Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

El objetivo general de este sencillo método es establecer líneas celulares linfoblastoides B, o B-LCL, con una alta eficiencia de inmortalización, utilizando solo una pequeña cantidad de sangre y ahorrando tiempo entre el inicio y la criopreservación. Este es un método novedoso para inmortalizar células B humanas a partir de sangre completa mediante la lisis de glóbulos rojos. Los B-LCLs proporcionan una valiosa fuente de biomateriales para llevar a cabo diversos estudios.

La principal ventaja de este método es que solo 0,5 mililitros de sangre son suficientes para obtener B-LCLs con eficiencia de inmortalización y alta viabilidad celular. Establecer B-LCLs por el virus de Epstein-Barr, o VEB, transformando linfocitos B, el método ampliamente utilizado en células mononucleares de sangre periférica separadas o PBMC, mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll. Sin embargo, cuando la muestra es menos de un mililitro de lisado de glóbulos rojos, la adición fallará.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que aislar el PBMC de los glóbulos rojos pequeños es difícil utilizando un método de separación por gradiente de densidad. Para preparar el VEB, el primer día comience por descongelar las células B95-8 y cultivarlas en un matraz de cultivo T25 en seis mililitros de medio RPMI 1640 completo suplementado con 10% de FBS, dos milimolares de L-glutamina y antibióticos. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

El segundo día, bajo un microscopio, observe la morfología de la célula. Las celdas están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondas. Agregue 10 mililitros de RPMI 1640 Medium completo al cultivo.

En el cuarto día, agregue 10 mililitros de medio fresco y transfiera las células a un matraz de cultivo T75. Luego, en el octavo día, agregue 20 mililitros más de medio y mantenga las células durante ocho días sin agregar medio fresco. El día 16, revise las células bajo el microscopio.

A continuación, recoja 12 mililitros de células en tubos de centrífuga de 15 mililitros. A continuación, criopreserva las células a menos 80 grados centígrados durante una hora y descongela rápidamente los cultivos a 37 grados centígrados. Repita la congelación y descongelación, tres veces más hasta que las partículas del virus se liberen de las células.

Centrifugar los cultivos a 240 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras. Alícuota 12 mililitros del filtrado por tubo y almacene los tubos a menos 80 grados centígrados.

A un tubo de 50 mililitros, agregue 0,5 mililitros de sangre entera que haya sido anticoagulada por EDTA K2. Agregue un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos a toda la sangre y mezcle bien. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante cuatro minutos. Luego agregue rápidamente de cinco a siete mililitros de 1x PBS para detener la reacción de lisis.

Después de agregar el tampón de lisis de glóbulos rojos a la sangre, asegúrese de mezclar bien. La inversión garantiza que la reacción finalice de manera oportuna. A continuación, centrifugar el tubo a 240 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Los glóbulos blancos se precipitarán en el fondo del tubo. Deseche el sobrenadante y lave el precipitado agregando siete mililitros de 1640 Basic Medium. A continuación, centrifugar la solución antes de repetir el lavado.

Con 300 microlitros de medio de transformación, resuspender el pellet celular. Luego, para llevar a cabo la infección por EBV, agregue 60 microlitros de 20 microgramos por mililitro de ciclosporina A a la suspensión celular. Descongelar rápidamente una alícuota de VEB a 37 grados centígrados y añadir 240 microlitros del virus a las células.

Mezcle bien la suspensión y transfiera 200 microlitros por pocillo a una placa de 96 pocillos. Luego incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Durante el primer mes después de la infección por VEB, cambie la mitad del medio en el cultivo celular una vez por semana.

En el séptimo día, solo una capa gruesa de fragmentos de células es visible bajo el microscopio. Después de un mes de infección, los grupos de células linfoblastoides son visibles debajo de una capa gruesa de fragmentos de células. A partir de este momento, cambie la mitad del medio cada tres días hasta que los grupos de células sean claramente visibles bajo el microscopio.

Después de resuspender las células, transfiera la suspensión a los pocillos de una placa de 24 pocillos. Luego, dependiendo de la tasa de crecimiento celular, cuando el medio de cultivo se vuelva amarillo, duplique el volumen del medio RPMI 1640 completo. Cuando los grupos de células linfoblastoides sean visibles a simple vista, transfiera el cultivo a un matraz de cultivo T25.

A medida que el medio de cultivo se vuelve amarillo, duplique el volumen del medio hasta que el volumen se expanda a 10 a 15 mililitros. Antes de congelar, cambie el medio con 24 horas de anticipación. Luego, para congelar las células, centrifuga la suspensión celular y usa un contador de células para contar las células.

Con la solución madre congelada que contiene 90% de FBS y 10% de DMSO, ajuste la suspensión a una densidad de cinco a 10 veces 10 a la sexta celdas por mililitro. A continuación, congele la suspensión a una velocidad de un grado centígrado por minuto a menos 80 grados centígrados antes de transferir las células congeladas directamente al nitrógeno líquido. Durante el proceso de transformación, los cambios morfológicos de las células son visibles por microscopía óptica.

Después de siete días de infección, pequeños grupos de células son claramente visibles utilizando el método de separación por gradiente de densidad, mientras que solo una capa gruesa de fragmentos celulares son visibles con el método de lisis de glóbulos rojos. 30 días después de la infección, los grupos de células linfoblastoides son visibles debajo de la capa gruesa de fragmentos celulares. Con cambios de medio más frecuentes, los restos celulares se reducen y los grupos de células son claramente visibles y se parecen al cultivo establecido por separación en gradiente de densidad.

Finalmente, se utilizó el ensayo MTT para evaluar la viabilidad de los B-LCL. Los resultados mostrados aquí indican que las células B-LCLs cultivadas mediante el método de lisis de sangre roja fueron significativamente más viables que el cultivo establecido mediante el método de separación por gradiente de densidad. Una vez dominado, el proceso de transformación viral del VEB se puede realizar en 30 minutos cuando se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo establecer B-LCL con un método de lisis de glóbulos rojos simple y que ahorra tiempo sin purificación previa de linfocitos. Tras su desarrollo, esta técnica aceleró el avance del estudio de la genómica, la transcriptómica y la proteómica de las enfermedades asociadas al VEB y su aplicación en la producción de anticuerpos mononucleares. No olvide que trabajar con patógenos humanos, como el VEB, puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.