Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar la remodelación cerebral en condiciones de hiperglucemia, y seguir moléculas marcadas con radioisótopos en pez cebra. La hiperglucemia se caracteriza por una concentración excesiva de glucosa en sangre. La hiperglucemia crónica puede deberse a condiciones diabéticas y provoca diversas disfunciones vasculares, que a su vez pueden desencadenar complicaciones clínicas, como infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o úlceras diabéticas en el pie.

Asimismo, la hiperglucemia aguda debida al estrés puede promover complicaciones hemorrágicas en el accidente cerebrovascular isquémico. El pez cebra es un modelo interesante para comprender las enfermedades humanas y su impacto en el sistema nervioso central. Esto es particularmente cierto dado que el cerebro de los peces adultos muestra una capacidad neurogénica intensa y una capacidad excepcional para los mecanismos de reparación cerebral en comparación con los mamíferos; por lo tanto, el pez cebra representa un buen modelo para investigar la remodelación cerebral tras el estrés bajo condiciones agudas e hiperglucémicas.

Asimismo, permite investigar la biodistribución de moléculas marcadas con radioisótopos y agentes terapéuticos potenciales. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices francesas y de la comunidad europea sobre el uso de animales en la investigación, y fueron aprobados por el comité local de ética para la experimentación animal. Capture un pez suavemente con una red para pescar.

Coloque el pez en un pequeño volumen de anestésico tricaina, diluido a una concentración final de 0,02 % en el agua. Espere hasta que el pez deje de moverse. Retire el pez utilizando una pipeta cortada y colóquelo suavemente sobre papel absorbente para eliminar la mayor cantidad posible de agua.

Pese el pez para preparar una jeringa con d-glucosa para inyección, con 50 microlitros de 2,5 gramos por kilo de peso corporal. Por ejemplo, un pez de 0,6 gramos recibirá 50 microlitros de una solución de PBS con 3% d-glucosa. Coloque el pez boca arriba y sosténgalo con una mano.

Con la otra mano, inserte la aguja de la jeringa en la cavidad intraperitoneal e inyecte lentamente la solución de PBS con d-glucosa. Retire la aguja y devuelva el pez al agua para peces. Observe al pez hasta que se recupere completamente.

Sus niveles de glucosa en sangre generalmente se miden después de 1 1/2 horas. Para imitar la hiperglucemia crónica, prepare un tanque de dos litros de d-glucosa, con una concentración final de 111 milimolar. Para ello, pese 40 gramos de d-glucosa y colóquelos en un tanque vacío.

Llene el tanque con dos litros de agua para peces y coloque hasta siete peces en él. Cambie la solución de glucosa cada dos días para evitar el crecimiento de bacterias u otros microorganismos. Se obtiene hiperglucemia crónica mediante un tratamiento de 14 días con d-glucosa.

Capture un pez con una red, y colóquelo sobre hielo. Cubra el pez con hielo para una eutanasia rápida. Tome el pez y séquelo para eliminar cualquier gota de agua que pudiera diluir las muestras de sangre.

Retire un ojo con pinzas de disección y espere hasta que la cavidad ocular se llene de sangre. Coloque una tira reactiva en el glucómetro e inserte la tira en la cavidad ocular. Anote el valor de la concentración de glucosa en sangre.

Para la hiperglucemia aguda, una inyección intraperitoneal de d-glucosa induce un aumento significativo en los niveles de glucosa en sangre, como se muestra 1 1/2 horas después de la inyección. Para la hiperglucemia crónica, la inmersión de los peces en una solución de d-glucosa provoca un aumento significativo en los niveles de glucosa en sangre, como se observa tras 14 días de tratamiento. Al final del procedimiento, separe el cuerpo de la cabeza con tijeras de disección y coloque la cabeza en paraformaldehído al 4 %, diluido en PBS, para experimentos de inmunohistoquímica.

Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Alternativamente, el cerebro puede extraerse directamente y congelarse para otros experimentos, como la extracción de ARNm. Al día siguiente, las cabezas fijadas se lavan con PBS y se mantienen con una aguja bajo un microscopio estereoscópico.

Se extrae el ojo restante y se abre suavemente la parte superior del cráneo con pinzas. Luego se extrae cuidadosamente el cerebro y se coloca en PBS 1x. Los cerebros fijados se deshidratan de forma progresiva mediante una serie de concentraciones crecientes de etanol, seguidas de dos baños de tolueno de 30 minutos cada uno.

Los cerebros se colocan luego en una cassette de inclusión y la tapa se cierra cuidadosamente. Coloque la cassette en parafina fundida, a 58-60 grados celsius. Durante la inclusión del cerebro en parafina, encienda la pinza de inclusión con calentamiento.

Coloque la caja en un baño limpio de parafina. Al finalizar los baños de parafina, saque la caja. Vierta un poco de parafina líquida en un molde.

Abra la cápsula y coloque el cerebro dentro de parafina fundida en el molde. Oriente el cerebro con las pinzas térmicas para inclusión. Llene el molde con parafina fundida y déjelo endurecer en la zona de enfriamiento de la inclusora.

Por razones técnicas, el cerebro debe colocarse según un eje anterior-posterior. Después de desmoldar el bloque de parafina, córtele y fíjelo en una cassette con parafina fundida, en la orientación correcta para permitir el corte transversal. Inserte el bloque de parafina en el brazo de un microtomo y corte secciones de 50 micrómetros hasta alcanzar el nivel de la muestra cerebral.

Luego, recorte el bloque de parafina para obtener un trapecio y ajuste el grosor de corte a siete micrómetros. Recoja las cintas de parafina con un pincel fino y colóquelas sobre un papel negro. Corte las cintas de parafina cada tres o cuatro secciones.

Coloque un portaobjetos en una placa calefactora y cúbralo con agua destilada. Coloque suavemente las secciones sobre el agua del portaobjetos y caliente hasta 40 grados celsius. Cuando las tiras de parafina se hayan extendido suficientemente, retire el agua con papel absorbente.

Se eliminan mecánicamente las últimas gotas, como se muestra. Deje secar la preparación durante al menos dos horas antes de realizar el procedimiento de inmunohistoquímica descrito en el protocolo. Después de la inmunohistoquímica, las preparaciones se analizan bajo un microscopio de epifluorescencia o confocal, para estudiar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación celular cerebral.

La cuantificación de células cerebrales se realiza en al menos tres secciones sucesivas o en una región de interés. Aquí, las células proliferativas correspondientes a células positivas para PCNA aparecen en verde. Como puede observarse, la hiperglucemia crónica induce una disminución en el número de células proliferativas, marcadas en verde con el anticuerpo contra PCNA, en el telencéfalo ventral, el telencéfalo dorsal y el hipotálamo caudal, alrededor del receso lateral y posterior.

Alternativamente, para estudiar los efectos de la hiperglucemia sobre la neurogénesis inducida por lesión, se puede realizar una lesión por punción en el telencéfalo durante un tratamiento crónico de hiperglucemia. Para ello, anestesie un pez tratado durante siete días y colóquelo bajo un microscopio de disección. Introduzca verticalmente una jeringa de calibre 30 a través del cráneo, hasta el centro del hemisferio telencefálico derecho.

Después de este procedimiento, el pez debe devolverse a su tanque durante el tiempo requerido. Aquí, se permitió al pez sobrevivir siete días en agua con d-glucosa antes de sacrificarlo. La lesión por herida punzante del telencéfalo aumenta fuertemente la proliferación en el hemisferio lesionado, siete días después de la lesión.

Nuestros datos muestran que la hiperglucemia crónica induce una disminución significativa en los procesos de curación cerebral, al reducir la proliferación celular tras una lesión por punción en el telencéfalo. Los peces cebra también pueden utilizarse para estudiar la biodistribución de moléculas marcadas con radioisótopos. Aquí, decidimos estudiar el metabolismo de la glucosa en el organismo del pez cebra.

Primero, el pez debe ser anestesiado y colocado sobre un tejido empapado con anestésicos. Luego, el pez se coloca detrás de una ventana de protección radiológica. Se prepara la jeringa que contiene 50 microlitros de fluorodesoxiglucosa.

El pez se coloca boca arriba e inyecta por vía intraperitoneal 50 microlitros de FDG a 20 megabecquerel. Luego, el pez se coloca sobre otro tejido empapado con anestésicos. Se envuelve suavemente y se posiciona sobre el brazo de un escáner de tomografía por emisión de positrones.

El brazo se inserta en el escáner de PET y se realiza el procedimiento de imagen. Aquí, puede observarse que la FDG no solo se detecta en el sitio de inyección, sino también en la cabeza del pez, notablemente en el cerebro, y a lo largo de toda la médula espinal. En este estudio, proporcionamos dos métodos diferentes para establecer hiperglucemia aguda y crónica en pez cebra, y demostramos que la hiperglucemia afecta la proliferación de células cerebrales en condiciones normales y en condiciones inducidas por lesión.

En conclusión, el pez cebra puede utilizarse como un modelo relevante para investigar los efectos perjudiciales de la hiperglucemia en el sistema nervioso central. También permite evaluar la biodistribución de moléculas marcadas con radioisótopos mediante escáner PET.