Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones
12 de marzo de 2017
Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones de imagen específicas para realizar tomografía electrónica de transmisión de barrido de muestras biológicas gruesas.
El objetivo general de este procedimiento es obtener una reconstrucción tridimensional con recuperación en profundidad de campo de un espécimen biológico grueso mediante tomografía electrónica de transmisión de barrido de haz convergente. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología estructural sobre la tomografía electrónica de muestras biológicas gruesas. La principal ventaja de esta técnica es que las imágenes se pueden adquirir en modo de bits convergentes y el procesamiento de datos se puede realizar en la mayoría de los programas dedicados a la tomografía.
Para comenzar a preparar la muestra de cultivo celular, centrifugue la muestra a 5000 x g durante cinco minutos. Utilice estos parámetros de centrifugación durante la preparación de la muestra. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS enriquecido con 4% de paraformaldehído y 2% de gluteraldehído.
Incubar la suspensión durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la mezcla, desechar el sobrenadante y lavar el pellet tres veces con porciones de un mililitro de PBS. Utilizando las mismas condiciones de incubación y procedimiento de lavado, incubar el pellet en un mililitro de PBS, enriquecido con tetróxido de osmio al 1%, y en un mililitro de PBS enriquecido con acetato de uranilo al 2%.
A continuación, enfríe la muestra a cuatro grados centígrados. Deshidratar el pellet mediante incubaciones sucesivas en soluciones de etanol cada vez más concentradas. Mantener la temperatura de la muestra de cuatro grados centígrados durante la incubación, la centrifugación y el lavado.
Resuspender el pellet deshidratado en un mililitro de etanol puro e incubar durante la noche a 4 grados centígrados. Luego, deje que la muestra se caliente a temperatura ambiente y centrifugue la muestra. Incubar el pellet en soluciones de resina epoxi cada vez más concentradas a temperatura ambiente.
Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de resina epoxi pura e incube durante la noche a temperatura ambiente. Centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante, y luego volver a suspender el pellet en 200 microlitros de resina epoxi y endurecedor. Transfiera la suspensión a la cápsula.
Incubar la cápsula de plástico a 60 grados centígrados durante 48 horas para polimerizar la resina. Retire la cápsula de la incubadora y verifique la polimerización de la resina. Añadir una capa de resina epoxi y endurecedor sobre la muestra incrustada y volver a incubar la cápsula en las mismas condiciones.
Monta la muestra incrustada en resina al revés en un portamuestras. Fije de forma segura la muestra en el bloque de recorte de un ultramicrótomo. Corta la cápsula de plástico de la muestra en la resina.
Dale forma piramidal a la resina expuesta. A continuación, transfiera la cápsula y el portamuestras al brazo móvil del ultramicrótomo. Instale un cuchillo de podar y, guiado por un microscopio, perfeccione la forma de la pirámide.
Reemplace el cuchillo de corte por un cuchillo de histología. Bajo el microscopio, ajuste el ángulo de inclinación de la cápsula para que la pirámide quede perpendicular al borde de la cuchilla. Ajuste la velocidad de corte y corte la muestra.
Después de seccionar la muestra, transfiera la sección elegida a una rejilla de cobre tratada sobre papel de filtro. Deje que la muestra se seque y, a continuación, cargue la muestra en el microscopio electrónico. Para diseñar la serie de inclinación focal pasante, primero calcule la profundidad de campo del haz de electrones y el grosor aparente máximo de la muestra.
En función de estos valores, seleccione un intervalo de enfoque y determine el número de pasos focales necesarios para obtener imágenes de toda la muestra con el grosor aparente máximo. A continuación, con un aumento bajo, localice la región de interés dentro de la muestra. Ajuste la altura eucéntrica para que el ROI no parezca moverse cuando se gira la muestra.
Verifique que el ROI permanezca visible en todo el rango de inclinación. Rellene los parámetros de la serie de inclinación focal para la recopilación automatizada de imágenes y adquiera las imágenes. Importe la serie de imágenes en un programa de procesamiento de imágenes y alinee las imágenes recopiladas con el mismo ángulo de inclinación en una jerarquía piramidal.
Encuentre la alineación en cada ángulo de inclinación apilando las imágenes alineadas. Examine la pila para asegurarse de que solo la región enfocada se mueve de una imagen a otra y realinee las imágenes según sea necesario. Una vez verificada la alineación en toda la muestra, combine la información enfocada en los ajustes altos para obtener la serie con una sola imagen por ángulo de inclinación.
Realice la búsqueda de la alineación de la serie de inclinación en función de los mínimos locales o los marcadores de referencia. Realice una reconstrucción en 3D e inspeccione la imagen resultante. Si la reconstrucción aparece borrosa o deformada, vuelva a alinear la serie de imágenes original.
Se obtuvo una imagen de una muestra de T. brucei y se analizó utilizando este método. En un ángulo de inclinación de cero grados, se ven varios detalles de la bolsa flagelar.
En el ángulo de inclinación más alto de 70 grados, solo una parte de cada imagen recopilada en la serie focal completa está enfocada. Esta posición cambia a lo largo de la serie. Al fusionar las secciones enfocadas, se produce una sola imagen con una zona enfocada más grande.
Este efecto es aún más pronunciado cuando se resaltan las áreas de alta frecuencia de la serie de inclinación focal pasante. La información de alta frecuencia abarca la mayor parte de la imagen combinada, lo que indica que la serie de inclinación focal a través se ha procesado bien. Una vez dominado, la parte de procesamiento de la imagen se puede realizar en unas tres o cuatro horas, dependiendo de los parámetros de alineación y reconstrucción elegidos.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de la reconstrucción final depende en gran medida de la calidad de las pruebas de alineaciones anteriores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la recopilación y el procesamiento de imágenes de una serie de inclinación focal pasante.
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Descripción general
Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones específicas de imagen para realizar tomografía electrónica de transmisión con barrido en especímenes biológicos gruesos. El método tiene como objetivo lograr una reconstrucción tridimensional con recuperación de la profundidad de campo, abordando preguntas clave en biología estructural.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Biología Estructural
- Tomografía Electrónica
- Técnicas de Preparación de Muestras
Antecedentes
- Se utiliza la tomografía electrónica de transmisión con haz convergente para obtener imágenes de especímenes biológicos gruesos.
- Esta técnica permite la recuperación de la profundidad de campo en reconstrucciones tridimensionales.
- Proporciona información sobre la organización estructural de muestras biológicas.
- El procesamiento de datos puede realizarse utilizando software estándar de tomografía.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable de preparación de muestras para tomografía electrónica.
- Mejorar las técnicas de obtención de imágenes para especímenes biológicos gruesos.
- Facilitar reconstrucciones tridimensionales que puedan aportar información a la investigación en biología estructural.
Métodos Utilizados
- Centrifugación de muestras de cultivo celular a 5000 x g durante cinco minutos.
- Resuspensión de las células en PBS con paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 2%.
- Aplicación de condiciones específicas de imagen para tomografía electrónica.
- Utilización del modo de haz convergente para la adquisición de imágenes.
Resultados principales
- Preparación exitosa de muestras para tomografía electrónica de transmisión de barrido.
- Demuestra la recuperación de la profundidad de campo en reconstrucciones tridimensionales.
- Adquisición de imágenes de alta calidad adecuadas para análisis estructural.
- Validación del método para responder preguntas clave en biología estructural.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es efectivo para preparar especímenes biológicos gruesos.
- La tomografía electrónica de transmisión con haz convergente mejora las capacidades de imagen.
- Este método puede contribuir significativamente a la investigación en biología estructural.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la obtención de imágenes 3D de alta resolución de especímenes biológicos gruesos, apoyando la investigación en biología estructural para la caracterización de dianas terapéuticas y estudios sobre el mecanismo de acción. Al recuperar la profundidad de campo mediante series de inclinación enfocadas, mejora la calidad de los datos para muestras complejas que representan un desafío para la microscopía electrónica convencional. El enfoque aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al proporcionar un contexto ultraestructural detallado para las observaciones fenotípicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la exploración de la arquitectura subcelular en estados similares a los nativos para aclarar la localización del blanco y el contexto de la vía.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional del blanco mediante la correlación de fenotipos estructurales con perturbaciones genéticas o farmacológicas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo de microscopía electrónica y de luz correlativas con el fin de enriquecer las lecturas del ensayo.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras para el cribado reproducible de cambios morfológicos inducidos por compuestos a nivel ultraestructural.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona detalles ultraestructurales relevantes para la enfermedad que se alinean con hallazgos histopatológicos y estudios de biomarcadores.
- Valor operativo: Permite la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización de los efectos del acoplamiento al blanco sobre la arquitectura celular en modelos preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, ofreciendo conocimientos estructurales que orientan la optimización del fármaco líder y la evaluación de seguridad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la visualización de la distribución del blanco y la remodelación de orgánulos en respuesta a moduladores.
- Tamizaje: Proporciona resultados morfológicos cuantitativos para el análisis de alto contenido de bibliotecas de compuestos en sistemas relevantes para enfermedades.
- Análisis: Genera datos volumétricos tridimensionales que permiten el análisis morfométrico y la comparación estadística entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con la patología a nivel tisular mediante fenotipos ultraestructurales conservados.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada para la caracterización estructural iterativa en múltiples proyectos y clases de blancos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos al proporcionar una visualización directa de las consecuencias estructurales de la modulación.
- Valor Operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de fijación, contraste e inclusión compatibles con los flujos de trabajo de instalaciones centrales.
- Valor Estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar tempranamente efectos estructurales fuera del objetivo en la fase inicial del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la Cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar evidencia ultraestructural de la especificidad del objetivo y los márgenes de seguridad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la preparación de muestras para microscopía electrónica y en la recopilación de datos de tomografía.
- Depende del acceso a microscopios electrónicos de transmisión con portaobjetos para tomografía y etapas estables.
- Necesita una estandarización entre equipos de biología y de imagen para un manejo de muestras consistente.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos celulares, densidades de tejidos y compatibilidad con resinas.
- Está limitado por las restricciones de grosor de la muestra y la posible sensibilidad a la radiación durante la adquisición prolongada de series de inclinación.
