Name: QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a identificar genes de resistencia a fármacos en Toxoplasma gondii mediante mapeo QTL y edición CRISPR/Cas9. Este método combina secuenciación genómica y manipulación genética para estudiar mecanismos de resistencia a sinefungina.

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Agradecemos a L. David Sibley y Asis Khan por su contribución a la publicación original en la que se basan estos protocolos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorgar AI108721.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Estos protocolos presentan varios métodos que cuando se combinan permiten la identificación de un gen de resistencia a fármacos en T. gondii . Dos en particular eran parte integrante del proyecto, el método relativamente experimentado de mapeo QTL y el recientemente desarrollado método de edición de genes CRISPR / Cas9. Lander y Botstein publicaron su influyente artículo en 1989 demostrando el mapeo QTL que correlaciona loci genéticos con fenotipos [ 36] . Más recientemente, en 2012, Dounda y Charpentier describieron el sistema de edición CRISPR / Cas9 en Streptococcus pyogenes 22 que se adaptó rápidamente como una herramienta genética en muchos modelos diferentes, incluyendo T. gondii 13 , 17 . Ambos métodos fueron útiles aquí, donde la cartografía QTL define el locus que contiene la mutación de resistencia a los fármacos que se identificó en última instancia mediante la detección de SNP basada en WGS, y la edición de CRISPR / Cas9 me proporcionó<html> Ans para confirmar SNR1 es el gen de resistencia a fármacos sinefungina. El ME49-FUDR r X VAND-SNF r cruz 8 se desarrolló originalmente para interrogar un fenotipo de virulencia 19 , pero las cepas parentales también tuvieron una diferencia fenotípica adicional para la cual el gen causal no se conocía, resistencia a la sinefungina en el gen VAND. Esto pone de relieve un beneficio de los cruces en que pueden ser reutilizados cuando se observan diferencias fenotípicas adicionales en los padres. Este fue el caso de otra cruz Toxoplasma , tipo 2 x tipo 3, donde varios genes implicados en la virulencia se encontraron por la cartografía de múltiples fenotipos [ 37 , 38 , 39 , 40] . Hasta la fecha, se han descrito cuatro diferentes cruces de T. gondii para asignar genes responsables de los fenotiposSs = &quot;xref&quot;&gt; 8 , 37 , 41 , 42 , todos los cuales tienen el potencial de ser reutilizados para asignar nuevos fenotipos para los cuales la base genética es desconocida. En este sentido, los genomas de 62 T. gondii cepas que representan la conocida diversidad genética mundial se han secuenciado [ 43] . Podrían hacerse nuevas cruces de este grupo para las cepas que difieren en fenotipos interesantes. Habiendo alabado las ventajas de la cartografía QTL, hay que decir que la generación de una cruz no es una empresa menor. Existen otros métodos que pueden usarse para identificar genes causales. Una técnica potente utiliza la mutagénesis química para crear mutantes que pueden ser seleccionados para detectar fenotipos. Para encontrar el gen causal, los mutantes pueden ser complementados con bibliotecas de cósmidos [ 44] o métodos de resecuenciación del genoma se puede utilizar para encontrar la mutación causal [ 45] . Para moRe sobre esto, ver dos artículos de JoVE por Coleman et al. Y Walwyn et al. Que describen estos enfoques 46 , 47 . Muchas de las etapas que conducen a la identificación de la mutación causal SNF r (Protocolos 2 y 3) se basan en métodos computacionales realizados con software que está libremente disponible para uso académico. Se proporcionan comandos detallados para cada paso y cuando se ejecutan con los archivos adecuados permitirá al usuario volver a crear los conjuntos de datos necesarios para encontrar SNF SNP causal. Tenga en cuenta que algunos de la sintaxis en los comandos se refieren a los nombres de archivo o estructura de directorios ($ PATH) que se pueden modificar a la preferencia del usuario. Aunque los comandos dados aquí ciertamente no agotan las formas en que se puede analizar una cruz con análisis QTL y la identificación SNP basada en WGS, son lo suficientemente amplias para repetir el experimento descrito en este artículo y deberían permitir al usuario convertirse en m<html> Familiarizarse con cómo estos enfoques se utilizan de una manera paso a paso. Aunque la cartografía QTL y WGS secuencia basada en la detección de SNP fueron suficientes para identificar un candidato SNF r gen, experimentos adicionales son necesarios para confirmar su papel en la resistencia a los medicamentos. Esto puede ser demostrado de manera convincente a través de la interrupción génica o knockout técnicas, ambos de los cuales se puede lograr utilizando CRISPR / Cas9 edición de genes. Se proporcionan métodos detallados para usar CRISPR / Cas9 para generar mutaciones indel o insertar constructos transgénicos en un gen diana en T. gondii . La especificidad de direccionamiento que CRISPR / Cas9 proporciona aumenta la eficacia de la edición de genes sobre los métodos tradicionales. Además, este aumento eficientemente ha hecho posible utilizar cepas no adaptadas para estudios genéticos que antes eran difíciles de modificar 13 . Aunque en su infancia, CRISPR / Cas9 ya se ha utilizado para hacer interrupciones de genes, Y hacen los knockouts de genes 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 en T. gondii , lo que promete ser una herramienta útil Para muchos otros estudios en el futuro. El descubrimiento de que la inactivación de SNR1 conduce a la resistencia a la sinefungina hace que el locus SNR1 sea un sitio prometedor para la inserción de transgenes o la complementación genética. Para maximizar el éxito del uso de la orientación de genes mediados por CRISPR / Cas9 para dirigir la integración del transgén en el locus SNR1 , deben tenerse en cuenta los siguientes aspectosRojo durante el diseño experimental. En primer lugar, se recomienda incluir un marcador de selección en la construcción transgénica para aumentar la eficiencia de la construcción de deformación. Si se incluye un marcador de selección, se pueden usar tanto la selección positiva como la negativa, resultando que casi el 100% de los parásitos doblemente seleccionados son transgénicos con el GOI integrado en el locus SNR1 . Por el contrario, si la construcción transgénica no contiene rasgos seleccionables adicionales y se basa en la selección negativa en el locus SNR1 , la eficacia de la transgénesis satisfactoria depende en gran medida de la eficacia de la cotransfección del plásmido CRISPR y la construcción transgénica. En segundo lugar, aunque la integración de un fragmento de ADN no homólogo mediada por CRISPR / Cas9 se utiliza frecuentemente para la complementación y la transgénesis, debe observarse que la orientación de la inserción no puede garantizarse en estos casos ya que es posible cualquier dirección. Esto puede plantear problemasMs para algunas aplicaciones. Por ejemplo, para complementar un mutante con diferentes alelos génicos, es difícil asegurar que todos los alelos se insertan en la misma orientación, y las discrepancias en la orientación pueden causar diferencias de expresión. Para este tipo de aplicación, se recomiendan construcciones de ADN con secuencias homólogas al locus SNR1 , lo que impulsará la orientación de integración adecuada ( Figura 6 ). Tercero, durante la transfección, la relación entre el plásmido CRISPR y la molécula de ADN transgénico es crítica para la construcción de la tensión transgénica exitosa. Esta relación debe ajustarse de acuerdo con las estrategias de selección. Se recomiendan las siguientes directrices: 1) Si la construcción transgénica contiene un marcador resistente a los fármacos y el fármaco correspondiente es la única selección utilizada para generar parásitos transgénicos, es decir , no se utiliza la sinefungina, la relación molar sugerida entre la construcción transgénica y el plasma CRISPRId es 1: 5. El uso de más plásmido CRISPR en este caso aumenta la probabilidad de que los parásitos que reciben la construcción transgénica también recibirán el plásmido CRISPR, por lo tanto los parásitos resistentes a los fármacos tienen más probabilidades de tener el marcador insertado en el sitio de selección de CRISPR. Si la proporción se invierte, la mayoría de los parásitos que reciben la construcción transgénica no obtendrán el plásmido CRISPR. Como consecuencia, la gran mayoría de los parásitos resistentes a los fármacos obtienen la construcción transgénica mediante una integración aleatoria no asociada con la inserción específica del sitio mediada por CRISPR / CAS9. 2) Si la construcción transgénica contiene un marcador resistente a fármacos y el fármaco correspondiente se usa junto con la sinefungina para seleccionar parásitos transgénicos, la relación molar sugerida entre la construcción transgénica y el plásmido CRISPR es de 1: 1. Esta estrategia proporciona la mayor eficiencia de la construcción de deformación transgénica. 3) Si la construcción transgénica no contiene un fabricante seleccionable, dependiendo de la selección negativaPor sinefungin sola para obtener parásitos transgénicos, la relación molar sugerida entre la construcción transgénica y el plásmido CRISPR es 5: 1. La justificación para este diseño es la misma que en la primera directriz anterior. Puesto que tanto la pirimetamina como la sinefungina se usaron para la selección en el Protocolo 5, la relación entre el gen mini DHFR * y el plásmido CRISPR dirigido por SNR1 se estableció como 1: 1. En conjunto, los métodos descritos aquí tienen un nivel de detalle que no fue posible transmitir en la publicación original que identificó SNR1 2 . Estos protocolos; Específicamente, la sintaxis de la línea de comandos, el diseño secuencial de los programas utilizados y el uso de CRISPR / Cas9 deberían ayudar a futuros esfuerzos para identificar nuevos genes responsables de los fenotipos.

La gama de huéspedes determina la extensión de la prevalencia de un parásito. Algunos parásitos tienen requisitos muy específicos del anfitrión que limitan el área de la cual se encuentran, otros son generalistas. Uno de estos generalistas es Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Este parásito se encuentra en todo el mundo, ya que puede infectar a todos los mamíferos y muchas aves. Los seres humanos también son susceptibles y se estima que aproximadamente 1/3 de la población mundial ha sido infectada. Afortunadamente, una respuesta inmune robusta normalmente controla el crecimiento del parásito, pero en situaciones donde el sistema inmune está comprometido, el parásito puede crecer sin control y causar enfermedades, a menudo encefálico. Además, este parásito puede causar enfermedades congénitas si las mujeres previamente no infectadas se infectan durante el embarazo ya que carecen de memoria inmune para limitar rápidamente la propagación del parásito. Además, hay una carga de toxoplasmosis ocular que puede resultar en pérdida de la visión 1 . Por estas razonesNs T. gondii se ha convertido en un foco de estudio, y debido a los muchos métodos moleculares desarrollados para su estudio, un modelo para los parásitos Apicomplexan. Dos métodos que se discutirán aquí son el mapeo de locus de rasgo cuantitativo (QTL) y el clúster de repetición de palindrómicos cortos regularmente intercalados (CRISPR) / edición de genes Cas9. La cartografía QTL y la edición CRISPR / Cas9 son, respectivamente, enfoques genéticos directos e inversos que se han utilizado en estudios previos para identificar y / o caracterizar genes de virulencia de T. gondii . Aquí, estos métodos se combinan para identificar y confirmar la función de un gen de resistencia a la sinefungina (SNF r ), TgME49_290860, y sus orthologs (anotado como SNR1 ) 2 . Aunque T. gondii puede infectar una amplia variedad de huéspedes intermedios, debe pasar a través e infectar las células epiteliales intestinales de un felino para completar el ciclo de vida. Los gatos son los anfitriones definitivos del parásito donde el sSe producen etapas exuales y se produce la recombinación genética a través de la meiosis. Para llevar a cabo un estudio QTL se debe crear una cruz genética y en el caso de Toxoplasma esto significa pasar dos cepas parásitas diferentes que difieren en un rasgo fenotípico, las manchas parentales, a través de un gato para producir progenie recombinante 3 . Antes de ser alimentados a gatos, las cepas parentales se hacen resistentes a fármacos separados para permitir una identificación más eficaz de recombinantes por selección de doble fármaco de la progenie 4 . Para ello se han utilizado tres fármacos en T. gondii ; Fluorodeoxirribosa (FUDR) para la cual la uracilo fosforribosil transferasa ( UPRT ) es el gen de resistencia 5 , adenosina arabinósido (ARA) para el cual la adenosina quinasa ( AK ) es el gen de resistencia 6 y la sinefungina (SNF) para la cual el gen de resistencia era desconocido 7 . Varios cruces genéticos han sidoCreado para T. gondii , pero sólo la progenie 24 de la ME49-FUDR r X VAND-SNF r cruz fueron genotipados utilizando secuenciación del genoma total (WGS) [ 8] . Esto abrió la posibilidad de cartografiar e identificar el gen de resistencia a SNF usando este cruce como el padre VAND se hizo resistente a sinefungina por mutagénesis química de la cepa VAND (VAND-SNFs) sensible a fármacos y el genoma de referencia VAND se secuenció usando el VAND- SNF s permitiendo así la identificación de todos los polimorfismos entre la progenie WGS y el VAND-SNF s genoma de referencia, incluyendo la hereditaria parental VAND-SNF r mutación que hizo que algunos de los progenie sinefungina resistente. Con el fin de identificar el polimorfismo causal de un solo nucleótido (SNP) en la progenie SNF r , varios recursos de código abierto basados ​​en computación se pueden utilizar para analizar los datos. Para crear el mapa genético para el ME49-Se desarrolló la suite de software REDHORSE 9 que utiliza alineaciones WGS de los padres y progenie para detectar con precisión las posiciones genómicas de los cruces genéticos. Esta información de mapeo se puede combinar entonces con los datos fenotípicos (SNF r en la progenie) para dar formato a un conjunto de datos compatible con el paquete &#39;qtl&#39; 10 en el software de programación de estadística R donde puede realizarse una exploración QTL para revelar loci significativos correlacionados con el Fenotipo Para identificar el SNP causal localizado dentro del locus QTL, las lecturas WGS de la progenie pueden alinearse individualmente con el genoma VAND sensible a sinefunggin utilizando el programa de alineación Bowtie 2 11 desde el cual se pueden llamar SNPs usando el programa llamador Variscan mpileup2snp variante 12 . Usando estos SNPs, el locus QTL puede ser escaneado para polimorfismos que están presentes en el SNF r, pero noEn la progenie del SNF. Con el SNP causal identificado en la región codificadora de un gen, la modificación genética del gen candidato SNF r puede realizarse en una cepa de SNF para verificar la función de resistencia a fármacos. El sistema de edición del genoma CRISPR / Cas9 se estableció recientemente en Toxoplasma 13 , que agregó importantes herramientas para la exploración de la biología compleja de este parásito, en particular para estudios genéticos en cepas no adaptadas al laboratorio. Debido a la altamente activa No Homologous End Joining (NHEJ) en las células WT Toxoplasma , modificación del genoma dirigida es difícil de lograr desde introducido exógenamente DNA se integra al azar al genoma a una frecuencia extremadamente alta [ 14] . Para aumentar la tasa de éxito de la modificación específica de locus, se han empleado diferentes enfoques para aumentar la eficacia de la recombinación homóloga y / o disminuirE Actividad NHEJ 15 , 16 . Uno de estos enfoques es el sistema CRISPR / Cas9. Comparado con otros métodos, el sistema CRISPR / Cas9 es eficiente en la introducción de modificaciones específicas del sitio y es fácil de diseñar 13 , 17 , 18 . Además, puede utilizarse en cualquier cepa de Toxoplasma sin modificación adicional al parásito 13 , 19 . El sistema CRISPR / Cas9 se originó del sistema inmune adaptativo de Streptococcus pyogenes , que lo utiliza para defender la invasión de elementos genéticos móviles como los fagos 20 , 21 , 22 . Este sistema utiliza la enzima de endonucleasa de ADN guiada por ARN Cas9 para introducir la rotura de ADN de doble hebra (DSB) en el blanco, que posteriormente se recuperaYa sea por el error propensos NHEJ para inactivar los genes objetivo a través de cortas indel mutaciones, o por homología dirigida a la recombinación de alterar el lugar de destino exactamente como se ha diseñado [ 23 , 24] . La especificidad objetivo se determina mediante una molécula de ARN pequeña denominada ARN guía simple (ARNg), que contiene una secuencia de 20 nt individualmente diseñada que tiene una homología del 100% con el ADN diana 22 . La molécula de gRNA también contiene firmas reconocidas por Cas9 que guían la nuclease al sitio diana, que incluye un Motivo Adyacente Protospacer (PAM, secuencia es &#39;NGG&#39;) 25 , 26 . Por lo tanto, la molécula de gRNA y la secuencia PAM trabajan conjuntamente para determinar el sitio de escisión Cas9 en el genoma. Uno puede cambiar fácilmente la secuencia de gRNA para dirigirse a sitios diferentes para la escisión. Cuando el sistema CRISPR / Cas9 se desarrolló por primera vez en ToxopLasma, se usó un único plásmido que expresaba la nucleasa Cas9 y la molécula de ARNg para introducir DSB en el sitio de orientación 13 , 17 . Se ha demostrado que el CRISPR / Cas9 sistema aumenta drásticamente la eficiencia de sitio específico de la modificación del genoma, no sólo por la recombinación homóloga, sino también la integración no homóloga de ADN exógeno [ 13] . Lo hace en cepas de tipo salvaje que contienen actividad NHEJ. Por lo tanto, este sistema se puede utilizar en esencialmente cualquier cepa de Toxoplasma para la edición eficiente del genoma. En un experimento típico, el plásmido CRISPR específico para el objetivo y el fragmento de ADN usado para modificar el objetivo se cotransfectan en parásitos. Si el fragmento de ADN utilizado para modificar el objetivo contiene secuencias homólogas al locus diana, se puede usar la recombinación homóloga para reparar el DSB introducido por CRISPR / Cas9 para permitir la modificación precisa del objetivo. Por otro lado, si el intEl fragmento de ADN roduced no contiene la secuencia homóloga, todavía puede ser integrado en el sitio que apunta CRISPR / Cas9. Este último se utiliza a menudo para interrumpir los genes mediante la inserción de marcadores seleccionables o para complementar mutantes en loci que permiten la selección negativa [ 13] . Aquí el locus SNR1 sirve como un ejemplo para mostrar cómo CRISPR / Cas9 puede ser utilizado para la interrupción de genes y la generación de parásitos transgénicos.

<table><tbody><tr><td>Matraces T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos de prepucio humano (HFF)</td><td></td><td>ATCC SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>T. gondii ME49 cepa</td><td>ATCC</td><td>50840</td><td></td></tr><tr><td>T. gondiiVAND cepa</td><td>ATCC</td><td>PRA-344</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (bicarbonato sin sodio)</td><td>Ciencias de la Vida</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS) de primera calidad</td><td>VWR International</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp; 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (10 mg/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>15710064</tr><tr><td>Rascador de células para matraces</td><td>VWR International</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Agujas romas 22 G x 1"</td><td>Productos BRICO</td><td>BN2210</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de nucleporos 3.0 y micro; m, 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>110612</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Portafiltros 25 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>420200</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Propper MFG</td><td>90001</td><td></td></tr><tr><td>Sinefungin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-070-M001</td><td></td></tr><tr><td>R&nbsp;</td><td>La Fundación R</td><td>https://www.r-project.org/</td><td></td></tr> <tr><td>J/qtl</td><td>El Grupo Churchill</td><td>http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2</td><td>Universidad John Hopkins</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td></tr><tr><td>NCBI SRA Toolkit</td><td>NCBI</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>VarScan</td><td>Universidad de Washington, San Luis</td><td>http://varscan.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>MUMmer</td><td>JCVI & Univ Hamburg</td><td>http://mummer.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT</td><td></td><td>Plásmido Addgene #54467</td><td>T. gondii Plásmido CRISPR para cortar el gen UPRT</td></tr><tr><td>pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6</td><td>Addgene</td><td>Plásmido #59855</td><td>T. gondii plásmido CRISPR para cortar el gen TG*_290860 SNR1</td></tr><tr><td>pUPRT::D HFR-D</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #58528</td><td>Plantilla para DHFR* mini gen</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E0552S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatión (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema de electroporación</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación&nbsp; 4 mm</td><td>Aparato Harvard</td><td>45-0126</td><td></td></tr><tr><td>Crytal Violeta</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21932-14</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondo de 12 mm</td><td>VWR International</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>Placa TC de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>353075</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit (multifragmento)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td> Pirimetamina TCI AMERICA P2037-1G Use cuation cuando use parásitos <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>resistentes a la pirimetamina - ver Protocolo</td></tr></tbody></table>

qtl mapping y crispr / cas9 edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; toxoplasma gondii</em

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

El conocimiento científico está intrínsecamente ligado a las tecnologías y métodos disponibles. Este artículo presentará dos métodos que permitieron la identificación y verificación de un gen de resistencia a fármacos en el parásito de Apicomplexan Toxoplasma gondii , el método de cartografía de Locus de Rasgo Cuantitativo (QTL) usando un mapa genético basado en la secuencia de Genoma Entero (WGS) y el método De Clustered Regularmente Interspaced Palindromic Corto Repeticiones (CRISPR) / Cas9-basado en la edición de genes. El enfoque de mapeo QTL permite a uno para probar si hay una correlación entre una región genómica (s) y un fenotipo. Dos conjuntos de datos se requieren para ejecutar una exploración QTL, un mapa genético basado en la progenie de una cruz recombinante y un fenotipo cuantificable evaluado en cada uno de la progenie de esa cruz. Estos conjuntos de datos se formatean a continuación para ser compatibles con el software R / qtl que genera una exploración QTL para identificar loci significativo correlacionado con el fenotipo. Aunque esto puede reducir en gran medida la búsqueda wIndow de posibles candidatos, QTLs span regiones que contienen una serie de genes de los que el gen causal necesita ser identificado. Tener WGS de la progenie fue fundamental para identificar la mutación causal de la resistencia a los fármacos en el nivel del gen. Una vez identificado, la mutación candidata puede ser verificada mediante manipulación genética de parásitos sensibles a fármacos. El método más fácil y eficiente para modificar genéticamente a T. gondii es el sistema CRISPR / Cas9. Este sistema comprendía sólo 2 componentes codificados en un solo plásmido, un solo ARN guía (gRNA) que contenía una secuencia de 20 pb complementaria a la diana genómica y la endonucleasa Cas9 que genera una ruptura de ADN de doble hebra (DSB) en el blanco, Cuya reparación permite la inserción o deleción de secuencias alrededor del sitio de rotura. Este artículo provee protocolos detallados para usar las herramientas de edición de genomas basadas en CRISPR / Cas9 para verificar el gen responsable de la resistencia a la sinefungina y para construir parásitos transgénicos.

En este artículo se describen en detalle varios métodos que pueden utilizarse sucesivamente para identificar un gen responsable de la resistencia a fármacos ( Figura 1 ). La progenie 24 de la ME49-FUDR r X VAND-SNF r se evaluó la resistencia al fármaco sinefungina, tal como se describe en el Protocolo 1. Usando el mapa genético y el SNF r fenotipo de la progenie, se realizó una exploración QTL en R / Qtl - Protocolo 2 ( Figura 2 ). Esto resultó en un pico significativo en el cromosoma IX que abarca aproximadamente 1 Mbp. Es en esta región donde se localiza la mutación causal. Para identificar la mutación causal, las lecturas de WGS de la progenie se alinearon con el genoma de referencia de VAND-SNF utilizando Bowtie2 - Protocolo 3.1, se usaron SNPs usando VarScan mpileup2snp - Protocolo 3.2 y se identificó el locus QTL en el genoma de VAND usando MUMmer - ProtocOl 3.3. Progeny SNPs dentro de la QTL locus fueron extraídos y escaneados para un patrón donde el SNF r progeny tienen un SNP y el SNF s no, lo que es factible porque la progenie SNPs se obtuvieron por comparación con el VAND-SNF s genoma de referencia ( Figura 3 ] . Sólo un SNP coincide con este patrón que resulta en un codón de parada temprana en un gen portador de aminoácidos putativo llamado SNR1 . La confirmación de que SNR1 es el SNF r gen de resistencia se realizó utilizando el sistema CRISPR / Cas9. Se preparó un nuevo plásmido CRISPR / Cas9 diseñado para la edición del gen de T. gondii que contenía un gRNA dirigido al gen SNR1 cerca de la mutación SNF r identificada en la progenie - Protocolo 4 ( Figura 4A ). El SNR1 dirigida CRISPR / Cas9 plásmido fue electroporated en un SNF s WT parásito cepa y resistente mutantes se obtuvieron cuando el cultoDe sinefungina 0,3 μM. No se obtuvieron parásitos SNF r cuando se electroporaron con el UPRT dirigido al plásmido CRISPR / Cas9. Varios SNF r CRISPR mutantes fueron clonados y la región alrededor de la SNR1 gRNA objetivo fue secuenciado. Cada mutante tenía un indel que interrumpió la secuencia codificante del SNR1 gen ( Figura 4B ]. Este método también puede usarse para insertar una construcción de orientación en el locus SNR1 a través de NHEJ ( Figura 5), o por HR ( Figura 6 ) - Supplemental File 2 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo esquemático para los experimentos resumidos en los protocolos. Los principales pasos en la identificación y confirmación del gen SNF r utilizando el ME49-FUDR r X VAND-SNF r se muestran con referencia a los protocolos apropiados esbozados en tSu artículo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig2.jpg" /> Figura 2: Comandos R / qtl para ejecutar QTL Scan en el SNF r Fenótipo. Los comandos descritos en el Protocolo 2 se ejecutaban en R usando el paquete qtl. Se muestran comandos representativos y diagrama. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig3.jpg" /> Figura 3: Localización del SNP Causal. Progeny WGS lecturas se alinearon a la VAND-SNF s genoma de referencia con Bowtie 2, SNPs fueron llamados con VarScan, y el correspondiente<html> Locus VAND QTL identificado con MUMmer. SNPs ubicados dentro del locus QTL fueron importados en una hoja de cálculo y el causal SNP fue identificado. SNF r progenie (amarillo), SNF s progenie (verde), SNF r SNP (rojo) (véase el archivo de datos 3 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig4.jpg" /> Figura 4: Confirmación de SNR1 como SNF r Gene usando CRISPR / Cas9. ( A ) CRISPR / Cas9 indujo mutaciones indel (verde) en el locus SNR1 . ( B ) Indels representativos en SNR1 causados ​​por dos plásmidos CRISPR específicos de SNR1 diferentes (C5 y C6 respectivamente). RH es la cepa WT y C5 y C6 son SNF r mutantes. (B se toma de la referenciaS = &quot;xref&quot;&gt; 2). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig5.jpg" /> Figura 5. Mutagénesis Insercional usando CRISPR / Cas9. ( A ) Inserción de genes complementarios o transgénicos en el locus SNR1 mediante integración específica del sitio mediada por CRISPR / Cas9. Dos orientaciones posibles del mini gen DHFR insertado y los cebadores utilizados para la identificación, F1 / 2 y R1 / 2 representan los sitios de cebado de oligos utilizados en PCR de diagnóstico. ( B ) PCR de diagnóstico de un clon snr1 :: DHFR * , RH se utiliza como un control WT. La PCR del GRA1p se incluye como un control que comprueba la calidad del ADN genómico como plantillas. Los asteriscos indican carriles con bandas inespecíficas (la figura 5B se toma de referenCe 2 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55185/55185fig6.jpg" /> Figura 6: Gene Knockout utilizando CRISPR / Cas9. Un diseño clásico para el reemplazo de genes homólogos mediados por CRISPR / Cas9 en T. gondii . La orientación del transgén insertado se fija en este caso. F1 / R1, F2 / R2 y F3 / R3 representan los sitios de cebado de oligos utilizados en PCR de diagnóstico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/55185fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Archivo de datos 1: ME49-FUDR r X VAND-SNF r Fichero cruzado fO utilizar en R / qtl, &quot;csv&quot; Formato. Un archivo .csv que se puede cargar en R / qtl con la opción format = &quot;csv&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_1.csv" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Archivo de datos 2: (txt chrid, txt genotipo, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt y phenos.txt). ME49-FUDR r VAND-SNF r Archivos cruzados para uso en R / qtl, &quot;gary&quot; Formato. Seis archivos .txt que se pueden cargar en R / qtl con la opción format = &quot;gary&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Archivo de datos 3. Hoja de cálculo con progenie SNPs a través del SNF r <stronG&gt; QTL Locus. Contiene una hoja de trabajo con la progenie SNPs, y una segunda hoja de trabajo con los datos fenotípicos de los progenitores y progenie de la cruz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Data_File_3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Archivo suplementario 1: Detalles adicionales del protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_1_-_101916.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Archivo Suplementario 2: Protocolo 5 - Utilización de la selección negativa en el lugar SNR1 para la complementación genética o la construcción de la cepa transgénica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55185/Supplementary_File_2_-_101916.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a></a>

Los detalles se presentan sobre cómo mapeo QTL con un mapa genético basado en la secuencia del genoma completo se puede utilizar para identificar un gen de resistencia a los medicamentos en Toxoplasma gondii y cómo esto se puede verificar con el sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente un objetivo genómico, en este caso el Gen de resistencia a fármacos.

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

El objetivo general de esta metodología de mapeo de locus de rasgos cuantitativos y edición del genoma mediante CRISPR/Cas9, es identificar y posteriormente verificar un gen implicado en la resistencia a la sinefungina en Toxoplasma. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en parasitología, como las bases genéticas de las variantes, la patogénesis y la resistencia a fármacos. La principal ventaja de estas técnicas radica en el uso de datos de secuenciación completa del genoma para un análisis preciso de QTL y de la edición del genoma mediante CRISPR/Cas9 para una manipulación genética eficiente en Toxoplasma.El procedimiento será demostrado por el Dr. Robin Powell, un asociado de investigación de mi laboratorio. Los parásitos Toxoplasma gondii se cultivan en células de fibroblastos de prepucio humano o células HFF confluentes, sembradas en frascos T25 con medio D10. Para probar la resistencia a la sinefungina en clones individuales de descendencia, cultive cada clon hasta alcanzar una alta densidad de parásitos, hasta que la mayoría de los parásitos comience a lisar las células huésped.Después de preparar la solución de parásitos según se describe en el protocolo escrito, utilice una pipeta para transferir 2,5 veces 10 a la quinta parásitos a un nuevo matraz de cultivo T25 con fibroblastos de HFF que contenga medio D10, con una concentración de trabajo de 0,3 micromolar del fármaco sinefungina. Incube los parásitos a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante siete a diez días. Observe la monocapa de células HFF bajo un microscopio invertido de contraste de fase y evalúe la descendencia según el fenotipo de crecimiento en presencia del fármaco sinefungina.Por ejemplo, asigne cero puntos por ausencia de crecimiento y un punto por crecimiento y lisis de la monocapa. Una vez que se hayan puntuado todos los descendientes, los datos se utilizarán como un fenotipo binario para la localización de loci de caracteres cuantitativos o QTL. Para identificar la mutación causal, las lecturas de secuenciación del genoma completo de los descendientes se alinean con el genoma de referencia sensible a sinefungina de van strand, se identifican los SNPs y se analiza el locus QTL en busca de un SNP asociado a resistencia a sinefungina.Se confirmará que SNR1 es el gen de resistencia a la sinefungina mediante la inactivación de SNR1 en un fondo silvestre sensible a la sinefungina utilizando mutaciones por inserción-deleción inducidas por CRISPR/Cas9. Para construir el plásmido CRISPR específico para SNR1, se utiliza el plásmido CRISPR de destino UPRT como molde en una mutagénesis dirigida por sitio basada en PCR, empleando cebadores diseñados específicamente. Los productos de mutagénesis que contienen los plásmidos CRISPR específicos para el gen de interés se transforman en células de E. coli.Luego se seleccionan clones individuales y se cultivan en medio LB, y los plásmidos extraídos se analizan mediante electroforesis en gel de ADN para verificar su tamaño. Posteriormente, los plásmidos se secuencian para confirmar la secuencia específica del ARN guía. Cuando el plásmido CRISPR específico para el blanco se introduce en una célula de Toxoplasma, el ARN guía dirige la nucleasa Cas9 al blanco para inducir una rotura de doble cadena en el ADN en un locus específico del objetivo.El rompimiento del ADN se repara entonces mediante una actividad propensa a errores, no homóloga y de unión, lo que conduce a mutaciones por inserción o deleción (indel) en el gen diana. Dos o tres días antes de transfectar los parásitos con el plásmido CRISPR específico para SNR1, añada suficientes parásitos a un matraz T25 que contenga una monocapa de células HFF confluentes para lograr una lisis del 70 % al 80 % de las células HFF en un plazo de dos a tres días. Examine el cultivo bajo un microscopio invertido de contraste de fase para confirmar que la monocapa de HFF ha sido lisada entre un 70 % y un 80 % por los parásitos.Retire suavemente el medio con una pipeta y lave las células de la superficie del matraz con cinco mililitros de tampón cytomix. Transfiera la solución de parásitos a un tubo cónico de 15 mililitros. Pase la solución de parásitos a través de una jeringa de 10 mililitros con una aguja roma de calibre 22, dos o tres veces.Para eliminar las células HFF y los restos celulares, filtre la solución de parásitos a través de una membrana con un tamaño de poro de tres micrómetros en un nuevo tubo cónico. Pelletee los parásitos filtrados mediante centrifugación a 400 veces G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y re-suspenda los parásitos pelleteados con 10 mililitros de tampón cytomix.Retire un alícuota de 10 microlitros para determinar la concentración de parásitos mediante un hemocitómetro. Peliice el resto de la suspensión nuevamente mediante centrifugación a 400 × g durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y re-suspenda el pelotón en el tampón de mezcla para obtener una densidad de 4 × 10⁷ parásitos por mililitro.En una cubeta con una separación de cuatro mililitros, mezcle de 250 a 300 microlitros de la solución de parásitos con 7,5 microgramos de plásmido CRISPR, seis microlitros de ATP y seis microlitros de glutatión. Electroporte los parásitos siguiendo un procedimiento estándar para transvección de T gondii. Incluya una electroportación separada como control negativo, en la que un plásmido CRISPR tenga como diana otra región.Cultive los parásitos electroportados en un matraz T25, sembrado con células HFF a 37 grados Celsius durante dos días. Para comenzar el procedimiento para examinar las mutaciones inducidas, primero reemplace el medio en el matraz con cinco mililitros de D10, que contiene 0,3 micromoles de sinefungina. Mantenga los parásitos y el medio de selección durante al menos tres pases hasta que el grupo resistente se estabilice.Como lo indica la ausencia de crecimiento del parásito en el grupo control negativo, pero un crecimiento parásito robusto en el grupo experimental. Subclonar el pool resistente a la sinefungina para obtener cepas coloniales. Recoger parásitos recién salidos y purificarlos mediante filtración con membrana de tres micrones, y subclonarlos en placas de 96 pocillos, sembradas con células HFF confluentes en 150 microlitros de medio D10.Cultive las placas de subclonación en una incubadora de CO₂ a 37 °C durante siete a 10 días, sin perturbar las placas. Después de siete a 10 días, revise las placas de 96 pocillos bajo un microscopio invertido de contraste de fase. Busque pocillos que contengan un solo halo y marque dichos pocillos.Transfiera las células de cada pocillo a placas de 24 pocillos, sembradas con células HFF. Incube a 37 grados celsius. Cuando los parásitos comiencen a lisar la monocapa, pase 50 microlitros de la solución de parásitos a un nuevo pocillo para mantener la cepa, y recopile el resto para el aislamiento de ADN genómico.Centrifugar el resto de la solución de parásitos a 1000 ×g durante 10 minutos. Lavar los parásitos centrifugados con PBS y centrifugarlos nuevamente. Aislar el ADN genómico de las células centrifugadas utilizando un kit comercial o mediante ebullición, y re-suspender los parásitos en 50 a 100 microlitros de PBS.Finalmente, realice la PCR según se describe en el protocolo escrito para obtener un fragmento del gen SNR1 para secuenciación. Se analizó la descendencia del cruce derivado, utilizando las cepas parentales ME49 resistentes al FUDR y las cepas van resistentes a la sinefungina, para evaluar la resistencia al fármaco sinefungina, indicada por el crecimiento y la lisis de la monocapa de HFF. Un análisis de QTL arrojó un pico significativo único en el cromosoma nueve, que abarca aproximadamente un MBP.La mutación causal se encuentra en esta región. El secuenciamiento completo del genoma permitió la identificación de la mutación. Los SNP de la descendencia dentro del locus QTL se importaron a una hoja de cálculo y se examinaron en busca de un patrón en el que la descendencia resistente a la sinefungina, mostrada en amarillo, presentara un SNP y la descendencia sensible a la sinefungina, mostrada en verde, no lo presentara.Solo un SNP indicado en rojo coincidió con este patrón que resulta en un codón de parada temprano en un gen putativo de transportador de aminoácidos denominado SNR1. Cuando el plásmido CRISPR Cas9 dirigido al SNR1 se introdujo por electroforesis en una cepa salvaje sensible a sinefungina, se obtuvieron mutantes resistentes al cultivarse en sinefungina. En contraste, no se obtuvieron parásitos resistentes a sinefungina con un plásmido CRISPR que tenía como diana otra región.Se clonaron varios mutantes resistentes a la sinefungina generados mediante CRISPR y se secuenció la región cercana al sitio diana del ARN guía SNR1. Representantes de los resultados obtenidos en la cepa silvestre RH y en los mutantes C5 y C6 resistentes a la sinefungina muestran que cada mutante presentaba una inserción o deleción (indel) que interrumpía la secuencia codificante del gen SNR1. No olvide que trabajar con Toxoplasma gondii puede ser peligroso, ya que es infeccioso para los seres humanos.Se deben tomar precauciones durante este procedimiento, como el manejo adecuado de objetos punzantes que podrían entrar en contacto con el parásito. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inserción exógena de genes mediante CRISPR/Cas9 en sitios específicos, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la complementación genética o la construcción de parásitos transgénicos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la parasitología molecular exploraran la compleja biología y los mecanismos de patogénesis en Toxoplasma gondii.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis de QTL utilizando datos de secuenciación del genoma, así como de la manipulación genética de Toxoplasma gondii mediante edición genética con CRISPR/Cas9.

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Determinación de la eficiencia de los inhibidores químicos contra el crecimiento de toxoplasma intracelular Gondii mediante un ensayo de crecimiento basado en Luciferase

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