Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones
March 12th, 2017
Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones de imagen específicas para realizar tomografía electrónica de transmisión de barrido de muestras biológicas gruesas.
El objetivo general de este procedimiento es obtener una reconstrucción tridimensional con recuperación en profundidad de campo de un espécimen biológico grueso mediante tomografía electrónica de transmisión de barrido de haz convergente. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología estructural sobre la tomografía electrónica de muestras biológicas gruesas. La principal ventaja de esta técnica es que las imágenes se pueden adquirir en modo de bits convergentes y el procesamiento de datos se puede realizar en la mayoría de los programas dedicados a la tomografía.
Para comenzar a preparar la muestra de cultivo celular, centrifugue la muestra a 5000 x g durante cinco minutos. Utilice estos parámetros de centrifugación durante la preparación de la muestra. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS enriquecido con 4% de paraformaldehído y 2% de gluteraldehído.
Incubar la suspensión durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la mezcla, desechar el sobrenadante y lavar el pellet tres veces con porciones de un mililitro de PBS. Utilizando las mismas condiciones de incubación y procedimiento de lavado, incubar el pellet en un mililitro de PBS, enriquecido con tetróxido de osmio al 1%, y en un mililitro de PBS enriquecido con acetato de uranilo al 2%.
A continuación, enfríe la muestra a cuatro grados centígrados. Deshidratar el pellet mediante incubaciones sucesivas en soluciones de etanol cada vez más concentradas. Mantener la temperatura de la muestra de cuatro grados centígrados durante la incubación, la centrifugación y el lavado.
Resuspender el pellet deshidratado en un mililitro de etanol puro e incubar durante la noche a 4 grados centígrados. Luego, deje que la muestra se caliente a temperatura ambiente y centrifugue la muestra. Incubar el pellet en soluciones de resina epoxi cada vez más concentradas a temperatura ambiente.
Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de resina epoxi pura e incube durante la noche a temperatura ambiente. Centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante, y luego volver a suspender el pellet en 200 microlitros de resina epoxi y endurecedor. Transfiera la suspensión a la cápsula.
Incubar la cápsula de plástico a 60 grados centígrados durante 48 horas para polimerizar la resina. Retire la cápsula de la incubadora y verifique la polimerización de la resina. Añadir una capa de resina epoxi y endurecedor sobre la muestra incrustada y volver a incubar la cápsula en las mismas condiciones.
Monta la muestra incrustada en resina al revés en un portamuestras. Fije de forma segura la muestra en el bloque de recorte de un ultramicrótomo. Corta la cápsula de plástico de la muestra en la resina.
Dale forma piramidal a la resina expuesta. A continuación, transfiera la cápsula y el portamuestras al brazo móvil del ultramicrótomo. Instale un cuchillo de podar y, guiado por un microscopio, perfeccione la forma de la pirámide.
Reemplace el cuchillo de corte por un cuchillo de histología. Bajo el microscopio, ajuste el ángulo de inclinación de la cápsula para que la pirámide quede perpendicular al borde de la cuchilla. Ajuste la velocidad de corte y corte la muestra.
Después de seccionar la muestra, transfiera la sección elegida a una rejilla de cobre tratada sobre papel de filtro. Deje que la muestra se seque y, a continuación, cargue la muestra en el microscopio electrónico. Para diseñar la serie de inclinación focal pasante, primero calcule la profundidad de campo del haz de electrones y el grosor aparente máximo de la muestra.
En función de estos valores, seleccione un intervalo de enfoque y determine el número de pasos focales necesarios para obtener imágenes de toda la muestra con el grosor aparente máximo. A continuación, con un aumento bajo, localice la región de interés dentro de la muestra. Ajuste la altura eucéntrica para que el ROI no parezca moverse cuando se gira la muestra.
Verifique que el ROI permanezca visible en todo el rango de inclinación. Rellene los parámetros de la serie de inclinación focal para la recopilación automatizada de imágenes y adquiera las imágenes. Importe la serie de imágenes en un programa de procesamiento de imágenes y alinee las imágenes recopiladas con el mismo ángulo de inclinación en una jerarquía piramidal.
Encuentre la alineación en cada ángulo de inclinación apilando las imágenes alineadas. Examine la pila para asegurarse de que solo la región enfocada se mueve de una imagen a otra y realinee las imágenes según sea necesario. Una vez verificada la alineación en toda la muestra, combine la información enfocada en los ajustes altos para obtener la serie con una sola imagen por ángulo de inclinación.
Realice la búsqueda de la alineación de la serie de inclinación en función de los mínimos locales o los marcadores de referencia. Realice una reconstrucción en 3D e inspeccione la imagen resultante. Si la reconstrucción aparece borrosa o deformada, vuelva a alinear la serie de imágenes original.
Se obtuvo una imagen de una muestra de T. brucei y se analizó utilizando este método. En un ángulo de inclinación de cero grados, se ven varios detalles de la bolsa flagelar.
En el ángulo de inclinación más alto de 70 grados, solo una parte de cada imagen recopilada en la serie focal completa está enfocada. Esta posición cambia a lo largo de la serie. Al fusionar las secciones enfocadas, se produce una sola imagen con una zona enfocada más grande.
Este efecto es aún más pronunciado cuando se resaltan las áreas de alta frecuencia de la serie de inclinación focal pasante. La información de alta frecuencia abarca la mayor parte de la imagen combinada, lo que indica que la serie de inclinación focal a través se ha procesado bien. Una vez dominado, la parte de procesamiento de la imagen se puede realizar en unas tres o cuatro horas, dependiendo de los parámetros de alineación y reconstrucción elegidos.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de la reconstrucción final depende en gran medida de la calidad de las pruebas de alineaciones anteriores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la recopilación y el procesamiento de imágenes de una serie de inclinación focal pasante.
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Visión general
Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones específicas de imagen para realizar tomografía de transmisión electrónica de barrido de especímenes biológicos gruesos. El método tiene como objetivo lograr una reconstrucción tridimensional con recuperación del campo de profundidad, abordando preguntas clave en biología estructural.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología estructural
- Tomografía electrónica
- Técnicas de preparación de muestras
Antecedentes
- La tomografía de transmisión electrónica de barrido con haz convergente se utiliza para obtener imágenes de especímenes biológicos gruesos.
- Esta técnica permite la recuperación del campo de profundidad en reconstrucciones tridimensionales.
- Proporciona información sobre la organización estructural de muestras biológicas.
- El procesamiento de datos se puede realizar utilizando software de tomografía estándar.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable de preparación de muestras para la tomografía electrónica.
- Mejorar las técnicas de imagen para especímenes biológicos gruesos.
- Facilitar reconstrucciones tridimensionales que puedan informar la investigación en biología estructural.
Métodos utilizados
- Centrifugación de muestras de cultivo celular a 5000 x g durante cinco minutos.
- Resuspensión de células en PBS con 4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído.
- Aplicación de condiciones de imagen específicas para la tomografía electrónica.
- Utilización del modo de haz convergente para la adquisición de imágenes.
Resultados principales
- Preparación exitosa de muestras para tomografía de transmisión electrónica de barrido.
- Demostración de recuperación del campo de profundidad en reconstrucciones tridimensionales.
- Adquisición de imágenes de alta calidad adecuadas para el análisis estructural.
- Validación del método para responder preguntas clave en biología estructural.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es efectivo para preparar especímenes biológicos gruesos.
- La tomografía de transmisión electrónica de barrido con haz convergente mejora las capacidades de imagen.
- Este método puede contribuir significativamente a la investigación en biología estructural.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution 3D imaging of thick biological specimens, supporting structural biology research in drug target characterization and mechanism of action studies. By recovering depth of field through through-focal tilt series, it improves data quality for complex samples that challenge conventional electron microscopy. The approach enhances predictive confidence in target validation by providing detailed ultrastructural context for phenotypic observations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular architecture in native-like states to clarify target localization and pathway context.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating structural phenotypes with genetic or pharmacological perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for correlative light and electron microscopy workflows to enrich assay readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation for reproducible ultrastructural screening of compound-induced morphological changes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant ultrastructural detail to align with histopathological findings and biomarker studies.
- Operational Value: Enables mechanistic de-risking by visualizing target engagement effects on cellular architecture in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, offering structural insights that inform lead optimization and safety evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing target distribution and organelle remodeling in response to modulators.
- Screening: Delivers quantitative morphological outputs for high-content analysis of compound libraries in disease-relevant systems.
- Analytics: Generates 3D volumetric data enabling morphometric analysis and statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to tissue-level pathology through conserved ultrastructural phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for iterative structural characterization across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by providing direct visualization of structural consequences of modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, contrasting, and embedding protocols compatible with core facility workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target structural effects early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering ultrastructural evidence for target specificity and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy sample preparation and tomography data collection.
- Dependent on access to scanning transmission electron microscopes with tomography holders and stable stages.
- Necessitates cross-team standardization between biology and imaging groups for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, tissue densities, and resin compatibility.
- Limited by sample thickness constraints and potential radiation sensitivity during prolonged tilt-series acquisition.
