Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar la remodelación del cerebro en condiciones hiperglucémicas y seguir las moléculas radiomarcadas en el pez cebra. La hiperglucemia se caracteriza por una concentración excesiva de glucosa en sangre. La hiperglucemia crónica puede deberse a condiciones diabéticas y causa diferentes disfunciones vasculares, que a su vez pueden desencadenar complicaciones clínicas, como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o úlceras del pie diabético.

Además, la hiperglucemia aguda debida al estrés puede promover complicaciones hemorrágicas en el accidente cerebrovascular isquémico. El pez cebra es un modelo interesante para comprender las enfermedades humanas y su impacto en el sistema nervioso central. Es particularmente cierto, dado que el cerebro de los peces adultos muestra una intensa capacidad neurogénica y una capacidad sobresaliente para los mecanismos de reparación cerebral, en comparación con los mamíferos, por lo tanto, el pez cebra representa un buen modelo para investigar la remodelación cerebral, después del estrés en condiciones agudas e hiperglucémicas.

También permite investigar la biodistribución de moléculas radiomarcadas y potenciales agentes terapéuticos. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la comunidad francesa y europea para el uso de animales en la investigación, y fueron aprobados por el comité de ética local para la experimentación animal. Atrapa un pez suavemente con una red.

Poner el pez en un pequeño volumen de anestésico tricaína, diluido a una concentración final de 0,02% en el agua. Espera hasta que el pez deje de moverse. Retire el pescado, con una pipeta cortada, y colóquelo suavemente sobre papel de seda absorbente para eliminar un máximo de agua.

Pesar el pescado con el fin de preparar una jeringa de d-glucosa para inyección, de 50 microlitros de 2,5 gramos por kilo de peso corporal. Por ejemplo, un pez de 0,6 gramos recibirá 50 microlitros de una solución de PBS con 3% de glucosa d. Coloque el pez sobre su espalda y manténgalo con una mano.

Con la otra mano, inserte la aguja de la jeringa en la cavidad intraperitoneal e inyecte lentamente la solución de d-glucosa PBS. Retire la aguja y vuelva a colocar el pez en el agua de los peces. Revisa al pez hasta que se recupere por completo.

Sus niveles de glucosa en la sangre generalmente se miden después de 1 1/2 horas. Para imitar la hiperglucemia crónica, prepare un tanque de dos litros de d-glucosa, a una concentración final de 111 milimolares. Para ello, pesa 40 gramos de d-glucosa y ponlo en un tanque vacío.

Llene el tanque con dos litros de agua para peces y coloque hasta siete peces en él. Cambie la solución de glucosa cada dos días, para evitar el crecimiento de bacterias u otros microorganismos. La hiperglucemia crónica se obtiene mediante un tratamiento de 14 días con d-glucosa.

Atrapa un pez con una red y ponlo en hielo. Cubra el pescado con hielo para una eutanasia rápida. Toma el pez y límpialo, con el fin de eliminar cualquier gota de agua que pueda diluir las muestras de sangre.

Extirpar un ojo con pinzas de disección y esperar hasta que la cavidad ocular esté llena de sangre. Coloque una tira reactiva en el glucómetro e insértela en la cavidad ocular. Observe el valor de la concentración de glucosa en sangre.

Para la hiperglucemia aguda, una inyección intraperitoneal de d-glucosa induce un aumento significativo en los niveles de glucosa en sangre, como se muestra, 1 1/2 horas después de la inyección. Para la hiperglucemia crónica, la inmersión de peces en una solución de d-glucosa da como resultado un aumento significativo en los niveles de glucosa en sangre, como se muestra después de 14 días de tratamiento. Al final del procedimiento, separe el cuerpo de la cabeza con tijeras de disección y coloque la cabeza en un 4% de paraformaldehído, diluido en PBS para experimentos de inmunohistoquímica.

Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Alternativamente, el cerebro puede extraerse directamente y congelarse para otros experimentos, como la extracción de ARNm. Al día siguiente, las cabezas fijas se enjuagan con PBS y se mantienen con una aguja bajo un microscopio de disección.

Se extrae el ojo restante y se abre suavemente la parte superior del cráneo con fórceps. A continuación, se extrae cuidadosamente el cerebro y se coloca en 1x PBS. Los cerebros fijos se deshidratan paso a paso, en una serie de concentraciones crecientes de etanol, seguidas de dos baños de tolueno de 30 minutos.

A continuación, los cerebros se colocan en un casete de incrustación y la tapa se cierra cuidadosamente. Ponga el casete en parafina derretida, a 58 a 60 grados centígrados. Durante la inclusión de parafina en el cerebro, encienda las pinzas de inclusión de calentamiento.

Coloque el casete en un baño de parafina limpio. Al final de los baños de parafina, saque el casete. Vierte un poco de parafina líquida en un molde.

Abra el casete y coloque el cerebro dentro de la parafina derretida en el molde. Oriente el cerebro con las pinzas de inclusión de calentamiento. Llene el molde con parafina derretida y deje que se endurezca en la parte de enfriamiento de la máquina de incrustación.

Por razones técnicas, el cerebro debe colocarse de acuerdo con un eje antero-posterior. Después de desmoldar el bloque de parafina, recórtelo y fíjelo en un casete con parafina derretida, en la orientación correcta para permitir el corte transversal. Inserte el bloque de parafina en el brazo de un micrótomo y corte secciones de 50 micrómetros, hasta alcanzar el nivel de la muestra de cerebro.

Luego, recorte el bloque de parafina para obtener un trapecio y ajuste el grosor de la sección a siete micrómetros. Recoja las cintas de parafina con un pincel fino y colóquelo sobre un papel negro. Corta las cintas de parafina cada tres o cuatro secciones.

Coloque un portaobjetos en una placa calentadora y cúbralo con agua destilada. Coloque suavemente las secciones sobre el agua en el tobogán y caliente hasta 40 grados centígrados. Cuando las cintas de parafina estén suficientemente extendidas, retire el agua con un pañuelo absorbente.

Las últimas gotas se eliminan mecánicamente, como se muestra. Deje que el portaobjetos se seque al menos dos horas antes de realizar el procedimiento de inmunohistoquímica descrito en el protocolo. Después de la inmunohistoquímica, los portaobjetos se analizan bajo un microscopio de epifluorescencia, o un microscopio confocal, para estudiar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación de células cerebrales.

La cuantificación de las células cerebrales se realiza en al menos tres secciones sucesivas, o en una región de interés. Aquí, las células proliferativas correspondientes a las células PCNA positivas aparecen en verde. Como se puede ver, la hiperglucemia crónica induce una disminución en el número de células proliferativas, marcadas en verde con el anticuerpo PCNA, en el telencéfalo ventral, el telencéfalo dorsal y el hipotálamo caudal, alrededor del receso lateral y posterior.

Alternativamente, para estudiar los efectos de la hiperglucemia en la neurogénesis inducida por la lesión, se puede realizar una lesión por puñalada del telencéfalo durante el tratamiento de hiperglucemia crónica. Para ello, anestesia a un pez tratado durante siete días y lo somete a un microscopio de disección. Empuje una jeringa de calibre 30 verticalmente a través del cráneo, hacia el centro del hemisferio teleencefálico derecho.

Después de este procedimiento, el pez debe ser devuelto a su tanque durante el tiempo requerido. Aquí, se permitió que los peces sobrevivieran siete días en agua con d-glucosa, antes de ser sacrificados. La herida por arma blanca del telencéfalo regula fuertemente la proliferación en el hemisferio lesionado, siete días después de la lesión.

Nuestros datos muestran que la hiperglucemia crónica induce una disminución significativa en los procesos de curación del cerebro, al disminuir la proliferación celular después de la lesión por herida de arma blanca del telencéfalo. El pez cebra también se puede utilizar para estudiar la biodistribución de moléculas radiomarcadas. Aquí, decidimos estudiar el metabolismo de la glucosa en el organismo del pez cebra.

Primero se debe anestesiar al pez y colocarlo sobre un pañuelo empapado con anestésicos. A continuación, el pez se coloca detrás de una ventana de protección de radio. Se prepara la jeringa que contiene 50 microlitros de fluorodesoxiglucosa.

El pez se coloca boca arriba y se inyecta intraperitonealmente con 50 microlitros de FDG a 20 megabecquerel. A continuación, el pez se coloca sobre otro pañuelo empapado con anestésicos. Se envuelve suavemente y se coloca en el brazo de un generador de imágenes de escaneo PET.

El brazo se inserta en la tomografía por emisión de positrones y se realiza el procedimiento de diagnóstico por imágenes. Aquí, puede notar que la FDG no solo se detecta en el lugar de la inyección, sino también en la cabeza del pez, en particular, en el cerebro y a lo largo de toda la médula espinal. En este estudio, proporcionamos dos métodos diferentes para establecer la hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra, y demostramos que la hiperglucemia afecta la proliferación de células cerebrales en condiciones normales e inducidas por lesiones.

En conclusión, el pez cebra puede ser utilizado como un modelo relevante para investigar los efectos deletéreos de la hiperglucemia en el sistema nervioso central. También permite evaluar la biodistribución de moléculas radiomarcadas mediante PET.