Preparación y Evaluación de ^99m Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química

El objetivo general de este procedimiento es producir tetrazinas marcadas con tecnecio-99m para la obtención de imágenes predirigidas utilizando química bioortogonal con biomoléculas modificadas con transcicloocteno como vectores objetivo. Este método proporciona una nueva e importante plataforma para el desarrollo de nuevos radiofármacos. A través de la pre-focalización, los complejos de tecnecio descritos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de una amplia gama de órganos, tejidos y biomarcadores.

Esta técnica es ventajosa, ya que proporciona un método robusto paso a paso para producir tetrazinas radiomarcadas con tecnecio-99m, el isótopo médico más utilizado en medicina diagnóstica. Esta técnica se puede utilizar con diferentes vectores diana, incluyendo moléculas pequeñas y anticuerpos. También se puede utilizar para la radioterapia mediante el intercambio de tecnecio con isótopos emisores de beta de renio.

La demostración de parte de los procedimientos con animales estará a cargo de Nancy Janzen, técnica de biología en nuestro laboratorio. Para comenzar el procedimiento de radiomarcado, en un vial de microondas, combine ocho miligramos de boranocabonato de potasio, 15 miligramos de carbonato de sodio, 20 miligramos de tetraborato de sodio decahidratado y 25 miligramos de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado. Purgue el vial con gas argón durante 10 minutos.

A continuación, añada cuatro mililitros de tecnecio-99m de pertecnetato al 0,9% de solución salina con una actividad de 1.110 megabecquerelios al vial. Cargue la mezcla de reacción en un reactor de microondas y revuelva durante 10 segundos. A continuación, se calienta la mezcla a 110 grados centígrados durante 3,5 minutos para obtener el catión triaqua tricarbonil tecnecio-99m.

Agregue aproximadamente 400 microlitros de ácido clorhídrico molar para ajustar el pH de la solución a 3.5 a 4. A continuación, para cada ligando de tetrazina, disuelva dos miligramos de ligando en 250 microlitros de metanol. Agregue 250 microlitros del complejo tecnecio-99m con una actividad de 74 megabecquerelios a cada solución de ligando.

Caliente la mezcla en un reactor de microondas a 60 grados centígrados durante 20 minutos. En el caso de los ligandos de tetrazina con grupos protectores de t-butilo, transfiera la solución de un vial de microondas a un vial de centelleo de 20 mililitros y, a continuación, evapore el disolvente y vuelva a disolver cada complejo en un mililitro de una solución volumétrica de diclorometano y ácido trifluoroacético. Luego, transfiera la solución a un vial de microondas y caliente esos complejos en un reactor de microondas a 60 grados Celsius durante seis a 10 minutos para desproteger los ligandos.

Enfríe los complejos a temperatura ambiente y luego evapore el solvente. Vuelva a disolver los residuos en 500 microlitros de una solución acuosa uno a uno de acetonitrilo o metanol y agua antes de proceder a la purificación por HPLC. Utilice HPLC de fase reversa C18 para purificar cada complejo de tetrazina radiomarcado con un gradiente de elución de 30 a 70 a 40 a 60 acetonitrilo para regar durante 20 minutos con ácido trifluoroacético al 0,1% presente en el eluyente en todo momento.

Recoja el producto purificado cuando se muestre eludiendo en la traza gamma. A continuación, coinyecte cada complejo marcado con una solución de 0,125 miligramos del complejo de radio-tetrazina correspondiente en metanol al 20% en agua. Compare los tiempos de retención del pico del complejo de renio en la traza UV y el pico del complejo de tecnecio en la traza gamma para verificar la identidad del pico gamma.

Retire el disolvente de cada complejo purificado de tecnecio-tetrazina. Formular cada complejo a una concentración de 7,4 kilobecquerelios por microlitro en solución salina tamponada con fosfato con 0,5% de albúmina sérica bovina y 0,01% de polisorbato 80. Para cada sujeto de ratón, extraiga en una jeringa 100 microlitros de una solución de cinco microgramos por microlitro del derivado TCOPB en solución salina para preparar una dosis de 20 miligramos por kilogramo.

Conecte una aguja de calibre 30 a la jeringa dosificadora. Coloque el sujeto del ratón en un dispositivo de restricción física. Identifique las venas en la superficie lateral de la cola aproximadamente a dos centímetros del extremo de la cola y limpie el área con un hisopo con alcohol.

Inserte la aguja de la jeringa en un ángulo poco profundo paralelo a la vena. Inyecte lentamente el derivado TCOBP. Retire la aguja y aplique una esponja de gasa limpia con una ligera presión en el lugar de la inyección hasta que se detenga el sangrado.

Una hora después de la inyección del derivado TCOBP, administrar una dosis de 100 microlitros del complejo deseado de tecnecio-99m tetrazina con una actividad de aproximadamente 0,74 megabecquerel por inyección en la vena de cola. Utilice un calibrador de dosis para medir la actividad de una muestra de prueba de 100 microlitros del complejo de tecnecio en el momento de la inyección. Guarde la muestra de prueba para mediciones posteriores.

Anestesiar al ratón con una mezcla de gas con un 3% de isoflurano y un 2% de oxígeno seis horas después de la inyección. Coloque el ratón boca arriba con la nariz en el cono de la nariz para continuar con la anestesia y localice el proceso xifoides. Conecte una aguja de calibre 25 a una jeringa previamente tratada con heparina.

Inserte la aguja en un ángulo de 20 grados debajo de la apófisis xifoides, ligeramente a la izquierda de la línea media. Una vez que la aguja esté completamente insertada, retire lentamente el émbolo para verificar si hay sangre en el centro de la aguja, confirmando una punción cardíaca exitosa. Vuelva a ajustar la aguja según sea necesario.

Una vez que se haya perforado el corazón, extraiga lentamente un mililitro de sangre en la jeringa. Transfiera la muestra de sangre a un tubo de recuento previamente pesado. Sacrificar al ratón por luxación cervical mientras está bajo anestesia.

Coloque el animal sacrificado en una bolsa de plástico y mida la actividad de todo el cuerpo con un calibrador de dosis. Luego, recoge los huesos de la rodilla y el hombro, la vesícula biliar, los riñones, el hígado, la tiroides y la tráquea, y la cola. Junto con su contenido, recoge el estómago, el intestino delgado, el intestino grueso y el ciego, y la vejiga urinaria.

Enjuague la sangre de todos los tejidos recolectados, excepto la agalla y la vejiga urinaria, con solución salina tamponada con fosfato. Seque los pañuelos y coloque cada tejido en un tubo de conteo previamente pesado. Mida la actividad residual de la canal.

Pesa cada muestra de tejido y calcula la masa del tejido solo. Utilice un contador gamma multidetector para medir la actividad de una alícuota de cinco microlitros de la muestra de prueba del complejo de tecnecio. Utilizando el valor obtenido en recuentos por minuto y la actividad medida en el momento de la inyección, calcule un factor de conversión.

Mida la actividad de cada muestra de tejido y fluido con el detector gamma. Convierta los valores a microcurie y normalice cada valor por peso del órgano para determinar el porcentaje de dosis inyectadas por gramo de tejido. Repita este proceso con ratones adicionales sin la inyección del derivado TCOPB como una serie de control negativo.

Usando este método, cinco complejos de tetrazina que diferían en sus combinaciones de enlazador y líder clave se marcaron con tecnecio-99m. Un derivado de TCOPB, que se localiza en regiones de alto recambio de calcio en el hueso, se utilizó para atacar previamente las articulaciones del hombro y la rodilla de ratones. Se calcularon las proporciones del porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido para hueso y sangre para cada compuesto de tetrazina.

Los cinco compuestos eliminaron la sangre rápidamente y se dirigieron al hueso, lo que indica que la reacción de acoplamiento bioortogonal selectivo entre los compuestos de tetrazina y el derivado TCOBP había ocurrido in vivo. El compuesto tres mostró la mejor combinación de focalización y eliminación de la sangre. Los experimentos de control negativo indicaron que los complejos de tetrazina marcados radiológicamente no se localizaron significativamente en el hueso en ausencia del derivado TCOBP.

Por ejemplo, cuando no se administró el derivado de TCOBP, el compuesto dos tenía niveles altos en la vesícula biliar y los intestinos, pero muy poco en el hueso. Se observó una amplia variación en la localización de tejidos en ratones que recibieron el derivado TCOBP entre los cinco compuestos probados. Por ejemplo, se observó muy poco del compuesto tres en el intestino grueso, el hígado o la orina y la vejiga en comparación con otros complejos, mientras que se observó mucho más del compuesto tres en el hueso.

Una vez dominada, la técnica de etiquetado descrita aquí se puede realizar de principio a fin en menos de dos horas si se realiza correctamente. Al intentar esta técnica, es importante asegurarse de que todos los reactivos se pesen con precisión y que las sales se purguen con argón antes de agregarlas a la solución de tecnecio. También es fundamental que el pH de la solución de tecnecio se ajuste a 3,5 a cuatro antes de la adición del ligando de tetrazina.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y purificar tetrazinas marcadas con tecnecio y cómo se pueden usar para crear nuevos radiofármacos utilizando química bioortogonal y de pre-targeting. No olvide tomar las precauciones adecuadas cuando trabaje con radiactividad, como comprender el tipo de radiación emitida y cómo proteger y manipular mejor las muestras.