Name: Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende el método de muestreo con hisopo de macroespuma para detectar norovirus en superficies ambientales. Esta técnica mejora la recuperación viral y permite evaluar la dinámica de contaminación durante brotes.

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Los autores no tienen agradecimientos.

1. torunda de muestreo en el campo <ol><li> Use un par de guantes limpios. </li><li> Medir el tamaño de la zona de muestreo sin tocar la superficie usando una cinta de medición o una regla. Tratar de estimar el área con la mayor precisión posible y llenar un formulario de informe (Cuadro 1). </li><li> Compruebe el kit de raspado de posibles fugas y bolsas de transporte de muestras de etiquetas y kits de hisopos. </li><li> Mueva el hisopo por el área de muestreo como sigue: un golpe en la dirección horizontal, de un solo golpe en la dirección vertical, y un golpe en una dirección diagonal. No limpie un área superficial mayor que 700 cm 2. </li><li> Coloque cada hisopo en un tubo y apretar bien la tapa. </li></ol> 2. Almacenamiento y Transporte de hisopos al laboratorio <ol><li> Mantenga hisopos a 4 ° C durante un máximo de 48 h. Si se requiere el almacenamiento durante periodos más largos, almacenar los hisopos a -20 ° C (-70 ° C o). </li><li> Mantener los tubos a 0-4 ° C (es decir,. , Utilizar bolsas de hielo) en un recipiente aislado durante el transporte al laboratorio y se envían dentro de las 24-48 horas de la recolección. </li></ol> 3. La concentración de virus, el ARN viral Extracción y Purificación NOTA: Todos los pasos de centrifugación usar una centrífuga de mesa a 5.000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Tenga mucho cuidado cuando se trabaja con el tampón universal de extracción de ácidos nucleicos (UNEX). Use gafas o careta. <ol><li> Etiquetar un tubo de 15 ml y una columna de ARN Midi para cada muestra. Incluir un control negativo de extracción en cada experimento. </li><li> Para preparar la solución de lisis durante 10 hisopos, mezclar 25 ml de tampón de UNEX con 25 ml de PBST (PBS pH 7,2 que contiene 0,02% de Tween-80). </li><li> Añadir 50 l de suspensión de colifago MS2 (10 6 PFU / l) a 50 ml de solución de lisis. </li><li> Coloque una torunda en un tubo de 15 ml y añadir 5 ml de solución de lisis. Mezclar e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li>Añadir 5 ml de etanol 100% a cada tubo y agitar durante 10 s. </li><li> Retire cuidadosamente el hisopo del tubo de 15 ml (que contiene tampón UNEX) presionando suavemente contra el lado del tubo para eliminar el exceso de líquido y luego desechar el hisopo. Los volúmenes restantes deben ser de entre 9-10 ml. </li></ol> 4. Columna Midi Viral Nucleic Acid Extracción <ol><li> Transferir cuidadosamente 4.5 / mezcla de etanol ml UNEX desde el paso 3.6 en una columna de midi, centrifugar y desechar el filtrado. </li><li> Cargar otros 4,5 ml de la misma mezcla en la misma columna, se centrifuga, y desechar el filtrado. </li><li> Para el primer lavado, añadir 3,5 ml de etanol al 70% en la región de Midi columna, centrifugar y desechar el filtrado. </li><li> Para el segundo lavado, añadir otros 3,5 ml de etanol al 70% sobre la columna de Midi. Centrífuga y desechar el filtrado. </li><li> Para el seco-spin, centrifugar las columnas Midi para eliminar todos los restos de etanol (que puede afectar negativamente a su recuperación de ARN viral). </li><li>Colocar la columna de Midi en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 250 l de tampón de elución en la columna de Midi; esperar a 1 min antes de la centrifugación para obtener la mayor recuperación de ARN viral. </li><li> Almacenar el ácido nucleico extraído a -70 ° C o proceder inmediatamente al paso 5. </li></ol> 5. La concentración de ácido nucleico viral utilizando ARN Clean y Concentrador Kits <ol><li> Añadir 500 l de tampón de unión de ARN a 250 l de ARN eluido en el paso 4.7 anterior y agitar durante 10 s. </li><li> Añadir 750 l de etanol 100% y agitar durante 10 s. </li><li> Etiquetar una columna de giro para cada muestra. Cargar la muestra de 750 l en una columna de centrifugado. </li><li> Centrifugar las columnas de centrifugación a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo. </li><li> Cargar los 750 l restantes sobre una columna de centrifugación y se centrifuga a 12.000 xg durante 1 min. </li><li> Para el pre-lavado, añadir 400 l de tampón RNA Prep a cada columna de centrifugación y centrifugar a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo. </li><li> Para el primer lavado, añadir 800 l de ARN tampón de lavado a cada columna de centrifugación y se centrifuga a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo. </li><li> Para el segundo lavado, añadir 400 l de tampón de lavado de ARN para hacer girar la columna y se centrifuga a 12.000 xg durante 1 min. Descartar el flujo continuo. </li><li> Para el seco-spin, centrifugar la columna de centrifugación para eliminar todos los restos de tampón de lavado a 12.000 xg durante 2 min. </li><li> Transferir cuidadosamente la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. </li><li> Añadir tampón de elución de 25 l en la columna de centrifugación y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente. Esto aumentará la recuperación del ARN viral de la columna. </li><li> Recoger ARN por centrifugación la columna de centrifugación a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> O bien proceder directamente a RT-qPCR (paso 6) o tienda de ARN a -70 ° C. </li></ol> 6. Mutiplex RT-qPCR Detección de Genogrupo I y II Los norovirus, y colifago MS 2 (Cuadro 2) <ol><li> superficies de trabajo limpias, pipeteeES, y centrífugas con RNasa solución de descontaminación para reducir la posible contaminación. </li><li> Descongelar los reactivos RT-qPCR en hielo. ARN deshielo en hielo (en un área / habitación separada). </li><li> Determinar el número de reacciones y añadir al menos un 10% más de ellos (por ejemplo, si se necesitan 10 reacciones, que mezcla maestra de 11). </li><li> Vortex componentes de la mezcla maestra individuales, a excepción de 25x enzima RT-qPCR, durante 5 s. Mezclar con cuidado la enzima con un movimiento rápido del tubo con un dedo. </li><li> Brevemente componentes de la mezcla centrífuga maestros para 5 s. </li><li> Preparar la mezcla maestra para la detección en tiempo real de RT-PCR de GI norovirus y GII de acuerdo con las instrucciones del kit y añadir cebadores y sondas de oligonucleótidos de norovirus específico en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga (Tabla 3). </li><li> Mezclar la mezcla maestra pipeteando 5-10 veces arriba y abajo (no se recomienda agitación). Alícuota de 22 l de la mezcla maestra en cada pocillo de PCR en tiempo real placa de 96 pocillos. </li><li> Vortex ARN de la muestradurante 5 segundos, y cobrar por breve (5 s) centrifugación. </li><li> Añadir 3 l de muestra de RNA y GI y GII controles positivos a la placa de RT-qPCR (siga la plantilla de la Tabla 2). Añadir 3 l de nucleasa freewater en los pozos sin molde y controles (NTC). </li><li> Sellar la placa en tiempo real con película adhesiva óptica. </li><li> centrifugar con cuidado la placa en tiempo real en 1300 xg durante 1 min para eliminar las burbujas de aire o las gotas de líquido que pueden estar presentes en los pocillos. </li><li> Establecer un instrumento en tiempo real PCR y de establecimiento de las siguientes condiciones de termociclado: 1) etapa de RT durante 10 min. a 45 ° C (2) la activación de Taq polimerasa, 10 min. a 95 ° C y (3) 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, y 60 s a 60 ° C. </li></ol> 7. La cuantificación de norovirus en muestras de frotis <ol><li> Comprobar los resultados de los controles positivos y negativos para validar los resultados de RT-qPCR (Tabla 3). </li><li> Determina si cada curva estándar se encuentra con elLos valores aceptables dan en la tabla complementaria 2 y calcular la desviación estándar global para la curva estándar utilizando la Ecuación 1. (Ecuación 1)% de eficiencia = 100 x 10 (promedio de valores de Ct-Intercepción) / pendiente. </li><li> Si el software termociclador de PCR no calcula la pendiente de cada curva patrón, determinar la pendiente y los valores R 2 de la regresión utilizando el software estadístico (por ejemplo, Excel, SPSS o SAS). Además, se calcula el% de eficiencia para las curvas de calibración siguiente ecuación I </li><li> Registre el número de copias de ARN calculado por el software termociclador para todas las muestras de prueba en base a las curvas de calibración que cumplen los criterios especificados en la Tabla 4 complementario. Vuelva a ejecutar ninguna de las muestras con las curvas de calibración t sombrero no cumplen con los criterios o tienen controles positivos falsos. Comprobar los valores de Ct de colifago MS2, que se añadió como un control interno para controlar la inhibición de la PCR. </li><li> Determinar el número total de copias de ARN pmuestra er por la multiplicación del número de copias de ARN calculada en la etapa 7.2 por la relación del volumen (25 a 50 l) de eluyente de ARN total a la del ARN (3-5 l) utilizado para la reacción RT-qPCR. Alternativamente, el cálculo de la densidad de RNA dividiendo el número total de copias de ARN por el área de superficie del objeto (cm 2) analizada. </li></ol> 8. El genotipado de muestras en tiempo real RT-PCR positivos por Hemi anidada amplificación por PCR convencional <ol><li> Preparar la primera ronda de mezcla maestra para cada conjunto de cebadores de la RT-PCR ensayo (que complementa los cuadros 2 y 5). </li><li> Añadir 5 l de ARN norovirus positiva a 20 l de mezcla maestra. </li><li> Ejecutar la RT-PCR en las siguientes condiciones: (1) RT paso durante 30 min a 42 ° C (2) la activación de Taq polimerasa, 15 min a 95 ° C, y (3) 40 ciclos de 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C y 60 seg a 72 ° C. Después de 40 ciclos, se incuba durante 10 min adicionales a 72 ° C. </li><li>Preparar la segunda ronda de mezcla mater para cada conjunto de cebadores de la RT-PCR ensayo (que complementa los cuadros 2 y 5). </li><li> Añadir 23 l maestro de la mezcla y añadir 2 l de productos de primera ronda de RT-PCR (de primera ronda) a cada tubo (lo ideal es el producto de primera ronda debe ser diluido 1/10 en agua libre de RNasa). </li><li> Repita el paso 8.3. </li><li> Preparar un gel de agarosa al 2% en EDTA 100 ml 1x Tris-acetato (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, y EDTA 1 mM, a pH 8,3). Después de disolver de agarosa por calentamiento de la mezcla en un horno de microondas, añadir 10 l de colorante de ácidos nucleicos por 100 ml de gel preparado después de enfriar la mezcla a 60-70 ° C, se vierte el gel e insertar los peines. Deje que el gel se conforme con al menos 30 minutos. </li><li> Mezclar 15 l de cada producto de RT-PCR con 3 l de colorante de carga 6x. Cargar 15 l de cada muestra y a electroforesis el gel de agarosa a 100 V durante 1 h. </li><li> fragmentos objetivo Impuestos Especiales RT-PCR de tamaño apropiado (330 pb para GI y 341 pb para GII) a partir de un gel de lad purificar ARN usando un kit de extracción de gel comercial. El producto de PCR purificado se puede utilizar ahora para la secuenciación de Sanger. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses contradictorios. Los hallazgos y conclusiones de este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

Los norovirus tienen una dosis infecciosa humana 50% entre 18 y 10 3 20 partículas de virus. Por lo tanto, incluso la contaminación de bajo nivel de las superficies puede suponer un riesgo para la salud pública. Se evaluaron varios aspectos del protocolo de muestreo hisopo incluyendo: 1) diferentes materiales de hisopo, 2) hisopos de condiciones de almacenamiento durante el transporte, 3) la concentración de ARN viral, y 4) colífagos MS2 como el control de la extracción interna. <p...

<html> Norovirus humanos son una causa principal de la epidemia y la gastroenteritis aguda esporádica en todo el mundo 1, 2, 3. El virus es muy contagioso y la transmisión ocurre a través de la interacción persona directa a persona o indirectamente por contacto con alimentos contaminados, agua o superficies ambientales. Los norovirus se pueden desprender durante períodos prolongados y prolongan la supervivencia del virus en las superficies ambientales se ha documentado 1, 2, 3. Durante derramamiento pico, miles de millones de partículas de virus son liberadas por gramo de heces, y vómito también contiene un número suficiente de partículas virales para causar la infección 4, 5, 6, 7, 8,ef &quot;&gt; 9, 10. Además, la transferencia del virus entre las superficies inanimadas y la piel humana puede ocurrir fácilmente 2, 11, 12. Por lo tanto, el control de la contaminación ambiental puede ayudar en la investigación de brotes y en la evaluación de la eficacia de la limpieza y procedimientos de desinfección. Varios protocolos de muestreo ambientales se han descrito para la detección de rotavirus, colifago MS2, calicivirus felino (FCV), y bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. Sin embargo, las condiciones de validación descritas en estos estudios, incluyendo la desecación rápida (&lt;1 hora) y la escasez de superficie (25 x 100 cm 2), pueden no representar adecuadamente la configuración del campo. Además, el bajos niveles de contaminación de Enviro esperadasuperficies nmental requieren protocolos que son capaces de detectar muy pocas partículas de virus. Hemos desarrollado un método de muestreo de superficie a base de macroespuma para la detección y tipificación de norovirus. Este método ha sido validado durante varios brotes de norovirus. El protocolo incluye 1) cómo recolectar muestras de frotis de superficies ambientales (2) mejor manera de mantener la integridad de las muestras durante la recogida y el envío al laboratorio, y 3) las pruebas de laboratorio y tipificación de norovirus.

<table><tbody><tr><td>Nombre genérico de los kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam hisop</td><td>Prehumedened EnviroMax Swab kit&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><<tr><td>tampón de lisis >ARN fuerte&nbsp; </fuerte></td><td>CDC Tampón UNEX</td><td>Microbiológicos</td><td>Nº de cat MR0501</td></tr><tr><td><columna de centrifugación de extracción >ARN</columna ></td><td>Midi</td> fuerte <td>Omega Biotek</td><td>Cat Nº R6664-02</td></tr><tr><td><columna de centrifugación de purificación >ARN</fuerte></td><td>Zymol RNA kit de limpieza y concentrador&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td><fuerte>Kit de RT-PCR en tiempo real</td><td>AgPath kit RT-PCR en un solo paso</td><td>Life Technologies</td> Cat <td>Nº 4387391</td></tr><tr><td><fuerte>Convencional kit de RT-PCR</td><td>Qiagen kit de RT-PCR en un solo paso</td><td>Qiagen kit</td> Cat <td>No 210212</td></tr><tr><td>gel</td><td>Qiagen QIAkit de extracción de gel QIAquick</td><td>kit Qiagen</td><td>Cat Nº 28704 o 28706</td></tr><tr><td></td><td>Colifago MS2</td><td>ATCC</td><td>Nº de cat. 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>Transcripciones de escorrentía de ARN Plataforma de</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modelo ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Placa de reacción óptica de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat Nº 4316813</td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=true& productID=4306311&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPE d0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Película adhesiva transparente&nbsp; </a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

método de muestreo hisopo para la detección de norovirus humano en superficies

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

norovirus humanos son una causa principal de la epidemia y la gastroenteritis esporádica en todo el mundo. Debido a que la mayoría de las infecciones se propagan ya sea directamente a través de la ruta de persona a persona o indirectamente a través de las superficies ambientales o alimentos, fómites contaminados y superficies inanimadas son vehículos importantes para la propagación del virus durante los brotes de norovirus. Desarrollamos y evaluamos un protocolo utilizando hisopos macroespuma para la detección y tipificación de los norovirus humanos de las superficies duras. En comparación con hisopos con punta de fibra o toallitas antiestáticas, hisopos macroespuma permiten la recuperación de virus (rango de 1,2 a 33,6%) de las superficies de asiento de inodoro de hasta 700 cm 2. El protocolo incluye los pasos para la extracción del virus de los hisopos y una mayor concentración del ARN viral usando columnas de centrifugación. En total, 127 (58,5%) de 217 muestras de frotis que habían sido recogidos de las superficies en los cruceros y centros de atención a largo plazo donde había estado la gastroenteritis por norovirusinformaron dado positivo por norovirus GII por RT-qPCR. De estos 29 (22,8%) podría ser genotipo con éxito. En conclusión, la detección de norovirus en superficies ambientales utilizando el protocolo que hemos desarrollado puede ayudar a determinar el nivel de contaminación del medio ambiente durante los brotes, así como la detección de virus cuando las muestras clínicas no están disponibles; también puede facilitar el seguimiento de la eficacia de las estrategias de remediación.

La Figura 1 presenta un diagrama de flujo del protocolo de muestreo hisopo. Este protocolo consiste en cuatro pasos principales; 1) la recogida de muestras, 2) de almacenamiento de muestras y el transporte, 3) la purificación de ARN viral y la concentración y 4) ensayo de RT-qPCR y genotipado. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de flujo del protoc...

Se desarrolló y evaluó una metodología de muestreo basada en macroespuma para la detección y cuantificación de norovirus en superficies duras ambientales.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

El objetivo general de nuestro método de muestreo de superficies basado en macroespuma es identificar la etiología del brote, evaluar globalmente la dinámica de contaminación ambiental del virus y determinar la eficacia de las estrategias de remediación para el norovirus. Este protocolo detalla cómo recolectar muestras con hisopos de superficies ambientales, cómo deben almacenarse y transportarse dichos hisopos, y qué protocolo de laboratorio se recomienda para la detección y tipificación del norovirus a partir de estos hisopos. Las mejoras clave de este protocolo de hisopo ambiental para norovirus son que hemos determinado el mejor tipo de material del hisopo, la cantidad de norovirus que puede recuperarse de superficies duras, y que el protocolo puede utilizarse eficazmente para muestrear áreas superficiales más grandes.En este video, dos de mis científicos del personal, Geun Woo Park y Preeti Chhabra, demostrarán el protocolo de hisopado para la detección y tipificación de norovirus. Para comenzar el hisopado, diríjase al área de muestreo y pase el hisopo por el área de muestreo con un trazo en dirección horizontal, un trazo en dirección vertical y un trazo en dirección diagonal. Coloque cada hisopo en un tubo separado y ajuste firmemente la tapa.Muestree superficies con acero inoxidable, muestree la superficie de un asiento de inodoro y muestree una perilla de puerta. A continuación, etiquete un tubo de 15 mililitros y una columna RNA Midi para cada muestra. Incluya un control negativo de extracción en cada experimento.Prepare un frasco vacío para recolectar el residuo del tampón de extracción universal de ácidos nucleicos o UNEX. Para preparar la solución de lisis para 10 hisopos, mezcle 25 mililitros de tampón UNEX con 25 mililitros de PBST. Añada 50 microlitros de suspensión de colifago MS2 a 50 mililitros de la solución de lisis.Coloque un hisopo en un tubo de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de solución de lisis. Mezcle el hisopo en la solución e incube la mezcla a temperatura ambiente. Agregue cinco mililitros de etanol al 100 % a cada tubo y vortexee los tubos durante 10 segundos.Retire cuidadosamente el hisopo del tubo de 15 mililitros, presionándolo suavemente contra la pared del tubo para eliminar el exceso de líquido, y luego deseche el hisopo. Transfiera cuidadosamente 4,5 mililitros de la mezcla de etanol UNEX a una columna Midi y centrifugue la columna. Tras la centrifugación, deseche el filtrado.Cargue otros 4,5 mililitros de la misma mezcla en la misma columna y luego centrifugue la columna. Deseche el filtrado. Para el primer lavado, agregue 3,5 mililitros de etanol al 70 % en la columna Midi y centrifugue la columna.Después de la centrifugación, deseche el filtrado. Para el segundo lavado, agregue otros 3.5 mililitros de etanol al 70% en la columna Midi. Centrifugue y deseche el filtrado.Para la centrifugación en seco, centrifugue las columnas Midi para eliminar todos los rastros de etanol. Coloque la columna Midi en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Añada 250 microlitros de tampón de elución sobre la columna Midi y espere un minuto antes de centrifugar para obtener la máxima recuperación de ARN viral.Añada 500 microlitros de tampón de unión de ARN a 250 microlitros de ARN y mezcle por vórtex durante 10 segundos. Añada 750 microlitros de etanol al 100 % y mezcle por vórtex durante 10 segundos. A continuación, etiquete una columna de centrifugación para cada muestra.Cargue la muestra de 750 microlitros en una columna de centrifugación y centrifugue las columnas. Deseche el flujo atravesante. Cargue los 750 microlitros restantes en una columna de centrifugación y centrifugue las columnas.Para el lavado previo, agregue 400 microlitros de tampón de preparación de ARN a cada columna de centrifugación y centrifugue la columna. Deseche el flujo atravesado. Para el primer lavado, agregue 800 microlitros de tampón de lavado de ARN a cada columna de centrifugación y centrifugue las columnas.Deseche el flujo pasante. Para el segundo lavado, agregue 400 microlitros de tampón de lavado de ARN a cada columna de centrifugación y centrifugue las columnas. Deseche el flujo pasante.Para la centrifugación en seco, centrifugue la columna de centrifugación para eliminar todos los rastros de tampón de lavado. Transfiera cuidadosamente la columna de centrifugación a un tubo microcentrífugo limpio de 1,5 mililitros. Añada 25 microlitros de tampón de elución sobre la columna de centrifugación e incube la columna durante un minuto a temperatura ambiente para aumentar la recuperación de ARN viral de la columna.Recolecte el ARN centrifugando la columna giratoria a 10,000 veces G durante un minuto. Continúe directamente con la PCR en tiempo real. Antes de continuar con la RTPCR múltiple en tiempo real, limpie las superficies de trabajo, las pipetas y las centrífugas con una solución descontaminante de RNasa.Deshiele los reactivos de PCR en tiempo real sobre hielo. Deshiele el ARN de la muestra sobre hielo en un área separada. Determine el número de reacciones y prepare al menos un 10 % más de reactivo para la mezcla maestra para compensar las pérdidas durante la pipeta.A continuación, agite por vórtex los componentes individuales de la mezcla maestra durante cinco segundos. Mezcle cuidadosamente la enzima golpeando suavemente el tubo. Centrifugue brevemente los componentes de la mezcla maestra durante cinco segundos.Luego, prepare la mezcla maestra para la detección de norovirus G1 y G2 mediante RTPCR de acuerdo con las instrucciones del kit, y agregue los cebadores y sondas de oligonucleótidos específicos para norovirus en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. A continuación, mezcle la mezcla maestra pipeteando siete veces hacia arriba y hacia abajo. Aliquote 22 microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de la placa de PCR en tiempo real.Vortexee la muestra de ARN durante cinco segundos y recopile el contenido mediante una centrifugación de cinco segundos. Añada tres microlitros de controles positivos de ARN de la muestra y diluciones seriadas 10 veces de los transcritos de ARN G1 y G2 a la placa de PCR en tiempo real. Añada tres microlitros de agua libre de nucleasas a los pozos de control de plantilla negativa, o control NTC.Selle la placa con una película adhesiva óptica. Centrifugue cuidadosamente la placa a 1.300 ×g durante un minuto para eliminar cualquier burbuja de aire o gotas de líquido que puedan estar presentes en los pocillos. A continuación, prepare la PCR en tiempo real e ingrese las condiciones de termociclado.Determine las curvas estándar para los transcritos G1 y G2. Convierta los valores de Ct en copias de ARN utilizando la curva estándar respectiva. Tome la relación entre el volumen del eluyente de ARN total y la cantidad total de ARN utilizada para el ensayo en tiempo real para calcular el número total de copias de ARN por muestra.Para genotipificar las muestras positivas para norovirus mediante RTPCR convencional hemi-anidado, primero prepare una mezcla maestra para la primera ronda de RTPCR y distribuya alícuotas de 20 microlitros en tubos PCR previamente etiquetados. Añada cinco microlitros de ARN a cada tubo. Una vez finalizada la primera ronda de RTPCR, prepare una mezcla maestra para la segunda ronda de PCR hemi-anidada distribuyendo alícuotas de 23 microlitros en tubos nuevos.Finalmente, agregue dos microlitros del producto de la PCR de la primera ronda a cada tubo. El método de muestreo con hisopos basado en macroespuma fue probado en campo con muestras recogidas de un crucero que había reportado casos de gastroenteritis por norovirus sospechoso. Cuatro de las 17 muestras de hisopos positivas para norovirus pudieron ser genotipificadas, y todas las muestras presentaron secuencias idénticas de G2.La determinación de la carga viral permitió evaluar superficies altamente contaminadas, como asientos de inodoro. Se determinó la relación de los valores de umbral de ciclo, o valores Ct, mediante RT-PCR en tiempo real en cuanto a la capacidad de secuenciar estas muestras. En total, 127 de las 217 muestras de hisopado dieron positivo para norovirus G2.Las muestras de hisopado con valores de Ct entre 24 y 27 y entre 28 y 31 fueron genotipadas con tasas del 100% y del 72,2%, respectivamente. En contraste, solo el 22% y el 1,6% de las muestras de hisopado con valores de Ct entre 32 y 36 y entre 37 y 40 se secuenciaron con éxito. Como hemos demostrado, este protocolo permite determinar el nivel de contaminación ambiental durante brotes de norovirus, detectar la causa posible de un brote cuando no hay disponibles muestras clínicas, y también determinar la eficacia de las prácticas de limpieza.Para obtener el resultado más preciso, es muy importante seguir este protocolo exactamente para minimizar la variación de los resultados entre las diferentes muestras.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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