Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas
10 de marzo de 2017
Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.
El objetivo general de este ensayo de linfocitos basado en fluorescencia es identificar nuevos inmunomoduladores de molécula pequeña. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre el mecanismo de activación e inhibición de los linfocitos. La principal ventaja de esta función fenotípica y de este ensayo es que puede adaptarse para el descubrimiento de fármacos.
El procedimiento será demostrado por Ahmed Fouda, un estudiante de posgrado de nuestro laboratorio. Bajo una campana de flujo laminar estéril, desinfecte el pelaje de un ratón hembra Nurr77 GFP de seis a ocho semanas de edad con etanol al 70%, y coloque al animal sobre su lado derecho. A continuación, realice una incisión en la piel y los músculos del cuadrante abdominal superior izquierdo, localice y extraiga el bazo, colocando el tejido en medio para esplenocitos sobre hielo.
Una vez que se hayan recolectado todos los bazo, transfiera los tejidos a una placa de cultivo celular de 10 centímetros cuadrados que contenga cinco mililitros de medio para esplenocitos precalentado, y utilice el émbolo de una jeringa estéril para machacar los tejidos hasta que la solución se vuelva turbia. Después de machacar extensamente en medio para esplenocitos, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrones hacia un tubo de 50 mililitros para eliminar cualquier resto, y centrifugue la suspensión resultante de células individuales. Re suspenda el sedimento en dos a tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos, deteniendo la reacción con cinco mililitros de RPMI, u otro tampón adecuado, después de 20 a 30 segundos.
Luego, recolecte las células mediante otra centrifugación y re suspenda el sedimento en dos mililitros de medio para esplenocitos para el conteo celular. Para aislar las células T, centrifugue las células nuevamente y re suspenda el sedimento en medio RPMI sin suero a una concentración de un veces 10 a la siete células por mililitro. Transfiera las células a un tubo de poliestireno de cinco mililitros y separe un alícuota de 100 microlitros de esplenocitos que se utilizará más adelante para la evaluación de pureza.
A continuación, agregue 50 microlitros por mililitro de suero de rata normal a las células, seguido por la adición de 50 microlitros por mililitro de una mezcla de anticuerpos para aislamiento de linfocitos T con mezclado suave. Después de 10 minutos, incube las células con microesferas magnéticas conjugadas con estreptavidina durante dos minutos y medio. Luego, agregue medio sin suero a las células para obtener un volumen final de dos mililitros y medio, y coloque el tubo en un imán para aislamiento celular durante tres minutos.
Al final de la incubación, manteniendo el tubo en el imán, vierta el sobrenadante en un nuevo tubo de poliestireno de una sola vez. Luego se pueden contar los linfocitos T. Siembre los linfocitos T en una placa de 96 pocillos con fondo redondo a una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta células por pocillo, conteniendo 200 microlitros de medio fresco para esplenocitos por pocillo.
Añada interleucina 7 recombinante y perlas magnéticas CD3/CD28 a los pozos adecuados y coloque la placa en un incubador de cultivo celular. Doce horas después, triture suavemente la suspensión celular en cada pozo para desagregar los agregados de células y perlas. Luego, transfiera las suspensiones celulares de cada pozo a tubos de poliestireno individuales de cinco mililitros.
Una vez que se hayan recolectado todas las células, coloque cada tubo de células en el imán de separación durante cinco minutos y vierta los sobrenadantes, mientras el tubo aún está dentro del imán, en nuevos tubos de poliestireno al final de cada incubación. Luego, recolecte las células mediante centrifugación y resuspenda los pellets en medio fresco de esplenocitos a una concentración de dos veces 10 a la sexta células por mililitro. Para la cribado de alto rendimiento con moléculas pequeñas, siembre 40 microlitros de células por pocillo en una placa de 384 pocillos y trate los pocillos apropiados con el fármaco o vehículo de elección durante el período de tratamiento deseado en el incubador de cultivo celular.
30 minutos antes del análisis de GFP, tiña las células con la concentración adecuada de solución de Hoechst, distribuyendo completamente el colorante mediante pipeteo suave. Una vez que todos los pocillos hayan sido teñidos, centrifugue las placas para recoger las células en el fondo de los pocillos y deje reposar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. Cargue la placa según las instrucciones del fabricante.
Luego, configure el objetivo a 40X o superior. Configure la cámara número cuatro para la lámpara UV y luego configure la cámara número uno para el láser 488. Cargue la placa en el sistema de cribado de alto contenido.
A continuación, configure el sistema automatizado de cribado confocal de alto contenido para leer de seis a diez campos por pocillo con dos lecturas secuenciales por campo, a 488 nanómetros y luz ultravioleta. Las células T positivas para CD3 representan aproximadamente el 30 % de un bazo de ratón determinado, mostrando una expresión basal de GFP del 10 %. Tras la estimulación con perlas del receptor de células T CD3/CD28, se observa un aumento de cinco a seis veces en el porcentaje de expresión de GFP.
Asimismo, las células B positivas para CD19 representan del 50 al 55 % de los esplenocitos totales, con una expresión basal de GFP similar a la de las células T no activadas. Curiosamente, la estimulación del receptor de células B mediante IgG, IgM anti-ratón y CD40L recombinante provoca solo un aumento trivial en la expresión de GFP. Tras el aislamiento con bolas magnéticas tal como se acaba de demostrar, las células T positivas para CD3 aisladas aún muestran una expresión basal de GFP del 10 %.
La estimulación con microesferas CD3/CD28, sin embargo, induce una regulación positiva significativa de la respuesta GFP. De manera similar, tras el aislamiento magnético de microesferas de células B, las células B activadas purificadas muestran una expresión mayor de GFP en comparación con las células B activadas en esplenocitos. En este experimento representativo, el cribado primario de alto rendimiento de 4398 compuestos reveló varios activadores e inhibidores de la activación de linfocitos T.
Pero la expresión observada de GFP en las células T estimuladas, 20 veces mayor que la medida en las células T no estimuladas. Esto permite generar una ventana de zona de acción en la que los compuestos inhibidores de GFP podrían detectarse fácilmente. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 36 a 48 horas si se realiza adecuadamente.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar contar las células después de cada paso. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA o inmunotransferencia para responder cualquier otra pregunta adicional. Esta técnica allanará el camino para el descubrimiento de fármacos y la inmunomodulación en roedores.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y activar células T o B derivadas de placas de ratón Nurr77 GFP.
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Descripción general
Este estudio presenta un ensayo novedoso basado en fluorescencia que utiliza linfocitos de un ratón transgénico, diseñado para la selección de alto rendimiento de moléculas pequeñas que puedan modular la activación de linfocitos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Descubrimiento de fármacos
- Biología celular
Antecedentes
- El ensayo se centra en la identificación de inmunomoduladores de moléculas pequeñas.
- Aborda preguntas clave sobre los mecanismos de activación de los linfocitos.
- El método es adaptable para aplicaciones en el descubrimiento de fármacos.
- La demostración del procedimiento es realizada por un estudiante de posgrado.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de cribado de alto rendimiento para inmunomoduladores.
- Mejorar la comprensión de la activación y la inhibición de los linfocitos.
- Proporcionar una plataforma para futuros esfuerzos de descubrimiento de fármacos.
Métodos Utilizados
- Desarrollo de ensayos basados en fluorescencia.
- Aislamiento de linfocitos de ratones transgénicos Nurr77 GFP.
- Selección de alto rendimiento de moléculas pequeñas.
- Análisis in vitro de la activación de linfocitos.
Resultados principales
- Identificación exitosa de moléculas pequeñas que modulan la función de los linfocitos.
- Se demostró la adaptabilidad del ensayo para el descubrimiento de fármacos.
- Proporcionó información sobre los mecanismos de activación de los linfocitos.
- Se estableció un método confiable para estudios inmunológicos futuros.
Conclusiones
- El ensayo basado en fluorescencia es una herramienta prometedora para la investigación en inmunología.
- Puede facilitar el descubrimiento de nuevos fármacos inmunomoduladores.
- El estudio contribuye a una comprensión más profunda de la biología de los linfocitos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El cribado fenotípico de alto rendimiento de la activación de linfocitos mediante un ensayo basado en fluorescencia permite la identificación rápida de pequeñas moléculas inmunomoduladoras sin una hipótesis predefinida sobre el blanco. Esta plataforma apoya el descubrimiento temprano de fármacos en inmunología y trasplante al proporcionar lecturas cuantitativas y escalables de las respuestas de células T y B. La adaptabilidad y el rendimiento del ensayo lo sitúan como una herramienta fundamental para la selección de carteras y la reducción de riesgos mecanicistas en las líneas de desarrollo de inmunomoduladores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la verificación de hipótesis inmunomoduladoras en linfocitos primarios mediante lecturas funcionales.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al cuantificar la activación y la inhibición en diversas bibliotecas de compuestos.
- Facilita la confianza predictiva en cribados independientes del blanco para identificar nuevos moduladores inmunes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona salidas cuantitativas estandarizadas basadas en GFP para la evaluación de compuestos de alto rendimiento.
- Asegura la reproducibilidad y escalabilidad mediante imágenes confocales automatizadas y formatos de múltiples pocillos.
- Prepara sistemas celulares validados para ensayos mecanicistas o secundarios posteriores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con vías inmunitarias relevantes para la enfermedad mediante la modelización de la activación de células T y B in vitro.
- Proporciona continuidad desde el cribado fenotípico hasta la validación in vivo de descubrimientos inmunomoduladores.
- Permite el avance ajustado al riesgo de candidatos basado en perfiles funcionales de modulación inmunitaria.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este ensayo de linfocitos basado en fluorescencia se integra en las etapas iniciales del descubrimiento y la identificación de compuestos prometedores, conectando el cribado fenotípico con el seguimiento mecanicista y la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la selección sin hipótesis previas y la aclaración de vías en la activación de células inmunitarias.
- Selección: Ofrece lecturas cuantitativas robustas para la evaluación de alto rendimiento de miles de compuestos.
- Análisis: Proporciona mediciones de intensidad de GFP para comparar estados de activación e identificar moduladores.
- Investigación Traducional: Facilita la selección de candidatos para estudios inmunológicos posteriores in vitro e in vivo.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a diversos tipos de células inmunitarias y bibliotecas de compuestos para aplicaciones amplias en carteras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el descubrimiento de inmunomoduladores.
- Valor operativo: Estandariza y acelera los flujos de trabajo de cribado mediante resultados escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir un triaje funcional temprano.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de candidatos inmunomoduladores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de linfocitos primarios y en imágenes de fluorescencia de alto contenido.
- Necesita acceso a plataformas automatizadas de cribado confocal e infraestructura analítica.
- Exige la estandarización entre equipos en la preparación de células y las condiciones del ensayo.
- Adaptable a diferentes subtipos de células inmunitarias y bibliotecas de compuestos mediante la optimización del protocolo.
- Depende de controles robustos de viabilidad y activación celular para una interpretación fiable de los datos.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Generation of Splenocyte Cell Suspension from Nur77GFP Mouse Spleens
2:07
T Cell Isolation from the Splenocyte Cell Suspension
3:26
T-cell Activation and the Induction of GFP Expression
4:42
High Throughput Screening of Small Molecule
6:05
Results: T and B Cell Receptors Activation Flowcytometry Results and a Representative T Cell HTS of Smal Molecules
7:56
Conclusion
