Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

El objetivo general de este ensayo de linfocitos basado en la fluorescencia es identificar nuevos inmunomoduladores de moléculas pequeñas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología sobre el mecanismo de activación e inhibición de los linfocitos. La principal ventaja de esta función fenotípica y ensayo, es que se puede adaptar para el descubrimiento de fármacos.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Ahmed Fouda, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Bajo una capucha de trabajo estéril, desinfecte el pelaje de una hembra de ratón Nurr77 GFP de seis a ocho semanas de edad con etanol al 70% y coloque al animal en su lado derecho. A continuación, realice una incisión en la piel y los músculos del cuadrante abdominal superior izquierdo, y localice y extraiga el bazo, colocando el tejido en el medio de los esplenocitos sobre hielo.

Cuando se hayan recolectado todos los bazos, transfiera los tejidos a una placa de cultivo celular de 10 centímetros cuadrados que contenga cinco mililitros de medio de esplenocitos precalentado y use un émbolo de jeringa estéril para triturar los tejidos hasta que la solución esté turbia. Después de una maceración extensa en medio de esplenocitos, filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micras en un tubo de 50 mililitros para eliminar cualquier residuo y centrifugar la suspensión celular individual resultante. Vuelva a suspender el pellet en dos o tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos, empapando la reacción con cinco mililitros de RPMI, u otro tampón adecuado, después de 20 a 30 segundos.

A continuación, recoja las células con otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio esplenocitario para el recuento de células. Para aislar las células T, centrifugar las células nuevamente y resuspender el pellet en medio RPMI libre de suero a una concentración de una vez 10 a las siete células por mililitro. Transfiera las células a un tubo de poliestireno de cinco mililitros y reserve una alícuota de esplenocitos de 100 microlitros para usarla posteriormente para la evaluación de la pureza.

A continuación, agregue 50 microlitros por mililitro de suero de rata normal a las células, seguido de la adición de 50 microlitros por mililitro de cóctel de anticuerpos de aislamiento de células T con una mezcla suave. Después de 10 minutos, incubar las células con perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina durante dos minutos y medio. A continuación, añada medio libre de suero a las células para obtener un volumen final de dos mililitros y medio, y coloque el tubo en un imán de aislamiento celular durante tres minutos.

Al final de la incubación, sosteniendo el tubo en el imán, vierta el sobrenadante en un nuevo tubo de poliestireno de una sola vez. A continuación, se pueden contar las células T. Siembre las células T en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a una concentración de 2,5 veces 10 a la quinta célula por pocillo, que contiene 200 microlitros de medio de esplenocito fresco por pocillo.

Agregue interleucina recombinante 7 y perlas magnéticas CD3/CD28 a los pocillos apropiados y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular. 12 horas después, triture suavemente la suspensión celular en cada pocillo para romper los agregados de células de perlas. A continuación, transfiera las suspensiones celulares de cada pocillo a tubos individuales de poliestireno de cinco mililitros.

Cuando se hayan recogido todas las células, coloque cada tubo de células en el imán de separación durante cinco minutos a la vez, y decante los sobrenadantes cuando el tubo aún esté dentro del imán, en nuevos tubos de poliestireno al final de cada incubación. A continuación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en medio de esplenocitos frescos a concentraciones de dos veces 10 a la sexta célula por mililitro. Para el cribado de moléculas pequeñas de alto rendimiento, coloque 40 microlitros de células por pocillo en una placa de 384 pocillos y trate los pocillos adecuados con el fármaco o vehículo de elección para el período de tratamiento deseado en la incubadora de cultivo celular.

30 minutos antes del análisis de GFP, tiñir las células con la concentración adecuada de solución de Hoechst, distribuyendo completamente la tinción con un pipeteo suave. Cuando se hayan teñido todos los pocillos, centrifuga las placas para recoger las células en el fondo de los pocillos y deja que las células descansen durante 15 minutos a temperatura ambiente. Cargue la placa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A continuación, establezca el objetivo en 40X o superior. Establezca la cámara número cuatro para la lámpara UV y, a continuación, establezca la cámara número uno para el láser 488. Cargue la placa en el sistema de cribado de alto contenido.

A continuación, configure el sistema automatizado de cribado confocal de alto contenido para leer de seis a 10 campos por pocillo con dos lecturas secuenciales por campo, a 488 nanómetros y luz ultravioleta. Los linfocitos T CD3 positivos representan aproximadamente el 30% del bazo de un ratón, lo que demuestra una expresión de GFP basal del 10%. Después de la estimulación de las perlas del receptor de células T CD3/CD28, se observa un aumento de cinco a seis veces en el porcentaje de expresión de GFP.

Asimismo, los linfocitos B CD19 positivos representan entre el 50 y el 55% del total de esplenocitos con una expresión basal de GFP similar a la de los linfocitos T no activados. Curiosamente, la estimulación del receptor de células B utilizando IgG anti-ratón, IgM y CD40L recombinante, desencadena solo un aumento trivial en la expresión de GFP. Después del aislamiento magnético de las perlas, como se acaba de demostrar, las células T CD3 positivas aisladas todavía muestran una expresión de GFP basal del 10%.

Sin embargo, la estimulación de las perlas CD3/CD28 induce una regulación positiva significativa de la respuesta de GFP. De manera similar, después del aislamiento de perlas magnéticas de las células B, las células B activadas purificadas exhiben una mayor expresión de GFP en comparación con las células B activadas en los esplenocitos. En este experimento representativo, el cribado primario de alto rendimiento de 4398 compuestos reveló varios activadores e inhibidores de la activación de las células T.

Pero la expresión observada de GFP de las células T estimuladas fue 20 veces mayor que la medida para las células T no estimuladas. Permitiendo la generación de una zona de ventana de acción donde los compuestos inhibidores de GFP podrían ser fácilmente detectados. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 36 a 48 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar contar las celdas después de cada paso. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ELISA o Western blot para responder cualquier otra pregunta adicional. Esta técnica allanará el camino para el descubrimiento de fármacos inmunomoduladores en roedores.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y activar las células T o B derivadas de las placas de ratón Nurr77 GFP.