (AB) contra isomerasa de glucosa-6-fosfato (GPI) 1: 1 con 1x PBS (200 l) para inducir la RA. Almacenar el suero diluido a -80 ° C. Los procedimientos detallados para la inducción de la RA se describen por Monach et al. 8. </li><li> Para inducir la RA, levante cada ratón suavemente por la cola y se inyecta 200 l de la intraperitoneal suero diluido (ip) en el día 0 de tEl experimento Después de la inyección, coloque el ratón directamente en su jaula. </li><li> Opcionalmente, se miden los diámetros del tobillo de cada tobillo, antes de las inyecciones de AB y se define una &quot;puntuación artrítica&quot; ( Figura 1A ). Continuar midiendo la hinchazón del tobillo diariamente hasta el día 6 después del suero GPI usando un dispositivo de medición mecánico (micrómetro). </li><li> Inyectar el colorante OI activable (paso 1.1 - 1.2), para medir la actividad MMP in vivo iv en la vena de la cola de ratones RA Al día 5 después de la inyección de GPI-suero y en la vena de la cola de ratones de control. Realizar experimentos de imagen óptica 24 h después de la inyección de la vena de la cola. </li></ol></li><li> Reacción de hipersensibilidad de contacto: <ol><li> Para la sensibilización de ratones C57BL / 6, preparar una solución de TNCB al 5% disuelta en una mezcla 4: 1 de acetona / aceite. </li><li> Anestesiar los ratones C57BL / 6 usando isoflurano al 1,5% vaporizado en oxígeno al 100% (1,5 l / min). Una vez que los ratones son anestesiados, colóquelo en un loco<html> (Un corte de 5 ml de jeringa de polietileno, conectado al tubo de 1,5% en volumen de isoflurano) y mantener la anestesia. Aplique el ungüento del ojo del veterinario en los animales anestesiados para prevenir sequedad de los ojos mientras que anestesiado. </li><li> Afeitar el abdomen con cuidado (2 x 2 cm) usando un pequeño cortador de pelo animal. Evite dañar la piel, ya que esto puede llevar a señales fluorescentes inespecíficas dentro del animal y puede influir en los resultados del estudio. </li><li> Aplique lentamente 80 μL de la solución de TNCB al 5% en el área del abdomen afeitado usando una pipeta de 100 μl para sensibilizar al animal. Coloque el ratón suavemente de nuevo en su jaula teniendo cuidado de asegurar que los ojos del ratón no entrar en contacto con la ropa de cama para evitar lesiones de la córnea y evitar las bajas temperaturas del cuerpo durante la fase de recuperación. </li><li> Seis días después de la sensibilización, se prepara una solución de TNCB al 1% (disuelta en una mezcla 9: 1 de acetona / aceite) y se aplican 20 μl en la oreja derecha utilizando una pipeta para provocar CHSR aguda y crónica.&quot;&gt; 1 <ol><li> Comience con el desafío st 1 en ambos lados de la oreja derecha con 20 l de solución de TNCB 1% usando una pipeta de 100 l y repetir el reto cada segundo día hasta cinco veces (día 15 después de la sensibilización) para provocar CHR (Figura 1B) . Medir grosor de la oreja al día, utilizando un dispositivo de medición micrómetro. </li></ol></li><li> Inyectar el colorante OI activable (una sonda comercial con excitación a 680 nm) (etapa 1/1 a 1/2) para medir la actividad de MMP in vivo en ratones CHR 12 h después del desafío. Realizar experimentos de imagen 24 h después de la inyección en vena de cola óptica (iv). </li></ol></li></ol> 3. Preparación de los animales para Imaging óptico <ol><li> Chow Interruptor de ratón (al menos 3 días antes de imagen) a la baja o no de fluorescencia Chow (por ejemplo, libre de manganeso) para evitar la interferencia de auto-fluorescencia (alrededor de 700 nm) con la señal de fluorescencia de los agentes de OI utilizados. </li><li> Colocar el animal enA una caja de anestesia y anestesiar usando isoflurano al 1,5% en volumen vaporizado con oxígeno (1,5 l / min) (el oxígeno puede ser reemplazado por aire, pero necesita ser estandarizado dentro de un experimento). </li><li> Cuando el ratón está visiblemente anestesiado, colóquelo en un cono de nariz hecho a sí mismo (construido por una jeringa de polietileno de 5 ml cortada, conectada al tubo de isoflurano al 1,5% en volumen) y mantenga la anestesia. </li><li> Afeitar el animal cuidadosamente en el sitio de destino (2 cm x 2 cm) usando un pequeño cortador de pelo animal. Evite dañar la piel, ya que esto puede llevar a señales fluorescentes inespecíficas dentro del animal y puede influir en los resultados del estudio. NOTA: Los pelos pueden absorber la señal de fluorescencia durante OI (dependiendo de la cepa del ratón, se observa más o menos absorción) dependiendo de la región de interés (ROI). </li><li> Para la inyección intravenosa, coloque la cola del ratón en agua caliente, para inducir vasodilatación, limpie suavemente la piel en el lugar de la inyección con alcohol y comience colocando el catéter enel sitio distal de la cola. Colocar el &quot;corte&quot; borde de la aguja en, en un ángulo de 20 ° en la vena de la cola y probar la correcta colocación del catéter por la re-suspensión de la jeringa. </li><li> Si el catéter está colocado correctamente, sustituir la jeringa e inyectar la sonda OI (2 nmol). Después de la inyección, reemplazar la jeringa e inyectar 25 l de solución salina al 0,9% a totalmente claro el volumen muerto del tubo de polietileno. NOTA: El tejido tiempo de vida media del colorante OI utilizado (una sonda comercial con excitación a 680 nm) para medir la actividad de MMP in vivo es de 72 h. Para garantizar un juego completo, una re-inyección del colorante no se recomienda antes de 7 días después de una inyección previa. </li></ol> 4. imágenes ópticas <ol><li> Colocar un plástico negro o una hoja de papel en el cuadro negro de la OI-escáner en el centro del campo de visión (FOV). </li><li> Establecer un protocolo de medición y elegir la longitud de onda adecuada (excitación: 680 ± 10 nm y correoMisión: 700 ± 10 nm) y de imagen parámetros. NOTA: En algunos sistemas de OI, la configuración para varios colorantes de imagen es predefinido. </li><li> Para elegir el protocolo correcto para obtener imágenes de fluorescencia, abra el software de imagen (proporcionado por el fabricante) e inicializar el sistema. La mayoría de las cámaras CCD necesitan para enfriar a su temperatura de trabajo, y esto puede tomar 10 minutos. Para obtener resultados fiables, espere hasta que el sistema está listo. </li><li> Observe el vivo de imágenes panel de control de adquisición de sistema en Pop Up y cada par filtro seleccionado representará una imagen de la secuencia. En este caso, adquirir una imagen con los pares de filtros para el colorante comercial con y una excitación y de emisión de longitud de onda de 680 ± 10 nm y 700 ± 10 nm, respectivamente, y comenzar la medición (Pulse &quot;Adquirir secuencia&quot;). Para obtener instrucciones más detalladas, consulte el manual del fabricante. </li><li> Etiquetar las imágenes de manera adecuada y guardar la información en el &quot;Editar imagenEtiquetas&quot; ventana, que aparecerá después de la &#39;secuencia de Acquire&#39;. </li><li> Tome una exploración de referencia de cada animal antes de la inyección del colorante OI, o utilizar animales de control no tratados previamente para diferenciar la señal de fondo. </li><li> h después de la inyección en vena de cola del colorante OI, colocar los animales en el centro del FOV, en una posición para medir la señal más alta en el sistema de OI, y empezar las mediciones. NOTA: Importante: La hipotermia puede influir significativamente en la distribución de los agentes de imagen. Asegúrese de que la etapa se calienta hasta 37 ° C para evitar la hipotermia del animal. Imaging puede realizarse simultáneamente con los animales en grupos de 1 a 5 ratones. Seleccione el tamaño del campo de visión en función del número de animales para medir al mismo tiempo. Puede tomar una imagen de campo claro para comprobar si cada ratón es visible. </li></ol> Análisis 5. Datos NOTA: Realizar un análisis de los datos utilizando el software siguiente imagenel protocolo del fabricante. <ol><li> Para las mediciones de la AR, utilice la unidad de calibrado de la emisión de fotones como se muestra en la Figura 2, mientras que crónica CHSR se representa como intensidad de la señal en porcentaje (eficiencia). </li><li> Para dibujar regiones de interés de forma manual, utilice la placa de herramienta. Para el análisis de las imágenes con AR utilizar un círculo estandarizada, colocado alrededor de la señal más alta de todos los tobillos y las patas de cada animal. Para analizar la CISS, colocar las regiones de interés alrededor de todo el oído derecho y el izquierdo según la imagen de campo claro. </li><li> Para medir la emisión de fotones o señal de valores de intensidad en la ROI, pulse &quot;medida&quot; específica dibujada. El sistema proporcionará valores de la ROI dibujado para el análisis estadístico descriptivo. </li></ol>

<ol><li>Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathology+of+psoriasis+and+psoriatic+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis.</a> Ann Rheum Dis. 64, 26(2005).</li>
<li>Harris, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis.+Pathophysiology+and+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy.</a> N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).</li>
<li>Lee, D. M., Weinblatt, M. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11567728">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).</li>
<li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>Pap, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+pattern+of+membrane-type+matrix+metalloproteinases+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).</li>
<li>Firestein, G. S., Paine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromelysin+and+tissue+inhibitor+of+metalloproteinases+gene+expression+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium.</a> Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).</li>
<li>Schwenck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+detects+acute+and+chronic+contact+hypersensitivity+reactions+and+enables+monitoring+of+the+antiinflammatory+effects+of+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine.</a> Mol Imaging. 13, (2014).</li>
<li>Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+K%2FBxN+arthritis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">The K/BxN arthritis model.</a> Curr Protoc Immunol. 15, 22(2008).</li>
<li>Zelmer, A., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+fluorescence+imaging+of+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Noninvasive fluorescence imaging of small animals.</a> J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).</li>
<li>Kouskoff, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+disease+provoked+by+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity.</a> Cell. 87 (5), 811-822 (1996).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cell+proliferation+enables+the+detection+of+the+extent+of+experimental+rheumatoid+arthritis+by+3%27-deoxy-3%27-18f-fluorothymidine+and+small-animal+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET.</a> J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).</li>
<li>Schwenck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+Cerenkov+luminescence+imaging.+Applications+in+small+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nuklearmedizin%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research.</a> Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).</li>
<li>Mahling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+pO2+Probe+and+%5B18F%5D-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside+%28%5B18F%5DFAZA%29+PET+Study+Reveals+Anesthesia-Induced+Impairment+of+Oxygenation+and+Perfusion+in+Tumor+and+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle.</a> PLoS One. 10 (4), 0124665(2015).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+breathing+affects+3%27-deoxy-3%27-18F-fluorothymidine+uptake+in+mouse+models+of+arthritis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer.</a> J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthetics+on+3%27-%5B18F%5Dfluoro-3%27-deoxythymidine+%28%5B18F%5DFLT%29+uptake+in+animal+models+of+cancer+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation.</a> Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).</li>
<li>Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+imaging+for+evaluating+the+efficacy+of+edaravone+after+transient+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice.</a> Brain Res. 1397, 66-75 (2011).</li>
<li>Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+molecular+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+abdominal+aortic+aneurysms+correlates+with+treatment+effects+on+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate.</a> Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction.</a> Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).</li>
<li>Wallis de Vries, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Multispectral+near-infrared+fluorescence+molecular+imaging+of+matrix+metalloproteinases+in+a+human+carotid+plaque+using+a+matrix-degrading+metalloproteinase-sensitive+activatable+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe.</a> Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).</li>
<li>Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tumors+with+protease-activated+near-infrared+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes.</a> Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).</li>
<li>Cortez-Retamozo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+assessment+of+inflammation+and+treatment+response+in+a+mouse+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation.</a> J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).</li>
<li>McIntyre, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+fluorogenic+proteolytic+beacon+for+in+vivo+detection+and+imaging+of+tumour-associated+matrix+metalloproteinase-7+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity.</a> Biochem J. 377, 617-628 (2004).</li>
<li>Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+matrix+metalloproteinase-7+activity+in+vivo+using+a+proteolytic+nanobeacon%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon).</a> Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).</li>
<li>Olson, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+activatable+cell+penetrating+peptides+for+targeting+protease+activity+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer.</a> Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).</li>
<li>Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+targeting+of+MMP-2%2F9+activatable+cell-penetrating+imaging+probes+is+caused+by+tumor-independent+activation%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation).</a> J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).</li>
<li>Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-metalloproteinases+as+imaging+targets+for+inflammatory+activity+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques.</a> J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+18F-labelled+derivative+of+the+MMP+inhibitor+CGS+27023A+for+PET%3A+radiosynthesis+and+initial+small-animal+PET+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Radiat+Isot%22%5BJournal%5D)">A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies.</a> Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).</li>
<li>Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+fluorescence-labeled+MMP+inhibitor+to+image+tumor+MMP+activity+in+vivo+in+comparison+to+an+MMP-activatable+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe.</a> Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alarmin+S100A8%2FS100A9+as+a+biomarker+for+molecular+imaging+of+local+inflammatory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity.</a> Nat Commun. 5, 4593(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

OI es una herramienta muy útil, rápida y barata para la imaginería molecular in vivo no invasiva en la investigación preclínica. Una fuerza particular de OI es la capacidad de monitorear procesos altamente dinámicos como respuestas inflamatorias. Por otra parte, OI permite que uno siga el curso de una enfermedad por un período extenso de tiempo, extendiéndose de días a las semanas. OI tiene varias ventajas sobre otras modalidades de imagen in vivo, tales c...

Las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide (RA) o psoriasis vulgar se clasifican como de tipo retardado reacciones de hipersensibilidad (DTHRs). 1 RA es una enfermedad autoinmune común caracterizada por sinovitis erosiva y destrucción de las articulaciones. 2 articulaciones artríticas inflamadas demuestran la infiltración y proliferación de células inflamatorias, un aumento de la expresión de las células pro-inflamatorias que conducen a la formación de pannus, cartílago y destrucciones óseas. 3, 4 La escisión de moléculas de matriz extracelular, como el colágeno por metaloproteinasas de la matriz (MMPs), es esencial para la conversión de tejido y la angiogénesis y causa destrucciones tisulares. 5, 6 de contacto reacciones de hipersensibilidad (CHR) se caracterizan por la agregación de los neutrófilos que conduce a un estallido oxidativo. 7 De manera similar a la AR, las MMP en CHR son INVOLved en la conversión de tejido, la migración celular y la angiogénesis con el fin de establecer la inflamación crónica. Para investigar RA, se utilizó la isomerasa de glucosa-6-fosfato (GPI) de inyección -suero modelo de ratón. 8 El suero de los ratones K / BxN transgénicas que contienen anticuerpos contra GPI, se inyectó en ratones BALB / c tratados previamente después de lo cual la inflamación reumática comenzó a desarrollar dentro de las 24 h con un máximo de la hinchazón del tobillo en el día 6 después de la inyección GPI-suero (véase 1.1). Para analizar CHR crónica, C57BL / 6 ratones fueron sensibilizados con trinitroclorobenceno (TNCB) en el abdomen. La oreja derecha fue desafiado hasta 5 veces empezando 1 semana después de la sensibilización (véase también 1.1 y 1.2). No invasiva pequeña OI animal es una técnica basada en la investigación in vivo de fluorescent-, chemiluminescent- y bioluminiscentes señales, que se utilizan principalmente en la investigación preclínica. Los datos semi-cuantitativos adquirida da una visión de la Molecmecanismos Ular en los órganos y tejidos del saludables, así como modelos animales experimentales enfermas, y permite longitudinal seguimiento mediciones (por ejemplo, para evaluar los perfiles de respuesta terapéutica in vivo). Una gran ventaja de estudios longitudinales es la reducción del número de animales, como los mismos animales se pueden medir en los estudios de seguimiento en varios puntos de tiempo en lugar de utilizar diferentes ratones por punto de tiempo. La resolución de OI permite imágenes funcionales detalladas de los órganos y estructuras de tejido incluso más pequeños en animales de experimentación. El uso de filtros de excitación y emisión específicos con un espectro de transmisión estrecha, una protección contra la luz dispersada por una prueba de luz &quot;caja oscura&quot; y un dispositivo de carga acoplada sensible (CCD), que se enfría en muchos dispositivos hasta -70 ° C , permite altamente específica y mediciones sensibles de señales de fluorescencia. Mediante el uso de agentes fluorescentes con excitación-yLos espectros de emisión en la ventana de fluorescencia del infrarrojo cercano (650 - 950 nm), se pueden mejorar significativamente las relaciones señal / ruido. La ventana de fluorescencia del infrarrojo cercano se caracteriza por una absorción relativamente baja de la señal por la hemoglobina y el agua, así como por una baja fluorescencia de fondo. 9 Esto permite una profundidad de penetración de hasta 2 cm en el tejido de animales pequeños. Las sondas OI pueden dirigirse directamente a un objetivo ( por ejemplo, mediante un anticuerpo marcado con fluorescencia) o pueden activarse en el tejido diana ( por ejemplo, por proteasas). Las sondas OI activables son opticamente silenciosas en su forma inactivada debido a la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a un resto de extinción, que transfiere la energía de excitación dentro de la molécula a otro dominio. Si el colorante es escindido (por una proteasa, por ejemplo) la energía ya no se transfiere dentro de la molécula y una señal fluorescente puede ser detectada por OI. Esto permite el diseño de sondas OI con alta especificidadY para distintos procesos biológicos y excelentes relaciones señal / ruido. El siguiente protocolo explica en detalle la preparación de los animales, las mediciones de OI usando una sonda de OI Activable para visualizar la actividad de MMP-2, -3, -9 y -13 in vivo y dos modelos experimentales de inflamación (RA, CHR).

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>ungüento oftálmico&nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td> jeringa de <td>insulina de isoflurano</td></tr><tr><td>U40</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0,28 x 0,61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>tubo de polietileno, diámetro interior 0,28 mm, diámetro exterior 0,61&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>BD Agujas Biseladas Regulares, 30 G</td><td>Becton Dickinson & Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>cánula de inyección de 30 G</td></tr><tr><td>RTA-0011 Vaporizador de isoflurano</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC-Artagain</td> papel <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>dibujo</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td>negro carbón</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sistema óptico de imagen</td></tr><tr><td>BD Agujas biseladas regulares, 25 g</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-cloro-1,3,5-trinitrobenceno</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>colorante fluorescente para imágenes</td></tr><tr><td>Oditest&nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>medición mecánica</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL-Oil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BALB/C, C57BL/6</td><td>Laboratorios Charles River&nbsp;</td><td>-</td><td>Ratones utilizados para experimentos</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>Para la dilución del suero de AR&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta (100 &micro; L)</td> <td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>Utilizado para la aplicación TNCB &nbsp;</td></tr><tr><td>afeitadora&nbsp;</td><td>Wahl&nbsp;</td><td>9962</td><td>Recortadora de pelo de animales</td></tr><tr><td>Living Image&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td>Software de adquisición de imágenes para medir la OI</td></tr></tbody></table>

no invasiva<em&gt; en vivo</emhome idiomas ingresar a epistemonikos búsqueda avanzada fluorescencia de imágenes ópticas de la actividad mmp inflamatoria utilizando un agente de imagen fluorescente activable

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Este documento describe un método no invasivo para metaloproteinasas de la matriz de formación de imágenes (MMP) -Actividad por una sonda fluorescente activable, a través de fluorescencia in vivo de imágenes ópticas (OI), en dos modelos diferentes de ratón de inflamación: a la artritis reumatoide (RA) y un contacto reacción de hipersensibilidad (CHR) modelo. La luz con una longitud de onda en la ventana de infrarrojo cercano (NIR) (650 - 950 nm) permite una penetración más profunda del tejido y la absorción de la señal mínima en comparación con las longitudes de onda por debajo de 650 nm. Las principales ventajas utilizando fluorescencia OI es que es barato, rápido y fácil de implementar en diferentes modelos animales. sondas fluorescentes activables son ópticamente silenciosa en sus estados inactivados, pero se convierten en altamente fluorescente cuando es activado por una proteasa. MMP activadas conducen a la destrucción de tejidos y juegan un papel importante para la progresión de la enfermedad en las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTHRs) como la AR y CHR. Además, las MMPs sonLas proteasas clave para el cartílago y la degradación ósea y son inducidas por macrófagos, fibroblastos y condrocitos en respuesta a citoquinas pro-inflamatorias. Aquí se utiliza una sonda que se activa por la clave MMPs como MMP-2, -3, -9 y -13 y describir un protocolo de imagen para la fluorescencia infrarroja cercana OI de MMP actividad en la AR y el control de ratones 6 días después de la inducción de la enfermedad, así Como en ratones con reuma aguda (1x desafío) y crónica (5x desafío) en el oído derecho en comparación con oídos sanos.

Para inducir la artritis reumatoide (RA) en ratones BALB / c ingenuos, se inyectaron ip animales con autoanticuerpos (dilución 1: 1 con 1x PBS) frente a GPI el día 0. La inflamación máxima (hinchazón de tobillo) en este suero GPI inducido El modelo RA es el día 6 después de la inyección 11 . Por lo tanto, se prepararon 2 nmol del colorante OI activable e inyectaron iv en la vena de cola de ratones artríticos y animales de control sanos al día 5. ...

Este documento explica la aplicación de imagen fluorescente utilizando una sonda de formación de imágenes óptico activable para visualizar la actividad in vivo de las metaloproteinasas de matriz de teclas en dos modelos experimentales diferentes de inflamación.

No invasiva<em&gt; En Vivo</emHome Idiomas Ingresar a Epistemonikos Búsqueda avanzada Fluorescencia de imágenes ópticas de la actividad MMP inflamatoria utilizando un agente de imagen fluorescente activable

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar imágenes ópticas para visualizar una sonda activable que permita evaluar la actividad in vivo de metaloproteasas clave de la matriz, o MMP, en modelos experimentales de inflamación. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales sobre los mecanismos biológicos subyacentes en enfermedades inflamatorias. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, económica y fácil de aprender.Además, existe una gran variedad de sondas disponibles para dirigirse a diferentes procesos biológicos. Para la inducción de artritis reumatoide, primero utilice un micrómetro para medir todos los diámetros del tobillo de cada animal. A continuación, levante suavemente el primer ratón por la cola e inyecte por vía intraperitoneal 200 microlitros de suero diluido de ratón KBN que contiene anticuerpos contra la glucosa seis fosfato isomerasa o GPI.Luego, coloque el animal de nuevo en su jaula y mida la hinchazón del tobillo diariamente hasta el día seis. Para la sensibilización en la hipersensibilidad de contacto, utilice una máquina depiladora para pequeños animales para afeitar cuidadosamente un área de dos por dos centímetros del abdomen de un ratón anestesiado y use una pipeta de 100 microlitros para aplicar 80 microlitros de una solución fresca de TNCB al 5% sobre la piel expuesta. Es muy importante evitar lesionar la piel en cualquier momento del procedimiento, ya que esto puede provocar señales fluorescentes inespecíficas dentro del animal y puede afectar los resultados del estudio.Coloque suavemente al animal de vuelta en su jaula, evitando temperaturas corporales bajas durante la fase de recuperación. Seis días después, use una pipeta para aplicar 20 microlitros de solución de TNCB al 1 % en ambos lados de la oreja derecha, seguido de la aplicación de 100 microlitros de TNCB al 1 % cada dos días durante un máximo de 10 días y la medición diaria del grosor de la oreja. Para medir la actividad de MMP in vivo, primero agite suavemente con vórtex el colorante de imagen óptica activable y cargue una jeringa de insulina de 0,5 mililitros con dos nanomoles del colorante por ratón.Luego, prepare otra jeringa con una aguja de calibre 30 conectada a un catéter de polietileno y coloque la cola del primer ratón en agua tibia. Cuando las venas se hayan dilatado, inserte el catéter con el borde cortante de la aguja en un ángulo de 20 grados en el lado distal de la cola, dentro de una vena caudal dilatada, y vuelva a colocar la jeringa para comprobar la posición correcta del catéter. Si el catéter está adecuadamente colocado, sustituya la jeringa e inyecte dos nanomoles de la sonda.A continuación, reemplace la jeringa del sonda de imagen óptica con una jeringa que contenga solución salina al 0,9 % e inyecte 25 microlitros de solución salina en la vena de la cola para limpiar completamente el volumen muerto del tubo de polietileno. A continuación, ajuste la caja del escáner de imagen óptica a 37 grados celsius y coloque hasta cinco ratones en la caja del escáner en el centro del campo de visión. Veinticuatro horas después de la inyección, abra el software de imagen e inicialice el sistema, permitiendo que la cámara CCD se enfríe hasta la temperatura de trabajo.Cuando el sistema esté listo, configure las longitudes de onda y los parámetros de imagen adecuados según la fluorescencia de la sonda de imagen. Aparecerá el panel de control de adquisición del sistema de imagen in vivo. A continuación, haga clic en adquirir secuencia para comenzar la medición.Para guardar las imágenes adquiridas, seleccione la ubicación deseada para el guardado. Además, se puede agregar más información en la ventana de edición de etiquetas de imagen. Aquí se puede observar nuestra señal fluorescente claramente aumentada en las patas delanteras y tobillos de ratones con artritis reumatoide al sexto día después de la inducción de la enfermedad, en comparación con la señal mínima observada en los animales de control.El análisis de la distribución biológica de la actividad de MMP en órganos de animales experimentales y controles demuestra una señal fuertemente aumentada en los tobillos y patas delanteras, exclusivamente en las articulaciones de los ratones con artritis reumatoide. Curiosamente, también se observó una señal aumentada de MMP en ambos riñones de los ratones con artritis reumatoide, mientras que el hígado y los intestinos muestran una señal robusta de MMP independientemente del estado de artritis reumatoide. Durante una reacción de hipersensibilidad por contacto crónico inducida por cinco desafíos con TNCB en la oreja derecha, se exhibe una actividad de MMP altamente incrementada en la oreja inflamada derecha en comparación con la oreja izquierda, que sirve como control sano.El análisis semicuantitativo de la intensidad de la señal en tobillos o patas artríticos y sanos demuestra un aumento siete veces mayor en la intensidad de la señal de MMP en los tobillos artríticos, con una intensidad de señal de MMP tres veces más alta detectada en las patas delanteras en comparación con la de los animales sanos. Las orejas con reacción de hipersensibilidad por contacto aguda y crónica también muestran un aumento significativo en la señal de MMP, incluso después de un solo desafío, que permanece elevado hasta el quinto desafío. Este método puede implementarse fácilmente en diferentes modelos animales experimentales y permite un seguimiento a largo plazo de los procesos biológicos subyacentes y de las terapias in vivo.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada sonda de imagen óptica tiene un procedimiento de inyección y un tiempo de absorción diferentes. Por lo tanto, se deben realizar estudios longitudinales para cada nuevo colorante fluorescente y cada nueva sonda de imagen óptica. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en hasta cinco animales en menos de 10 minutos si se realiza adecuadamente.Este método puede proporcionar información sobre los mecanismos de inflamación in vivo, pero también puede aplicarse para investigar otras enfermedades como el cáncer o la neurodegeneración. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la imagen óptica in vivo con una sonda de imagen activable en modelos de enfermedades inflamatorias.

non-invasive-vivo-fluorescence-optical-imaging-inflammatory-mmp

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica para evaluar la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis utilizando tomografía mediada por fluorescencia (FMT). Al inducir colitis en un ratón a través del sulfato de sodio de dextrano (DSS), se inyectan al animal anticuerpos que reconocen el marcador de glicoproteína F4/80 en los macrófagos infiltrados en el colon. A continuación, se obtiene una imagen del ratón en un dispositivo FMT en el que las señales de fluorescencia y...

Uso de la tomografía mediada por fluorescencia para evaluar la inflamación intestinal murina

Se describe un método de imagen no invasiva para distinguir las fases inflamatorias. El suministro sistémico de luminol revela zonas de inflamación aguda que dependen de la actividad MPO en neutrófilos. En contraste, la inyección de lucigenina permite la visualización de la inflamación crónica dependiente de la actividad Phox en los macrófagos.

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

Se describe un multi-ángulo de rotación del sistema de formación de imágenes ópticas (Maroi) para la cuantificación in vivo de un marcador fluorescente emitido por saposina C (SAPC)-dioleilfosfatidil serina (DOPS) nanovesículas. El empleo de modelos de ratón de cáncer y la artritis, demostramos cómo el análisis de la curva de la señal de Maroi se puede utilizar para la cartografía precisa y caracterización biológica de los procesos de enfermedad.

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Mostramos una técnica para la bioluminiscencia in vivo en vivo y en el infrarrojo cercano de formación de imágenes de la neuritis óptica y la encefalitis en el modelo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) para la esclerosis múltiple en ratones SJL / J.

La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Aprende a visualizar la actividad de metaloproteinasas de matriz en modelos de inflamación mediante sondas ópticas activables. Esta técnica permite estudiar mecanismos biológicos en vivo de forma rápida y económica.

No invasiva

Explorar más videos