Name: Un Ex Vivo Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprende a cultivar mesenterio de rata para imagen time-lapse de redes microvasculares ex vivo. Este método permite evaluar interacciones de células endoteliales y efectos de fármacos antiangiogénicos en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención 5-P20GM103629 de los Institutos Nacionales de Salud a WLM y el Centro para el Envejecimiento de Tulane. Nos gustaría agradecer a Matthew Nice por su ayuda con la edición del texto del protocolo.

Todos los experimentos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tulane (IACUC). 1. Procedimiento de configuración quirúrgica <ol><li> instrumentos quirúrgicos, equipos de autoclave, y suministros de cultivo antes de la cirugía. suministros quirúrgicos para cada rata incluyen: 1 sábana, 1 sábana con orificio precortado (0,5 pulgadas x 1,5 pulgadas) en el centro, gasas, y 1 almohadilla inferior absorbente. Los instrumentos quirúrgicos incluyen: 1 escalpelo con una cuchilla de número 10, 2 pares de pinzas, y un par de tijeras finas. Los suministros de cultivo incluyen: 1 sábana, 1 par de pinzas, y se prepararon para placas de 6 pocillos con filtros de policarbonato. </li><li> Esterilizar una plataforma de plexiglás, una etapa quirúrgica y un espacio de mesa quirúrgica con 70% de etanol. Mantenga la etapa quirúrgica en un recipiente estéril hasta su uso. <ol><li> Crear una etapa quirúrgica mediante la perforación de una de aproximadamente 2 en por 1 en el agujero en el centro de una placa de cultivo de 100 mm. A continuación, utilice papel de lija para suavizarlos bordes afilados y añaden una capa de pegamento de silicona a los bordes del agujero para crear una superficie elevada para los tejidos. </li><li> Por otra parte, el diseño de la etapa quirúrgica utilizando software de CAD y hacer un 3-D de impresión (Figura 1). </li></ol></li><li> Coloque una almohadilla inferior absorbente estéril y extienda una plataforma de plexiglás en la parte superior de la misma. Coloque la sábana, sin un agujero pre-corte, a través de una almohadilla caliente al lado de la almohadilla inferior absorbente. </li><li> Pre-caliente solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), medios de comunicación y solución salina a 37 ° C. Coloque los medios de comunicación y PBS en placas de cultivo separadas encima de la resistencia de calentamiento y el lugar de solución salina en un tubo cónico de 50 ml al lado de la configuración quirúrgica. </li><li> Asegúrese de que todos los paquetes se abren antes del comienzo de la cirugía para asegurar una manipulación estéril de todos los materiales. Una lista completa de las herramientas comunes que se utilizan en este procedimiento se muestran en el Tabla de materiales quirúrgicos y herramientas específicas. </li></ol> 2. MesenterLa recolección de tejidos y <ol><li> Uso de adultos ratas Wistar machos (350 ± 25 g; 6 - 8 semanas de edad). Otras cepas y edades de las ratas pueden ser sustituidos. </li><li> Anestesiar la rata a través de una inyección intramuscular de ketamina (80 mg / kg de peso corporal) y xilazina (8 mg / kg de peso corporal). Confirmar la rata está bajo anestesia apretando entre los dedos para comprobar si hay una respuesta refleja; no debería haber ninguna. analgesia preventiva para este procedimiento terminal no es necesario. </li><li> Afeitarse la región abdominal y eliminar el vello restante usando crema de depilación. Limpiar la piel abdominal dos veces con alcohol isopropílico al 70%, seguido de povidona-yodo. Para las toallitas el cirujano debe comenzar en el centro de la zona quirúrgica y se mueven hacia el exterior de la zona preparada de una manera circular para no solapar zonas que han sido lavadas previamente con la misma pieza de gasa estéril o bastoncillo de algodón estéril. A continuación, traslado de los animales a la configuración quirúrgica estéril y colocar encima de la plataforma de plexiglásformar. </li><li> El uso de una hoja de bisturí, hacer un 0,75 en - 1,25 en la incisión en el intestino a partir del 1 de debajo del esternón. Tenga cuidado de no perforar el intestino o mesenterio (1 capa de la piel, 1 capa de tejido conectivo, y 1 capa de músculo). </li><li> Colocar una sábana con un agujero pre-corte sobre la incisión y colocar una etapa quirúrgica estéril encima de la cortina. Asegúrese de que los alinea con la apertura de la incisión. Utilizar bastoncillos de algodón estériles para localizar y extraer el íleon a través de la boca del escenario quirúrgico. </li><li> Tire de 6 - 8 ventanas mesentéricas a través de la fase usando bastoncillos de algodón, y tenga cuidado de no tocar las ventanas (Figura 1). Los tejidos se recogen típicamente de la región del íleon del intestino delgado comenzando cerca del ciego. Mantenga tejidos expuestos húmedo con solución salina estéril calentado según sea necesario con una jeringa estéril a gotear la solución. </li><li> La eutanasia a las ratas mediante la inyección intracardíaca de pentobarbital sódico (0,2 ml por rata). Antes de retirar misenteric ventanas, aseguran que la rata se sacrificó palpando el corazón; no debería haber ningún pulso. </li><li> Retire los tejidos mesenterio deseados mediante el uso de pinzas para agarrar la almohadilla de grasa y unas tijeras finas para cortar la ventana. Deja un borde de grasa (2 mm) alrededor de la ventana. Lavar los tejidos una vez en PBS estéril calentado y una vez en los medios de comunicación. </li><li> Volver íleon exteriorizada a la cavidad abdominal y disponer de animales de acuerdo con las directrices institucionales. </li></ol> 3. Mesenterio cultivo tisular para estudios con lapso de tiempo <ol><li> Transferencia de suministros de cultivo tratadas en autoclave (ver sección 1.1) y los tejidos a una campana de flujo laminar estéril. </li><li> Use pinzas para transferir cada tejido encima de una membrana de filtro de policarbonato. tejidos para discapacitados cerca de la almohadilla de grasa para evitar daños en el sistema vascular. </li><li> propagar rápidamente el tejido usando la almohadilla de grasa, teniendo cuidado de no tocar la ventana. Invertir el inserto con el tejido en la parte inferior de una placa de 6 pocillos y cubrir con 3 ml de medio (Figura 1 </strong&gt;). medios típicos utilizados para este procedimiento incluye medio esencial mínimo (MEM) con 1% de penicilina estreptomicina (PenStrep) y 10% de suero bovino fetal (FBS). Los medios pueden complementarse con otros sueros y / o factores de crecimiento para estimular la angiogénesis. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.3 para cada tejido y la cultura en condiciones estándar de la incubadora (5% CO2, 37 ° C) durante un máximo de 5 días. </li></ol> 4. Time-lapse de Mesenterio Tissue <ol><li> En el día de formación de imágenes, complementar los medios de comunicación en cada pocillo con conjugado BSI-lectina y se incuba bajo condiciones de cultivo estándar para 30 min. Lavar tejidos dos veces con medio libre de lectina. BSI-lectina mancha permanecerá visible en el tejido del mesenterio para un máximo de 3 días de cultivo. </li><li> La transferencia de la placa a una platina del microscopio. Identificar los vasos sanguíneos y linfáticos en función de su estructura de la morfología y de la red. </li><li> Localizar una región de red deseada en cada tejido y tomar imágenes. Tomar nota de la proyección de imagenubicación para garantizar la misma región será capturado por las imágenes subsiguientes. Si se utiliza una plataforma motorizada, documentar las coordenadas. </li><li> Devolver los tejidos a la incubadora y continuar con la cultura hasta el punto final deseado. Repita los pasos 4.1 a 4.3, según sea necesario en función de los puntos de tiempo experimentales deseados. </li></ol> 5. Tejido Immunolabeling <ol><li> Etiquetado BSI-lectina <ol><li> Incubar los tejidos durante 30 min a 37 ° C con 1:40 lectina conjugada con FITC en los medios (2,5 ml solución de anticuerpo por pocillo en placa de 6 pocillos), seguido de dos lavados con medios de comunicación. Para enjuagues, añadir medios y luego vuelva a colocar inmediatamente. </li></ol></li><li> Etiquetado Live / Dead <ol><li> Incubar los tejidos durante 10 min a 37 ° C con 1: 500 de etidio 2 mM homodímero-1 y 1: 500 1 mM de calceína AM en los medios (2,5 ml solución de anticuerpo por pocillo en placa de 6 pocillos), seguido de dos lavados con medios de comunicación. </li></ol></li><li> BSI-lectina / Etiquetado NG2 <ol><li> tejidos separadas en un microscopio deslizaronE (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa. </li><li> Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo primario incubar tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: anticuerpo policlonal de conejo y de NG2 100 5% de suero de cabra normal (NGS). Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo secundario se incuba tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 de cabra anti-conejo conjugado con CY2 anticuerpo (GAR-CY2) y 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min). </li><li> Incubar los tejidos durante 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina conjugada con FITC en PBS seguido de dos lavados con PBS. Para enjuagues, añadir PBS y luego reemplace inmediatamente. </li><li> Para montar las diapositivas, con cobertura de tejidos 50:50 PBS y solución de glicerol y el cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas. </li></ol></li><li> LYVE-1 / Etiquetado PECAM<ol><li> Difundir los tejidos en un portaobjetos de microscopio (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa. </li><li> Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo primario incubar tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: monoclonal biotinilado anticuerpo CD31 200 del ratón y 1: 100 de conejo policlonal LYVE-1 de anticuerpos en + 0,1% de saponina + 2% de albúmina de suero bovino PBS (BSA) + 5% NGS . Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo secundario, se incuban los tejidos durante 1 h a temperatura ambiente con 1: anticuerpo de estreptavidina 500 conjugado con Cy3 y 1: 100 GAR-CY2 en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para montar diapositivas, tejidos cubierta con 50:50 solución de PBS y glicerol y colocar un cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lectina de etiquetado <ol><li> Añadir 1 mg / ml de BrdU a los medios de comunicación y la sustitución de los medios de tejido con una solución de BrdU. Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Difundir los tejidos en un portaobjetos de microscopio (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa. </li><li> Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min). </li><li> Desnaturalizar el ADN de tejidos en HCl 2 M durante 1 hora a 37 ° C. Lavar los tejidos en PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para el marcaje del anticuerpo primario, se incuban los tejidos durante 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 de ratón monoclonal anti-BrdU en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo secundario, se incuban los tejidos durante 1 h a temperatura ambiente con 1: anticuerpo 100 de cabra anti-ratón conjugado con Cy3 (GAM-Cy3) en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li&gt; Incubar tejidos para 30 min a temperatura ambiente con una y cuarenta lectina conjugada con FITC en PBS seguido de dos lavados con PBS. </li><li> Para montar las diapositivas, los tejidos de la cubierta con PBS 50:50 y solución de glicerol y el cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas. </li></ol></li><li> BSI-lectina etiquetado / CD11b <ol><li> Difundir los tejidos en un portaobjetos de microscopio (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa. </li><li> Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo primario incubar tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 de ratón anti-rata CD11b en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para el etiquetado de anticuerpo secundario se incuba tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 GAM-Cy3 en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS+ 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Incubar los tejidos durante 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina conjugada con FITC en PBS seguido de dos lavados con PBS. </li><li> Para montar las diapositivas, los tejidos de la cubierta con PBS 50:50 y solución de glicerol y el cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo se documenta un método para utilizar el modelo de cultivo de mesenterio de rata como una herramienta ex vivo para time-lapse de crecimiento de la red microvascular. El trabajo previo en nuestro laboratorio ha establecido el uso de nuestro modelo para 1) la angiogénesis 8, 2) linfagiogénesis 8, 3) la interacción de células endoteliales de pericitos-8, y 4) las pruebas de drogas anti-angiogénico 9. La ca...

Crecimiento de la red microvascular y la remodelación son denominadores comunes para la función del tejido, cicatrización de heridas, y múltiples patologías y un proceso clave es la angiogénesis, que se define como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes 1, 2. Para la ingeniería de tejidos nuevos vasos o el diseño de terapias basadas angiogénicos, la comprensión de la importancia de la dinámica celulares implicados en la angiogénesis es crítica. Sin embargo, este proceso es complejo. Puede variar en lugares específicos dentro de una red microvascular y consiste en múltiples tipos de células (es decir, células endoteliales, células de músculo liso, pericitos, macrófagos, células madre) y sistemas múltiples (redes linfáticas y redes neuronales). Aunque los modelos in vitro han contribuido enormemente a examinar la relación entre las diferentes células implicadas en la angiogénesis 3, su relevancia fisiológica puede ser socavado debido a thei<html> r complejidad limitada y el hecho de que no reflejan estrechamente un escenario en vivo. Para superar estas limitaciones, los sistemas de cultivo tridimensional 3, ex vivo modelos tisulares 4, los sistemas de microfluidos 5, 6, 7 y modelos computacionales se han desarrollado e introducido en los últimos años. Sin embargo, todavía hay una necesidad de un modelo con capacidad de lapso de tiempo para investigar la angiogénesis en las redes microvasculares intactas ex vivo. El establecimiento de nuevos modelos de lapso de tiempo para los estudios de la angiogénesis con ese nivel de complejidad proporcionará una herramienta muy valiosa para comprender los mecanismos subyacentes que regulan la angiogénesis y para mejorar las terapias. Un posible modelo que permite la investigación ex vivo de la angiogénesis a través de una red microvascular intacto es el modelo de cultivo de mesenterio de rata&gt; 8. En un trabajo reciente, hemos demostrado que las redes microvasculares linfáticos sangre y permanecen viables después del cultivo. Más importante aún, el modelo de cultivo de mesenterio de rata se puede utilizar para investigar las interacciones funcionales de pericitos células endoteliales, la sangre y las conexiones de las células endoteliales linfáticas, y time-lapse. El objetivo de este trabajo es proporcionar a nuestro protocolo para el método de imagen de lapso de tiempo. Nuestros resultados representativos documentan los múltiples tipos de células que se mantienen viables después de la estimulación de la angiogénesis con suero y ofrecen ejemplos del uso de este método para la cuantificación de las respuestas angiogénicas específicos de tejido, así como estudios de seguimiento de células endoteliales.

<table><tbody><tr><td>Cortina</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12" x 12" Envolturas de esterilización regular Bio-Shield</td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Instrumento quirúrgico Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Mango de bisturí, # 3; Sólido; </td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica estéril de</td> 4" de longitud <td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>acero inoxidable; Plato de cultivo de tamaño 10</td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/</td></tr><tr><td>Pinza de Graefe de manguito (pinzas curvas)</td><td>Instrumento quirúrgico Roboz</td><td>RS-5135</td><td>Pinzas de microdisección; Dentado; Ligera curva; Ancho de la punta de 0,8 mm; </td></tr><tr><td>Pinza Graefe de 4" de longitud (pinzas rectas)</td><td>Instrumento quirúrgico Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Pinzas de microdisección; aserrado, recto; Ancho de la punta de 0,8 mm; 4" de longitud</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Disecting Spring Scissors; Puntas rectas, afiladas y romas; filo de corte de 13 mm; 0.25 mm Ancho de la punta, 4 1/2" de longitud total</td></tr><tr><td>Almohadillas de gasa</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Esponjas de gasa de algodón no estériles; 4" x 4" Aplicadores</td></tr><tr><td>de 12 capas con punta de algodón</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" de largo; Eje de madera; </td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td> de un solo uso <td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Fondo plano con tapa de baja evaporación; Poliestireno; </td></tr><tr><td>Jeringa estéril no pirogénica 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Sterile Bowl Medical</td><td>Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>Bolsa de cáscara de 32 oz; Azul; Insertos estériles</td></tr><tr><td>de placa de 6 pocillos de un solo uso (insertos CellCrown)</td>Insertos de placa de 6 pocillos <td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>; </td></tr><tr><td>membrana filtrante de policarbonato</td> no estéril <td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>filtro de membrana de isoporo; Policarbonato; Hidrofílico; 5.0&nbsp; y micro; m, 47 y nbsp; mm, Blanco Llano <</td></tr><tr><td>fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios/Descripción</fuerte></td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Pedido de MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Ingrediente activo: Por 100 mL, 390 mg de pentobarbital sodio, 50 mg de fenitoína sódica&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Fort Dodge Animal Health (Pedido de MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>LLOYD. Inc. (Pedido de MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Povidona</td><td>yodada Operando</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado por FITC Lectina</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Sulfato de condroitina Anticuerpo Proteoglicano</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Anticuerpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Anticuerpo</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo conjugado Cy2 anti-conejo de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo conjugado Cy3 anti-ratón de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo conjugado con estreptavidina Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidad/Citotoxicidad Vivo/Muerto Invitrogen</td><td></td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Desoxiuridina</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Monoclonal Anti-Bromodeoxyuridina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Clon Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>ratón anti-rata CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; ex vivo</em&gt; método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares redes

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

La angiogénesis, definida como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, implica células endoteliales, pericitos, células de músculo liso, células inmunes, y la coordinación con los vasos linfáticos y nervios. El multi-celda, las interacciones de múltiples sistemas requieren la investigación de la angiogénesis en un entorno fisiológicamente relevante. Por lo tanto, mientras que el uso de los modelos de cultivo celular in vitro han proporcionado ideas mecanicistas, una crítica frecuente es que no se recapitulan la complejidad asociada con una red microvascular. El objetivo de este protocolo es demostrar la capacidad de hacer comparaciones con lapso de tiempo de redes microvasculares intactas antes y después de la estimulación de la angiogénesis en los tejidos mesenterio de rata. tejidos cultivados contienen redes microvasculares que mantienen su jerarquía. marcaje inmunohistoquímico confirma la presencia de células endoteliales, células de músculo liso, pericitos, vasos sanguíneos y los vasos linfáticos. En unddition, el etiquetado de los tejidos con BSI-lectina permite la comparación de lapso de tiempo de las regiones locales de la red antes y después de la estimulación con suero o factor de crecimiento caracterizado por el aumento de la brotación y la densidad de los vasos capilares. En comparación con los modelos de cultivo celular comunes, este método proporciona una herramienta para estudios de linaje de células endoteliales y la evaluación de medicamentos angiogénico específico de tejido en las redes microvasculares fisiológicamente relevantes.

Después de 3 días de cultivo, los tejidos se marcaron con un kit de viabilidad / citotoxicidad en vivo / muerto para demostrar la viabilidad de la microvasculatura en el mesenterio de rata modelo de cultivo (Figura 2A). La mayoría de las células presentes en el mesenterio se mantuvo viable en la cultura en la que las células endoteliales fueron identificados en base a su ubicación en segmentos microvasculares. Proliferación de células endoteliales también se confirmó por...

Angiogénesis implica interacciones multicelulares y multisistémicas que necesitan ser investigadas en un entorno fisiológicamente relevante. El objetivo de este estudio es demostrar la capacidad del modelo de cultivo de mesenterio en rata para realizar comparaciones time-lapse de redes microvasculares intactas durante la angiogénesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

El objetivo general de este experimento es demostrar el uso del modelo de cultivo de mesenterio de rata para la investigación mediante imágenes de lapso de tiempo del remodelado de redes microvasculares ex vivo, con el fin de evaluar las interacciones entre parásitos y células endoteliales, las conexiones entre células endoteliales sanguíneas y linfáticas, o los efectos de fármacos antiangiogénicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del remodelado microvascular, como por ejemplo cómo saben las microvasculaturas dónde crecer, y cuál es el destino de los segmentos de células endoteliales. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden obtener imágenes de redes microvasculares reales e intactas antes y después del crecimiento ex vivo.El procedimiento será demostrado por Sadegh Azimi, un estudiante de posgrado en nuestro laboratorio quien desarrolló el método. Comience colocando una plataforma de plexiglás esterilizada con etanol sobre una almohadilla absorbente estéril y luego coloque encima una rata adulta macho anestesiada. Desinfecte la región abdominal afeitada de la rata con dos toallitas de alcohol isopropílico al 70%, seguido de povidona-yodo.Comenzando a una pulgada por debajo del esternón, use un bisturí para realizar una incisión de tres cuartos a una pulgada y un cuarto en el intestino a través de la piel, el tejido conectivo y el músculo. Luego, coloque un campo quirúrgico con un orificio previamente cortado sobre el animal y coloque una plataforma quirúrgica sobre el campo, teniendo cuidado de alinear los orificios de ambos materiales con la incisión. Utilizando aplicadores estériles con punta de algodón, extraiga el íleon a través de la abertura de la plataforma quirúrgica junto con seis a ocho ventanas mesentéricas.Utilice una jeringa estéril para gotear solución salina estéril a 37 grados Celsius sobre los tejidos expuestos según sea necesario. Cuando todas las ventanas hayan sido externalizadas, use pinzas para sujetar una almohadilla de grasa y tijeras para extraer las ventanas, dejando un margen de grasa de dos milímetros alrededor de cada tejido mesentérico. Tenga cuidado de que las pinzas no toquen las ventanas mesentéricas, tocando únicamente los márgenes grasos circundantes.Lave cada ventana una vez con PBS a 37 grados Celsius y una vez con medio a 37 grados Celsius conforme se recolectan. Devuelva el íleon a la cavidad abdominal después de que se hayan aislado todas las ventanas. En un flujo laminar estéril, use pinzas para transferir cada tejido mesentérico por el borde adiposo hacia la membrana de filtro de policarbonato de un inserto para placa de cultivo celular.Utilice el disco de grasa para extender rápidamente las muestras de tejido, teniendo cuidado de no tocar las ventanas. Luego, invierta el inserto y colóquelo en un pocillo de una placa de seis pocillos de manera que el tejido quede plano en el fondo del pocillo. Cubra el tejido con tres milímetros de medio y transfiera las ventanas restantes a la placa de la misma manera.A continuación, cultive las ventanas del mesenterio en condiciones estándar de incubadora para cultivo de tejidos durante hasta cinco días. El día del análisis por imagen, suplemente los cultivos con lectina BSI conjugada y regrese la placa a la incubadora. Después de 30 minutos, lave las muestras dos veces con medio sin lectina y transfiera la placa a la platina de un microscopio fluorescente.Identifique los vasos sanguíneos y linfáticos según su morfología y estructuras de red. Luego, localice una región de interés en la red de cada tejido para obtener imágenes, anotando la ubicación para asegurarse de que se capture la misma región en las imágenes posteriores. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, devuelva las muestras al incubador hasta la siguiente sesión de adquisición de imágenes o hasta el punto final experimental adecuado.Después de tres días en cultivo, la mayoría de las células presentes en el mesenterio son viables, y la presencia de células endoteliales se confirma por su ubicación en los segmentos microvasculares. La proliferación de células endoteliales también se puede confirmar mediante etiquetado con lectina/BrdU, mientras que la presencia de células musculares lisas y parásitos a lo largo de los vasos se puede confirmar con etiquetado NG2. La marcación de la red microvascular linfática y sanguínea ramificada confirma además el mantenimiento del fenotipo de células linfáticas en el tejido cultivado.La suplementación del medio de cultivo tisular de la ventana mesent&eacute;rica con suero al 10% durante tres d&iacute;as induce una respuesta angiog&eacute;nica robusta, con nuevos segmentos vasculares y brotes capilares identificados tras cinco d&iacute;as de estimulaci&oacute;n. La imagen por intervalos permite cuantificar el n&uacute;mero de vasos por &aacute;rea vascular y el n&uacute;mero de brotes capilares por &aacute;rea vascular a partir de una sola imagen de cuatro x por tejido. Las comparaciones por intervalos de regiones de la red tambi&eacute;n permiten el seguimiento de segmentos de c&eacute;lulas endoteliales y la identificaci&oacute;n de malformaciones en los vasos sangu&iacute;neos y linf&aacute;ticos.Además, la marcación con lectina y Cd11b confirma adicionalmente la presencia de macrófagos residentes intersticiales en las redes en remodelación. Una vez dominada, esta técnica debería poder completarse en menos de cuatro horas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cosechar, cultivar e imagenar con lapso de tiempo tejidos mesentéricos de rata.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método nuevo y versátil para la observación de la microcirculación se presenta. Se considera adecuado para observación a largo plazo, y para la combinación con intervenciones biológicas pharmacophysiological o molecular.

En vivo la micro-circulación de medición en el músculo esquelético de Intra-vital Microscopía

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Este artículo describe un modelo simple para estimular la angiogénesis en el mesenterio de rata. El modelo produce aumentos dramáticos en el brote capilar, área vascular y la densidad vascular durante un transcurso de tiempo relativamente corto en un tejido que permite la visualización en la cara de la totalidad de las redes microvasculares hasta el nivel de células individuales.

Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

La función de las células vasculares depende de la actividad de los mensajeros intracelulares.  Aquí se describe un método de imagen ex vivo de dos fotones que permite la medición de los niveles intracelulares de calcio y óxido nítrico en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos en células endoteliales y musculares lisas individuales de una aorta aislada.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

La técnica de Landis modificada permite la medición emparejada de la conductividad hidráulica de microvasos individuales en el mesenterio de ratas normales y modificadas genéticamente en condiciones de control y prueba utilizando técnicas de microperfusión. Proporciona un método conveniente para evaluar los mecanismos que regulan la permeabilidad de los microvasos y el intercambio transvascular en condiciones fisiológicas.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Este protocolo describe la imagen intravital de ratones transgénicos que expresaban marcadores fluorescentes específicos de la célula. La proyección de imagen intravital proporciona un método no invasivo para observaciones de alta resolución en animales vivos utilizando windows implantables a través del cual es posible la visualización microscópica de los procesos. Este método es especialmente útil para estudiar procesos longitudinales.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

En el presente protocolo, la función de barrera endotelial de la glándula submandibular (SMG) se evaluó inyectando diferentes trazadores fluorescentes ponderados molecularmente en las venas angulares de modelos animales de prueba in vivo bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones.

In vivo Detección de permeabilidad vascular en glándula submandibular de ratón

Este protocolo presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión mesentérica y visualizar trampas extracelulares (TNE) de neutrófilos en vénulas mesentéricas mediante microscopía intravital. El flujo sanguíneo en la arteria mesentérica superior se restringió durante 1 h, seguido de reperfusión, lo que permitió cuantificar directamente la adhesión leucocitaria y la NETosis.

Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en vénulas mesentéricas después de una lesión por isquemia-reperfusión mesentérica mediante microscopía intravital

Aprende a cultivar mesenterio de rata para imagen time-lapse de redes microvasculares ex vivo. Este método permite evaluar interacciones de células endoteliales y efectos de fármacos antiangiogénicos en tiempo real.

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