Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

El objetivo general de este método es dirigir la diferenciación de las células madre pluripotentes humanas hacia el programa hematopoyético primitivo o definitivo utilizando un enfoque de manipulación de señales específicas de la etapa. Este método puede abordar muchas preguntas clave en el campo, como la comprensión de los reguladores de señales y transcripcionales de la hematopoyesis definitiva humana. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la manipulación específica de la etapa al instante.

Quien demuestra este procedimiento es Carissa Dege, una postdoc en mi laboratorio. Para comenzar el protocolo, obtenga líneas de células madre pluripotentes humanas (HPSC) previamente preparadas y cultivadas en fibroblastos embrionarios de ratón o MEF con una confluencia del 70% al 80% en una incubadora de 37 grados Celsius con un cinco por ciento de CO2. Aspire el medio HPSC y agregue un mililitro de EDTA de tripsina al 0,25% a 37 grados Celsius a cada pocillo durante un minuto.

Después de un minuto, aspire la tripsina y agregue un mililitro de material de archivo a cada pocillo. Con un raspador de células, raspe las células de la placa. Luego, agregue un mililitro de tampón de lavado a cada pocillo.

Con una pipeta serológica de dos mililitros, triture las células de tres a cinco veces para romper los grumos grandes. Y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar las HPSC a 330 x G durante cinco minutos.

Después del centrifugado, agregue medios HPSC y vuelva a suspender las celdas. A continuación, agregue dos mililitros de HPSC resuspendidas a cada pocillo de la vajilla de plástico codificada con MAT e incube las celdas durante la noche. Después de 24 horas, aspire el medio y reemplácelo con EDTA de tripsina al 0,05% Celsius de 37 grados durante un minuto.

Aspirar la tripsina EDTA. Agregue un mililitro de medio madre y raspe las células vigorosamente con un raspador de celdas. A continuación, añada un mililitro de medios de lavado.

Con una pipeta serológica de dos mililitros, triture las células tres veces y transfiérelas a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar las células a 220 x G durante cinco minutos. A continuación, aspire el medio, añada 20 mililitros de medio de lavado y utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para volver a suspender suavemente las células.

Después de la centrifugación y la aspiración, vuelva a suspender cuidadosamente los cuerpos embrioides o EB en medios de día cero. Dispensar dos mililitros de medios de diferenciación que contengan EB en cada pocillo de una placa de cultivo celular de baja adherencia de seis pocillos utilizando una pipeta serológica de diez mililitros. Coloque los EB en una incubadora multigás a 37 grados centígrados con cinco por ciento de CO2 y cinco por ciento de O2.

Veinticuatro horas después, agregue dos mililitros de medios del primer día. Incubar las células durante la noche en una incubadora multigas. Después de 18 horas, coseche suavemente los EB con una pipeta serológica de cinco mililitros y gírelos a 100 x G durante cinco minutos.

Lavar y combinar todo el cultivo con diez mililitros de Dulbecco Medium Modificado o IMDM de Iscove. Después de volver a centrifugar el cultivo a 100 X G durante cinco minutos para eliminar los residuos, aspire el medio. Vuelva a suspender suavemente los EB con los medios del segundo día con una pipeta P1000.

A continuación, dispense dos mililitros de los EB por pocillo en placas de cultivo celular de baja adherencia de seis pocillos. Agregue tres CHIR99021 micromolares o IWP2 para especificar progenitores hematopéyicos definitivos o primitivos, respectivamente. Incubar la placa en una incubadora multigás a 37 grados centígrados durante 30 horas.

A las 30 horas, aislar los EB con una pipeta serológica de dos mililitros transfiriéndolos a un tubo cónico de 50 mililitros y centrándolos a 330 x G durante cinco minutos. Vuelva a suspender suavemente los EB y lávelos con 10 mililitros de IMDM. Vuelva a suspender los EB en el medio del tercer día y dispense dos mililitros en cada pocillo de placas de seis pocillos de baja adherencia.

Incubar las células en una incubadora multigás a 37 grados centígrados durante 72 horas. Después de 72 horas de incubación, agregue dos mililitros de Day Six Media a cada pocillo. A continuación, incube los EB en una incubadora multigás a 37 grados centígrados durante 48 horas adicionales.

Aísle los EB tratados con CHIR99021 en el octavo día de diferenciación y continúe con la siguiente sección. Centrifugar los EB a 330 x G durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante.

A continuación, agregue dos mililitros de 0.25% de tripsina EDTA a los EB. Agite los EB durante cinco segundos e incube los Ebs en un baño de agua a 37 grados centígrados durante ocho minutos. A continuación, añada cinco mililitros de solución de parada y centrifugar los EB.

A continuación, aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender los EB en cinco mililitros de colagenasa II. Agite el tubo durante cinco segundos y luego incube los EB en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de 60 minutos, agite los EB durante cinco segundos y agregue cinco mililitros de solución de parada.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón FACS. Pase las células a través de un filtro de células de 40 micras para eliminar los grupos de células no disociadas. Proceder con el marcaje de anticuerpos y el aislamiento FACS de los progenitores endoteliales hemogénicos CD34 positivos.

Después del aislamiento de FACS, vuelva a suspender las células en el medio HE. Distribuya las células en alícuotas de 50 microlitros en una placa de cultivo de baja adherencia de 96 pocillos y luego incube las células durante la noche. A la mañana siguiente, los progenitores hematopoyéticos deben agruparse en grupos de seis a diez células.

Transfiera suavemente los volúmenes de 50 mirolitros de células reagregadas al centro de una placa codificada por MAT de 24 pocillos. Coloque suavemente la placa en la incubadora multigás durante cuatro a seis horas hasta que las celdas estén conectadas. Después de cuatro a seis horas, para permitir que las células se adhieran, agregue lentamente un mililitro de medio HE recién preparado a cada pocillo.

Incubar las células en la incubadora multigás hasta que las células hematopéyicas sean visibles. A continuación, coseche los progenitores hematopéyicos definitivos retirando suavemente el medio HE de las células y pasándolo a través de un filtro celular de 40 micras para recoger el flujo. Para las células adherentes restantes, agregue 0,5 mililitros de 0,25% de tripsina EDTA a las células e incube en una incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Después de la tripsinización, agregue 0,5 mililitros de solución de parada a cada pocillo. Pase las células a través del mismo filtro de células de 40 micras para agrupar todas las células adherentes y no adherentes juntas y hacer girar las células. Agregue de 2.000 a 10.000 células aisladas de FACS a un pocillo de las células OP9 DL4 en medios OP9.

Incubar en una incubadora de 37 grados Celsius, 5% de CO2. Para pasar las células cada cuatro o cinco días, triture las células con una pipeta de un mililitro. Pase a través de un filtro de 40 micras para eliminar los grumos.

Después de la centrifugación, aspire el medio. Vuelva a suspender las células en dos mililitros de medios de células T frescas y colóquelas en células OP9 DL4 frescas. Después de al menos 21 días de cultivo en frío, triture las células vigorosamente y páselas a través de un filtro de 40 micras para eliminar los restos celulares.

Centrifugar a 330 x G durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante y luego continuar con la citometría de flujo estándar. La citometría de flujo muestra que los cultivos de diferenciación tratados con IWP2 producen una población distinta con CD34 positivo, CD43 negativo y CD34 CD43 positivo bajo. Mientras que los cultivos de diferenciación tratados con CHIR tienen menos del 1% de células positivas para CD43 en el octavo día de diferenciación.

Los progenitores hematopoyéticos primitivos derivados en condiciones de IWP2 aislados en el noveno día darán lugar a progenitores eritroides y mieloides predominantemente primitivos en los ensayos de metilcelulosa. La población CD34 positiva y CD43 negativa derivada del tratamiento CHIR99021 es una población heterogénea que contiene progenitores endoteliales, así como endotelio hemogénico CD34 positivo, CD43 negativo, CD73 negativo, CD184 negativo, que cuando se aísla mediante FACS inicialmente formará una monocapa de células similares al endotelio que luego experimenta una transición endotelial a hematopoyética que da como resultado un endotelio redondo, refractario, Células hematopoyéticas no adherentes. Estas células hematopoyéticas pueden ser evaluadas por citometría de flujo para la expresión de CD34 y CD45.

Los progenitores hematopoyéticos aislados de los ensayos EHT pueden utilizarse en ensayos de metilcelulosa y dan lugar a grandes unidades formadoras de colonias eritroides en forma de ráfaga, pequeñas unidades formadoras de colonias eritroides y progenitores mieloides. Estos análisis representativos de citometría de flujo del potencial de los ensayos CHIR99021 de linfocitos T de los progenitores hematopoyéticos CD34 positivos, CD43 negativos, CD73 negativos, CD184 negativos y CD34 positivos derivados de IWP2 y CD43 negativos muestran la presencia de una población CD45 positiva, CD56 negativa, CD4 positiva y CD8 positiva en progenitores derivados de CHIR indicativos del potencial hematopoyético dentro de la población CD34 positiva de entrada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar las células madre pluripotentes humanas hacia una cantidad primitiva o definitiva de progenitores hematopoyéticos.