Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

El objetivo general de este método es montar embriones de pez cebra para obtener imágenes vivas, lo que permite el crecimiento normal de la región posterior del cuerpo. Este método se puede adaptar para la obtención de imágenes de otras regiones del pez cebra en desarrollo. Esta técnica ayuda a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cómo los comportamientos de las células individuales conducen a la morfogénesis a nivel de tejidos completos.

La principal ventaja de esta técnica es que permite el momento libre del cuerpo posterior manteniendo el embrión en la orientación correcta. Para comenzar, agregue agarosa de bajo punto de fusión a una concentración final de 1.5% a un medio E3 en un tubo de 50 mililitros y disuelva la agarosa calentándola en el microondas. Deje que la solución se equilibre a 42 a 45 grados centígrados en un baño de agua o en una incubadora de sobremesa.

Después de tirar de las agujas de vidrio de acuerdo con el protocolo de texto. Con un par de pinzas, rompa la aguja justo después del punto donde se flexiona para crear una aguja limpia y afilada para orientar los embriones y eliminar el exceso de agarosa. Elevar los embriones hasta la etapa apropiada en medio E3.

Luego, bajo un microscopio de disección binocular, use un par de pinzas afiladas para descorionar los embriones. Incubar los embriones decorionados durante al menos cinco minutos en solución de trabajo de tricaína. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir el embrión decorionado con un mínimo de E3 directamente al tubo de 50 mililitros de agarosa a 45 grados centígrados.

Extraiga el embrión junto con aproximadamente un mililitro de la agarosa montada y transfiera aproximadamente 100 microlitros del medio con el embrión al centro de un micropocillo de 10 milímetros en el fondo de una placa de Petri con fondo de vidrio de 35 milímetros. A medida que el medio de montaje se está ajustando, mueva el embrión al borde del círculo de agarosa, con la cola hacia afuera. Utilice la aguja capilar para orientar el embrión lo más lateralmente posible para obtener una imagen del desarrollo corporal posterior.

Luego, con el capilar, mantener el embrión en la orientación lateral deseada hasta que el gel esté completamente cuajado. Una vez que la gota de agarosa se haya endurecido, use una solución de trabajo de tricaña para inundar la placa de Petri. Luego, bajo un microscopio de disección con una base de luz transmitida, ajuste la posición del espejo y el ángulo de la luz incidente para que el fuerte contraste permita ver claramente los cortes en la agarosa.

Para realizar el corte uno, use la aguja capilar o el microbisturí para cortar la agarosa con un movimiento de sierra hacia arriba y hacia abajo, adyacente y a mitad de camino a lo largo de la yema, justo después de los campos cardíacos en formación por el quinto somita anterior y completamente a través de la agarosa hasta el vidrio. Fundamental aquí para garantizar que el embrión no se dañe al cortar la agarosa sobre el saco vitelino. A continuación, se realizan el segundo y tercer corte, comenzando contra el embrión hasta el cristal, tangencial a los cinco primeros somitos, permitiendo el despliegue dorsal del cuerpo posterior.

Luego, comenzando en la intersección de los cortes uno y tres, haga un corte diagonal lento hacia el final del corte tres mientras se eleva lentamente hacia arriba para desalojar el cuadrado de agarosa que rodea el cuerpo posterior. Con un par de pinzas afiladas, retire los bloques de agarosa desprendidos del medio embrionario utilizando la pared de la placa de Petri como soporte mientras levanta las piezas de agarosa. Antes del montaje de la muestra, use 1% de agarosa en E3 para recubrir un plato de plástico de 100 milímetros a una altura de cinco milímetros y deje que se asiente.

Luego coloque una gota de un mililitro de agarosa de bajo punto de fusión en el centro del plato y deje que se asiente también. Incruste los embriones en agarosa de bajo punto de fusión como se demostró anteriormente en este video. Sin embargo, esta vez, retire el embrión del tubo de 50 mililitros de agarosa con una gota más pequeña de solución y coloque esta pequeña gota encima de la gota de un mililitro en el centro del plato.

Utilice la aguja capilar para colocar el embrión en el centro de la pequeña gota y mantenga su orientación correcta hasta que el gel esté firme. Finalmente, use una solución de trabajo de tricaína para inundar el plato y eliminar el exceso de agarosa. En este vídeo animado se muestra un ejemplo de un embrión de pez cebra inyectado con ARNm que codifica para la proteína fluorescente fotoconvertible kikumeGR, luego montado en la etapa de 15 somitas y sometido a una imagen de lapso de tiempo durante 12 horas.

Al cuerpo posterior se le permite moverse libremente y exhibe cambios en la morfología similares a los observados en los embriones a los que se les permite desarrollarse libres de su corion en condiciones normales de cultivo. En este video, los embriones se inyectaron en la etapa de 16 células con ARNm que codifica la histona 2BRFP, que marca los núcleos, y CAAXGFP, que etiqueta las membranas celulares. Las imágenes se tomaron en un microscopio multifotónico vertical con un objetivo de inmersión en agua de 25X desde la etapa de 10 somitas durante tres horas para visualizar los comportamientos de las células durante la formación de las yemas de la cola.

Se pueden ver células generando protuberancias activas y movimiento direccional a medida que la yema de la cola se forma normalmente. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 20 minutos si se hace correctamente. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que el embrión esté en posición lateral mientras el gel de agarosa se está fraguando.

De lo contrario, la región de interés se moverá rápidamente fuera del campo de visión durante la toma de imágenes. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo montar embriones de pez cebra para la obtención de imágenes en vivo de la elongación posterior del cuerpo.