Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

El objetivo general de este procedimiento experimental es utilizar una nanopartícula basada en cristales líquidos como una plataforma de entrega para la liberación controlada de un dicargo hidrófobo en la porción lipofílica de la membrana plasmática de células mamíferas vivas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como cómo permitir eficientemente la entrega y la captación celular de cargas hidrófobas poco solubles en agua. La principal ventaja de esta técnica es que permite una entrega más específica de cargas hidrófobas dirigidas a la membrana, hacia la membrana plasmática, junto con una reducción de su citotoxicidad.

El procedimiento será demostrado por el Dr. Okhil Nag, un postdoctorado de mi laboratorio. Comience este procedimiento con la preparación de la nanopartícula de cristal líquido DiO según se describe en el protocolo escrito. Luego, agregue 20 microlitros de la solución de trabajo recién preparada de NHSS/EDC a 1,0 mililitro de la nanopartícula de cristal líquido DiO en tampón HEPES.

Y agite durante cinco minutos. A continuación, agregue 20 µL de una solución stock de colesterol PEG amina a esta mezcla y agite durante dos horas. Después de dos horas, centrifugue brevemente la mezcla de reacción a velocidad máxima durante 30 segundos utilizando una minicentrífuga de mesa.

Luego, pase el sobrenadante a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño PD 10 equilibrada con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Para confirmar la conjugación covalente exitosa del colesterol PEG en la superficie de la nanopartícula de cristal líquido DiO mediante electroforesis en gel, prepare un gel de agarosa según se describe en el protocolo escrito. Una vez que el gel haya solidificado, agregue suficiente tampón de corrida TBE para sumergir completamente el gel en la cámara.

Luego, agregue 35 microlitros de la muestra de nanopartículas de cristal líquido DiO a los pocillos del gel y corra durante 20 minutos a un voltaje de 110 voltios. Imagen el gel utilizando un sistema de imagen de geles con un filtro de excitación a 488 nanómetros y filtros de emisión de 500 a 550 nanómetros. Prepare platos de cultivo tisular de 35 milímetros de diámetro equipados con insertos de cubreobjetos número uno de 14 milímetros recubriéndolos con fibronectina bovina en DPBS durante dos horas a 37 grados Celsius.

Después de dos horas, retire la solución de recubrimiento de fibronectina del recipiente de cultivo. Recolecte las células HEK 293 T17 del matraz T25 lavando primero la monocapa celular con tres mililitros de DPBS y luego agregando dos mililitros de tripsina-EDTA. Incube el matraz a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres minutos.

Una vez que las células se han desprendido del frasco, neutralice la tripsina añadiendo cuatro mililitros de medio completo al frasco. Determine la concentración celular en la suspensión contando las células en un contador celular. A continuación, ajuste la concentración celular a aproximadamente 80.000 células por mililitro con medio de crecimiento.

Agregue tres mililitros de la suspensión celular al recipiente y cultive en el incubador durante la noche. Al día siguiente, las células deben tener una confluencia aproximada del 70 por ciento y estar listas para su uso. Una densidad celular adecuada es fundamental para una marcación eficaz y robusta de un alto porcentaje de células.

Prepare soluciones de un mililitro de DiO, nanopartícula de cristal líquido DiO y nanopartícula de cristal líquido DiO PEG colesterol en medio de entrega, diluyendo las soluciones stock correspondientes. Retire el medio de crecimiento de las placas de cultivo utilizando una pipeta serológica y lave las monocapas celulares dos veces con HEPES DMEM. Realice los lavados utilizando una pipeta para agregar suavemente HEPES DMEM al borde de las placas y luego elimine el medio.

Añada 0,2 mililitros de las soluciones preparadas de DiO libre o de nanopartículas de cristal líquido DiO al centro de las placas de cultivo. Luego, devuelva las placas al incubador durante un período de tiempo adecuado. Tiempos de incubación más largos provocan marcado celular inespecífico de áreas no membranosas.

Después del período de incubación, retire las soluciones de administración utilizando una pipeta serológica. Lave las monocapas celulares dos veces con DPBS usando dos mililitros para cada lavado. Fije las monocapas celulares utilizando paraformaldehído al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Elimine la solución de paraformaldehído utilizando una pipeta y lave suavemente las células una vez con dos mililitros de DPBS. Ahora las células fijadas están listas para ser observadas en busca de una señal fluorescente membranosa, utilizando microscopía confocal de barrido láser. En una platina de microscopio equipada con una cámara de incubación calentada, observe la muestra de células vivas mediante un microscopio confocal para evaluar la marcación de la membrana.

Si la adquisición de imágenes no se realiza inmediatamente, reemplace el medio con DPBS que contenga azida sódica al 0,05 por ciento y almacene las placas a cuatro grados centígrados. En este método, las células se colabelizan con DiO como donador de FRET y con DiI como aceptor de FRET. Etiquete las células secuencialmente con nanopartículas de cristal líquido DiO PEG colesterol y con DiI libre como antes.

Después de la tinción, lave las células una vez con dos mililitros de DPBS utilizando una pipeta serológica y reemplace con dos mililitros de la solución para imágenes de células vivas. En un microscopio equipado con una cámara de incubación calentada, observe la muestra de células vivas utilizando un microscopio confocal con imágenes de FRET. Configure el experimento con intervalos de 30 minutos durante un período de cuatro horas excitando al donador DiO a 488 nanómetros y recolectando los espectros completos de emisión tanto del donador DiO como del aceptor DiI desde 490 hasta 700 nanómetros, con un detector espectral de 32 canales.

Luego, determine la intensidad de emisión resuelta en el tiempo tanto del donador DiO como del aceptor DiI a partir de células teñidas con nanopartículas de cristal líquido DiO-PEG colesterol y DiI. Finalmente, calcule la relación FRET aceptor-donador resuelta en el tiempo para las imágenes según se describe en el protocolo del texto. El DiO libre se acumula de forma no específica en el interior celular, en lugar de en las membranas plasmáticas de las células que fueron contrateñidas con un fosfolípido de membrana marcado con dos colorantes.

Esto puede visualizarse con las imágenes fusionadas. Por el contrario, la nanopartícula de cristal líquido DiO con colesterol PEG marca específicamente solo la membrana plasmática de la célula, como se observa mediante colocalización con el fosfolípido de membrana marcado con dil. La transferencia de energía por resonancia (FRET) confirma la partición de DiO desde la nanopartícula de cristal líquido hacia la bicapa lipídica de la membrana, a través de un aumento observado en la transferencia de energía desde el donador DiO al aceptor DiI.

La transferencia de resonancia de energía de fluorescencia (FRET) entre DiO y DiI, así como los cambios en la emisión de DiO y DiI, confirman un aumento de FRET de DiO a DiI en función del tiempo. Las nanopartículas de PEG colesterol en cristal líquido de DiO muestran citotoxicidad mínima con una viabilidad del 90 por ciento, en comparación con la toxicidad significativa del DiO libre con una viabilidad de aproximadamente el 50 por ciento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar nanopartículas de cristal líquido cargadas con fármacos, biofuncionalizarlas para el direccionamiento celular e imaginar las células cargadas para lograr una entrega celular exitosa.

Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la entrega específica de DiO desde una solución acuosa a la membrana plasmática representa un desafío importante. Tuvimos la idea inicial de este método después de haber utilizado la plataforma de nanopartículas de cristal líquido para la entrega celular del fármaco anticancerígeno doxorubicina, y observamos su capacidad para modular la cinética de absorción celular del fármaco. Tras seguir este procedimiento, este enfoque puede implementarse para la entrega celular de una amplia variedad de cargas hidrófobas que plantean un desafío particular respecto a su administración a las células desde medios acuosos.

Este enfoque puede utilizarse para lograr una entrega más eficiente de fármacos dirigidos a la membrana y moléculas bioactivas, como colorantes sensibles al voltaje para la obtención de imágenes cerebrales, o fármacos fotodinámicos para la terapia asistida con fármacos fotónicos.