Name: Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a establecer líneas celulares B linfoblastoides mediante lisis de glóbulos rojos con solo 0,5 ml de sangre. Este método eficiente utiliza el virus Epstein-Barr para inmortalizar linfocitos B humanos con alta viabilidad celular.

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Este trabajo fue apoyado por los proyectos clave de la Academia China de Ciencias (KFZD-SW-205), sistema de apoyo tecnológico de recursos biológicos estratégicos de la Academia China de Ciencias (CZBZX-1).

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo, y el protocolo sigue las directrices institucionales para el bienestar humano. 1. Preparación de virus EB <ol><li> En el día 1, descongelar las células B95-8 y la cultura en 6 ml de RPMI completo 1640, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, y antibióticos (100 mg / ml de estreptomicina, 100 U / ml de penicilina) en una matraz de cultivo T25. Colocar el frasco de cultivo en 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> En el día 2, observar la morfología de las células bajo un microscopio. Las células están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondas. Añadir 10 ml de medio completo RPMI 1640. </li><li> El día 4, se añaden 10 ml de medio completo RPMI 1640, y luego se transfieren a un matraz de cultivo T75. </li><li> En el día 8, se añaden 20 ml de medio completo RPMI 1640. </li><li> Mantener las células durante 8 días sin la adición de medio fresco, es decir, el hambre. </li><li> En el día 16, observe las célulasobservado bajo el microscopio. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 ml, 12 ml / tubo. </li><li> Crio-preservar a -80 ° C durante 1 h, y luego descongelar rápidamente a 37 ° C. Repetir 3 veces hasta que las partículas de virus se liberan de las células. </li><li> Centrifugar a 240 xg durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Se filtra el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras, alícuota de 12 ml / tubo, y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 2. El tratamiento de la sangre entera con glóbulos rojos tampón de lisis <ol><li> Añadir 0,5 ml de sangre total anticoagulada con EDTA · K 2 a un tubo de 15 ml. </li><li> Ponga 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (filtrada por 0.22 m filtro y descongelado a temperatura ambiente antes de su uso) para la sangre entera y mezclar bien. Colocar la mezcla a temperatura ambiente durante 4 min. A continuación, añadir de 5 - 7 ml de PBS 1x rápidamente a la reacción de parada. </li><li> Centrifugar a 240 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Los glóbulos blancos se precipitarán en la parte inferior del tubo. </li><li> Descartar el sobrenadante, y se lava la precipitación mediante la adición de 7 ml 1,640 medio básico. Centrifugar durante 5 min a 240 xg a temperatura ambiente. Repetir dos veces. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 300 medio de transformación l (medio RPMI 1640, que contiene 20% de suero bovino fetal y 10 mg / ml de fitohemaglutinina (PHA)). </li></ol> La infección por VEB 3. <ol><li> Añadir 60 l de 20 mg / ml de ciclosporina A (CsA) a la suspensión celular. </li><li> Descongelar rápidamente una alícuota de EBV a 37 ° C. Añadir 240 l EBV a la suspensión celular. </li><li> Mezclar bien y colocar la suspensión celular a una placa de 96 pocillos, a 200 l por pocillo. Para evitar la evaporación, añadir 200 l de 1x PBS a cada pozo alrededor de la placa de 96 pocillos. Colocar la placa en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C. </li></ol> 4. La expansión y la criopreservación de B-LCL <ol><li> Cambiar la mitad del medio una vez por semana durante el primer mes después de la infección por VEB. Sólo una gruesa Layer de fragmentos de células es visible bajo el microscopio en el día 7 (Figura 2). Después de un mes de la infección por EBV, grupos de células linfoblastoides son visibles bajo una gruesa capa de fragmentos de células bajo el microscopio (Figura 2). </li><li> Cambiar la mitad del medio cada 3 días hasta que los grupos de células son claramente visibles bajo el microscopio (Figura 2). Por lo general, este proceso tarda de 10 a 20 días. </li><li> Después de mezclar, pipetear las células y la transferencia a la placa de 24 pocillos. Duplicar el volumen de medio de cultivo con RPMI 1640 completo, mientras que se vuelva amarillo. Este proceso depende de la tasa de crecimiento celular. </li><li> Posteriormente, la transferencia de las células al matraz de cultivo T25. El doble del volumen de medio de cultivo, ya que se vuelve amarillo hasta que el volumen de medio se expande a 10 a 15 mL. </li><li> Cambio de medio 24 h antes de la congelación. suspensión de células Centrifugar durante 5 min a 240 x g. Contar las células con un contador de células y se congelan a una densidad de 5 a 10 x 10 6 / ml en frsolución madre ozen que contiene 90% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a una velocidad de 1 ° C por minuto a -80 ° C y luego transferir directamente en nitrógeno líquido. </li></ol> 5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo de 17 <ol><li> Preparar una suspensión de células individuales B-LCLs con el medio de 1640 que contiene suero bovino fetal 10%. Semilla 3 x 10 4 células por pocillo en placas de 96 pocillos, 100 l por pocillo. </li><li> Colocar la placa en 5% de CO2 a 37 ° C por 12 - 16 h. </li><li> Añadir MTT (5 mg / ml) a los pocillos en los que las células están creciendo y mantenerse alejado de la luz durante 4 horas a 37 ° C. </li><li> placa de células se centrifuga durante 10 min a 168 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 100 l de DMSO por pocillo. NOTA: Tenga cuidado. No toque los cristales tintados en forma de aguja. </li><li> Agitar la placa durante 10 minutos a baja velocidad para disolver completamente los cristales. </li><li> Medida de absorción a 570 nmusando un espectrofotómetro de microplacas. </li></ol>

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<li>Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transformation+of+cryopreserved+lymphocytes%3A+A+resource+for+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Se presenta el desarrollo de un nuevo método para inmortalizar células B humanas a partir de sangre completa por lisis de las células rojas de la sangre, y su viabilidad celular de establecido B-LCLs se evaluó por el ensayo MTT. Los resultados mostraron que la viabilidad de las células de B-LCLs establecidos por el método de lisis de glóbulos rojos es mucho mayor que la del método de separación en gradiente de densidad. La principal ventaja del método de lisis de glóbulos rojos es que es simple y requiere un pequeño vol...

Las células B en reposo podrían ser transformadas por el virus de Epstein-Barr (VEB) in vitro en líneas de células linfoblastoides B en proliferación activa (B-LCLs). Las B-LCLs son similares a las células germinales en diferenciación y desarrollo, y la tasa de mutación somática de las B-LCLs fue solo del 0,3%1, con una alteración genética y fenotípica insignificante. Por lo tanto, las B-LCLs, como sustitutos de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), han acelerado sustancialmente el progreso del estudio de la genómica, la transcriptómica y la proteómica de las enfermedades asociadas al VEB2,3. Además, las B-LCLs también tienen una aplicación importante en el cribado de anticuerpos monoclonales4,5. 
Se han desarrollado varios métodos para la inmortalización de linfocitos B por el VEB. Los procedimientos más comunes incluyen el aislamiento de linfocitos B y el uso de líneas celulares B95-8 para producir VEB infeccioso. Desde el aislamiento hasta la transformación, estos métodos se dividen en tres estrategias. Los linfocitos se separan de la sangre fresca mediante centrifugación en gradiente de densidad y transformación del VEB directamente6-8, denominado método de separación en gradiente de densidad en este estudio. Sin embargo, otras técnicas superan la dificultad de enviar sangre fresca y utilizan un procedimiento para la congelación de linfocitos purificados y la posterior descongelación e infección por VEB9-11. La sangre entera criopreservada también puede utilizarse para el aislamiento de linfocitos B y la transformación12,13. Además de la centrifugación en gradiente de densidad para separar los linfocitos B, algunos investigadores utilizan un clasificador magnético de células para seleccionar los linfocitos B12. Sin embargo, la separación magnética es un proceso costoso, complejo y que requiere mucho tiempo. Aunque estos métodos son útiles para inmortalizar linfocitos B con una alta tasa de éxito, la necesidad de tratar un gran número de muestras clínicas y el volumen relativamente pequeño de sangre requieren un método más simple para el establecimiento de una línea celular permanente.
Otro método menos utilizado es el uso de sangre entera como fuente de células nucleadas para la infección por EBV y el establecimiento de B-LCL. Estos métodos simplifican la técnica al omitir el procedimiento de separación. Solo una pequeña cantidad de sangre entera, ya sea fresca14 ocongelada 15,16, es suficiente para obtener las líneas celulares. Desafortunadamente, existe una gran variabilidad en el éxito de los documentos15,16 y varias de nuestras pruebas de validación. Además, las colonias transformadas apenas se reconocen bajo un microscopio debido a las grandes impurezas contaminantes. Por lo tanto, se requiere un método más confiable para la transformación.
Basándonos en las consideraciones anteriores, hemos desarrollado un método novedoso para establecer B-LCLs sin purificación previa de los linfocitos, llamado método de lisis de glóbulos rojos. Este método es conveniente, ahorra tiempo y es aplicable a una gran cantidad de muestras. Tan solo 0,5 mL de sangre entera fue suficiente para obtener B-LCL que se pueden obtener fácilmente de bebés y ancianos sin dañar significativamente su salud.

<table><tbody><tr><td>Centrífuga</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celdas automatizado de centrifugación&nbsp;</td><td>Countstar</td><td>&nbsp; IC 1000&nbsp;</td><td>Para el conteo de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Epoch Microplate Espectrofotómetro</td><td>BioTek Instruments</td><td>SN263839</td><td>Para medir la absorbancia</td></tr><tr><td>96 pocillos grupo de cultivo celular</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td>Placas de poliestireno 24</td></tr><tr><td>pocillos Clúster de cultivo celular</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Placas de poliestireno</td></tr><tr><td>25 cm2 matraz de cultivo celular</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Poliestireno& nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Componente de B-LCLs medio</td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td>Para B-LCLs medio</td></tr><tr><td>L-Glutamina &nbsp; &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0374</td><td>Componente del medio B-LCLs</td></tr><tr><td>100x solución de penicilina estreptomicina BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Componente del medio B-LCLs</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE&nbsp; Cuidado de la salud</td><td>17-1440-03</td><td>Para el aislamiento > de linfocitos</td></tr><tr><td>PHA-M</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Para estimular la proliferación de linfocitos</td></tr><tr><td>Ciclosporina A</td><td>Caimán&nbsp; Químico</td><td>12088</td><td>Para inhibir el efecto de citotoxicidad de los linfocitos T</td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Tiangen</td><td>RT122-01</td><td>Para lisar glóbulos rojos</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Amresco</td><td>0793</td><td>Para la detección de la viabilidad celular</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Para congelar células</td></tr></tbody></table>

un simple blood red lisis celular método para el establecimiento de líneas de células b linfoblastoides

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Existen varios métodos para la transformación de linfocitos B por el virus de Epstein Barr in vitro en líneas celulares inmortalizadas. Hemos desarrollado un nuevo método con una estrategia potente y sencilla para el establecimiento de B-LCLs, el método de lisis de glóbulos rojos. Este método simplificó el procedimiento de separación de PBMC con la extracción de glóbulos rojos y utilizó tan solo 0,5 ml de sangre completa para establecer líneas celulares inmortalizadas por el VEB, que pueden proliferar a grandes cantidades de células en un período de tiempo relativamente corto con una tasa de éxito del 100%. El método es sencillo, fiable, ahorra tiempo y es aplicable al tratamiento de un gran número de muestras clínicas.

Durante el proceso de transformación, los cambios morfológicos de células se visualizaron por microscopía de luz (Figura 2). Pequeños grupos de células eran claramente visibles con el método de separación en gradiente de densidad después de 7 días de la infección, mientras que sólo una capa gruesa de fragmentos de células son visibles desde el método de lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, los grupos de células linfoblásticas son visibles bajo la gruesa capa de fragment...

Un método de lisis de glóbulos rojos simple para el establecimiento de B-LCLs se desarrolló con una alta eficiencia de la inmortalización, lo que requiere una pequeña cantidad de sangre y el ahorro de tiempo desde el inicio de la crioconservación.

Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

El objetivo general de este método sencillo es establecer líneas celulares de linfoblastoides B, o LCB-B, con alta eficiencia de inmortalización utilizando solo una pequeña cantidad de sangre y ahorrando tiempo entre la iniciación y la criopreservación. Este es un método novedoso para inmortalizar linfocitos B humanos a partir de sangre total mediante la lisis de los glóbulos rojos. Las LCB-B proporcionan una fuente valiosa de biomateriales para llevar a cabo diversos estudios.La principal ventaja de este método es que solo 0.5 mililitros de sangre son suficientes para obtener LCB-B con eficiencia de inmortalización y alta viabilidad celular. Para establecer LCB-B mediante el virus de Epstein-Barr, o VEB, que transforma los linfocitos B, el método ampliamente utilizado consiste en separar las células mononucleares de la sangre periférica o PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Sin embargo, cuando la muestra es inferior a un mililitro, la adición del agente lisador de glóbulos rojos fallará.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos que aislar los PBMC de los glóbulos rojos pequeños es difícil utilizando un método de separación por gr

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Investigación

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Inmunología e Infección

Un sistema eficiente de la estructura y análisis de la función de un gen en...

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

Se describe un método para generar líneas de células transformadas B con virus Epstein-Barr. También ilustra un ensayo de novela que pueda identificar a las células B destinada a sufrir una transformación tan pronto como tres días después de la infección.

Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

En este video, describimos un método para estudiar la dinámica de los orgánulos en los linfocitos B después de su activación con microperlas recubiertas de antígenos.

Dinámica de orgánulos en linfocitos B después de la activación con perlas recubiertas de antígeno

Este video muestra una técnica in vitro para estimular linfocitos a través de Haemophilus influenzae (NTHi) no tipificable y para evaluar la respuesta inmune. La incubación de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMC) con NTHi hace que las células bacterianas estimulen los linfocitos T, lo que conduce a la producción de citocinas. Al inhibir la secreción de citocinas, se realiza una tinción de inmunofluorescencia para detectar las citocinas intracelulares acumuladas en los...

Una técnica in vitro para estimular linfocitos a través de bacterias patógenas

Este video muestra un ensayo que investiga el papel de las células similares a los neutrófilos en la protección de las células de linfoma contra la citotoxicidad de los agentes quimioterapéuticos. Se establece un cocultivo en 3D, que consiste en linfoma y células similares a los neutrófilos, y se expone a la vincristina, un medicamento de quimioterapia. El contacto directo con las células similares a los neutrófilos induce una regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas en las células...

Determinación de la función de las células similares a los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a un fármaco de prueba

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulos blancos. Aquí se describe el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana mediante el método de separación en gradiente de densidad y la diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) a lo largo de la vía granulocítica; para probar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfomas.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

La mitogénesis de los linfocitos T se acompaña de una transformación blastogénica, tras lo cual el volumen celular aumenta antes de la división celular. Aquí, describimos un método para cuantificar la blastogénesis en linfocitos T utilizando un contador celular automatizado con la capacidad de medir diámetros celulares.

La cuantificación rápida de Blastogénesis inducida por mitógeno de linfocitos T para identificar fármacos inmunomoduladores

Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Aprende a establecer líneas celulares B linfoblastoides mediante lisis de glóbulos rojos con solo 0,5 ml de sangre. Este método eficiente utiliza el virus Epstein-Barr para inmortalizar linfocitos B humanos con alta viabilidad celular.

Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

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