Name: Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a preparar muestras biológicas gruesas para tomografía electrónica de transmisión por barrido con haz convergente. Este protocolo permite obtener reconstrucciones tridimensionales con recuperación de profundidad de campo en biología estructural.

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Este trabajo fue financiado por dos subvenciones ANR (ANR-11-BSV8-016 y ANR-10-IDEX-0001-02). También reconocemos al PICT-IBiSA por proporcionar acceso a equipos de imágenes químicas.

Precaución: Consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) de los diversos reactivos antes de usarlos. Varios de los productos químicos utilizados durante la preparación de la muestra son tóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y / o tóxicos para la reproducción. Usar el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) y el trabajo bajo una campana de humos durante la manipulación de la muestra. Seccionar la muestra con un ultramicrotomo implica el uso de instrumentos afilados, y el uso cuidadoso de estas herramientas es obligatorio. En los pasos descritos a continuación, los autores suponen que la muestra es una muestra de cultivo celular. puede necesitar ser modificada de acuerdo con el tipo de muestra, especialmente los pasos de centrifugación el protocolo. 1. Preparación de tampones y mezclas <ol><li> Una solución salina tamponada con fosfato (PBS) Preparar (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, y 1,76 mM KH 2 PO 4). </li><li> Preparar soluciones que contienen 30%, 50% y 70% etHanol en PBS durante la deshidratación de la muestra. Realizar la deshidratación de la muestra mediante la incubación de la muestra gradualmente en concentraciones crecientes de etanol. </li><li> Preparar resina epoxi mezclando bisfenol-A- (epiclorhidrina) (20 ml), dodecenilo anhídrido succínico (9 ml), metil-5-norborneno-2,3-dicarboxílico (11 ml), y 2,4,6-tris ( dimetilaminometil) fenol (0,7 ml); otras relaciones de mezcla pueden ser utilizados en función de la dureza deseada de la resina. </li><li> Preparar soluciones que contienen 30%, 50%, y la resina epoxi 70% en etanol durante la incrustación de la muestra. Realizar la incrustación de resina mediante la incubación de la muestra gradualmente con el aumento de las concentraciones de resina. NOTA: Los volúmenes de las soluciones preparadas dependen del tipo de muestra que se estudia. Se necesitan más soluciones para los tejidos que para los cultivos celulares. </li></ol> 2. La fijación y coloración de la prueba <ol><li> Centrifugar el cultivo de células durante 5 minutos a 5000 x g. Realizar todos los siguientes centrifugaciones utilizando las mismas condiciones.</li><li> Descartar el sobrenadante y fijar el sedimento celular por resuspensión en PBS (1 ml) con 4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min (Figura 1A). Por otra parte, fijar las células a 4 ° C durante la noche o durante el fin de semana. </li><li> Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces con PBS (1 ml) para eliminar por completo los agentes de fijación. </li><li> Post-fijar la muestra con 1% OSO 4 en PBS (1 ml) durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces con PBS (1 ml) para eliminar completamente el OsO4. Desactivar el OsO4 en aceite y descarte. </li><li> Añadir 2% de acetato de uranilo en PBS (1 ml) como agente de contraste y se incuba la muestra durante 30 min a temperatura ambiente (Figura 1B). </li><li> Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento 3 veces con PBS (1 ml) para eliminar el aire acondicionado de uranilo no unidoetate; acetato de uranilo contiene elementos radiactivos y debe desecharse en un contenedor dedicado a los residuos radiactivos. NOTA: Los tiempos de incubación pueden ser modificados de acuerdo con el tamaño de la muestra. Por ejemplo, la fijación y la tinción de las muestras más gruesas, tales como muestras de tejidos, requieren tiempos de incubación más largos. tiempos de incubación más largos también pueden ser mejores para la deshidratación y los pasos de incrustación. acetato de uranilo se puede sustituir por una solución &quot;de uranilo menos&quot; que contiene sales de gadolinio. </li></ol> La deshidratación 3. Muestra <ol><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y se incuba la muestra durante 30 min a 4 ° C en PBS (1 ml) con 30% de etanol (Figura 1C). </li><li> Repita el paso 3.1 utilizando soluciones con concentraciones gradualmente crecientes de etanol (50%, 70%, y hasta 100%). Durante estas etapas de deshidratación, mantener la muestra a 4 ° C con fines de conservación de la muestra. </li><li> Después de la centrifugación, desechar la Supernathormigas y resuspender el precipitado en etanol puro (1 ml); incubar durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 4. Incorporación de Resina <ol><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en etanol con resina epoxi 30% (1 ml) durante 30 min a RT (Figura 1D). </li><li> Repita el paso 4.1 utilizando soluciones con concentraciones de resina epoxi gradualmente creciente (50%, 70%, y hasta 100%). </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en resina epoxi puro (1 ml); incubar durante la noche a TA. La presencia de endurecimiento DMP-30 podría desencadenar la polimerización de la resina; si esto sucede, preparar dos lotes de resina epoxi, una con y otra sin DMP-30. </li><li> Después de la centrifugación, resuspender el precipitado en 200 l de resina de epoxi pura (que contiene el endurecedor) en una cápsula de plástico; la muestra debe ser en la parte inferior de la cápsula de plástico. </li></ol> 5. Resina de polimerización <ol><li> yoncubate la cápsula de plástico que contiene la muestra en un incubador a 60 ° C durante 48 h; otros tipos de resina pueden polimerizarse con diferentes configuraciones. </li><li> Retire la cápsula de la incubadora y verificar que la resina ha polimerizado; la resina debe ser duro si se presiona contra una superficie dura. </li><li> Añadir resina epoxi puro (que contiene el endurecedor) en la parte superior de la resina polimerizada que contiene la muestra; esta capa adicional de resina hará que sea más fácil de cortar la muestra. Incubar la cápsula a 60 ° C durante 48 h. </li></ol> Seccionamiento 6. Muestra <ol><li> Montar la muestra al revés en un portamuestras de modo que la muestra es hacia la parte superior y fijarlo en el bloque de corte de la ultramicrotomo. bloquear firmemente la palanca para asegurar el bloque de corte a la ultramicrotomo. </li><li> Utilizando una hoja de afeitar o un instrumento de corte puntiagudo similar, cortar la cápsula de plástico para separarlo de la resina polimerizada. Cortar la resina de manera que la muestra es contenered en resina en aproximadamente la forma de una pirámide. No hay necesidad de eliminar toda la cápsula de plástico; Sólo eliminar la parte que cubre la muestra polimerizado. </li><li> Tome la cápsula y el soporte de la muestra fuera del bloque de recorte e instalarlas en el brazo móvil de la ultramicrotomo. </li><li> Instalar un cuchillo de corte en el bloque del cuchillo y cortar con precisión las caras de la pirámide. Se recomienda el uso de prismáticos para dar una forma perfecta de la pirámide; mejor será la pirámide, la mejor de las secciones serán. </li><li> Quitar el cuchillo de recorte y reemplazarlo con un cuchillo de histología que se puede utilizar para cortar secciones que son más gruesas que 0,5 micras. </li><li> Después de llenar la cubeta de la cuchilla de la histología con la cantidad correcta de agua, llevar el borde de corte de la cuchilla a la superficie de la muestra y el uso de los prismáticos para ajustar el ángulo de paso de la cápsula de modo que el cuchillo cortará perpendicularmente a la pirámide. </li><li> Ajustar la velocidad de corte de acuerdo con la deseadaespesor de la sección para recuperar secciones homogéneas. </li><li> Dejar que la sección de flotar sobre el agua y los peces con un bucle. </li><li> Mueva el bucle hacia una rejilla de cobre de microscopía electrónica que se ha colocado en la parte superior de papel de filtro. NOTA: La parrilla debe haber sido previamente tratado para aumentar su hidrofilicidad. Esto se puede realizar con una pluma de rejilla de recubrimiento. </li><li> Debido a la absorción de agua por el papel de filtro, deje que la sección se adhieren a la red. Deje secar durante unos minutos antes de insertarlo en el microscopio electrónico. </li></ol> 7. Diseño de la inclinación de la serie A través focal <ol><li> Recoger imágenes a través de interés secundario a intervalos constantes de enfoque. NOTA: La serie de inclinación a través focal consiste en un conjunto de imágenes a través de esferas de actividad que se recogen en cada ángulo de inclinación de la serie de inclinación. La amplitud de enfoque conjunto debe ser suficiente para cubrir todo el espesor de la muestra. </li><li> Determinar el valor del intervalo de enfoque. Si el intervalo es igual a la depth de campo, recoger toda la muestra en el foco; este valor representa el más alto de muestreo posible. Si el intervalo es mayor que la profundidad de campo, algunas partes de la muestra no serán adquiridos en el foco, lo que significa que algunas partes de la muestra no serán recogidos en el enfoque. </li><li> Calcular la profundidad de campo de un haz de electrones a partir de la longitud de onda del electrón y la convergencia semi-ángulo del haz de electrones. Considerando que la longitud de onda de electrones está directamente vinculada a la tensión de aceleración, utilizar la convergencia semi-ángulo proporcionado por el fabricante microscopio electrónico o determinar experimentalmente a partir del patrón de difracción de una muestra conocida 16. Debido a que los electrones acelerados a una longitud de onda λ golpear la muestra con un semi-ángulo de convergencia de α en un microscopio electrónico, utilizar la siguiente ecuación para determinar el campo de profundidad de (DOF): <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq1.jpg" /></li><li> Diseñola serie focal de modo que toda la amplitud de enfoque cubrirá la muestra en su espesor aparente máxima (es decir, en su más alto de inclinación). NOTA: Una muestra de 0,75 micras de espesor tendrá un espesor aparente de 2,19 micras, con un inclinación de 70 °, por lo que la amplitud de enfoque debe ser mayor que 2,19 m. Para este ejemplo, si el intervalo de enfoque determinado anteriormente es igual a 50 nm, se requerirá de 44 imágenes (2,19 m / 50 nm) para cubrir la muestra en su máximo espesor aparente. La amplitud de enfoque conjunto es igual al valor del intervalo de enfoque, multiplicado por el número de pasos focales. En el más alto de inclinación (θ), el espesor aparente de la muestra se define como la siguiente: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55215/55215eq2.jpg" /></li></ol> 8. Muestra Imaging NOTA: Está más allá del alcance de este protocolo para describir cómo configurar un microscopio electrónico en modo STEM; la mayor parte de esta información se puede encontrar in el manual de referencia proporcionado por el fabricante del microscopio electrónico. Sin embargo, tenga en cuenta lo siguiente: i) el tamaño del punto debe ser elegido de acuerdo con el cambio de tamaño deseado; ii) la Ronchigram debe estar bien alineado; y iii) en el modo de BF, la longitud de la cámara se debe ajustar para seleccionar electrones dispersados ​​manteniendo una buena iluminación del detector. secciones de resina depositado sobre rejillas de cobre de microscopía electrónica debe estar encendida antes de la adquisición de imágenes para evitar la contracción. la contracción de la resina y los efectos de carga podrían ser confundidos durante la adquisición de imágenes. El uso de una apertura de la lente objetivo podría mejorar la estabilidad de la muestra cuando se producen efectos de carga. Sin embargo, en el caso específico de las configuraciones de STEM, la apertura del objetivo no es compatible con el modo de imagen HAADF, y muy pequeñas aberturas objetivas no son compatibles con el modo de imagen BF. <ol><li> El uso de bajo aumento (alrededor 20.000X en STEM), navegar a través de la muestra y localizar la región de interés. </li><li> Ajuste tque eucéntrica altura (eje Z) de manera que la región de interés no se alejan mientras gira la muestra. </li><li> Compruebe que el objeto de interés permanecerá visible en toda la gama de inclinación. </li><li> Debido al gran número de imágenes adquiridas durante una inclinación de la serie a través focal, utilice un software automático de la colección. O bien utilizar una solución comercial o si se desea diseñar un software de recogida de datos personalizado. Asegúrese de que el programa de software es capaz de realizar los tres pasos siguientes: <ol><li> Y realizar un enfoque como en un esquema estándar de recogida de la serie de inclinación. </li><li> Asegúrese de que las imágenes a través focal se solapan con la posición Z de la muestra. </li><li> adquirir automáticamente una serie de imágenes a través focal en cada ángulo de inclinación. </li></ol></li><li> Dar el programa de software de los principales parámetros de la serie a través de inclinación-focal (es decir, intervalos de actividad, paso focal, ángulo de inclinación mínimo, el máximo ángulo de inclinación, paso de inclinación y velocidad de barrido). </li><li> comienzoel proceso de recogida de imagen y esperar a que el programa de software para finalizar. </li></ol> Procesamiento 9. Imagen NOTA: En este protocolo, el procesamiento de la serie de inclinación a través focal se realiza usando ImageJ plugins 17. Datos suplementarios 1 muestra una macro ImageJ para el paso de alineación (Turboreg) y para la fusión de la información de enfoque (profundidad de campo) para una serie de inclinación a través focal diseñado con tres valores de enfoque. <ol><li> Alinear las imágenes recogidas en el mismo ángulo de inclinación (es decir, a través de las imágenes-focales). Dado que las imágenes no tienen la misma información de enfoque, que no albergan las mismas características para la alineación; la alineación de las imágenes mediante la alineación de vecinos de dos en dos (es decir, a raíz de una jerarquía piramidal, con los valores de enfoque más cercanas primero) usando Turboreg 18, un plugin de ImageJ. </li><li> Consistentemente verificar la alineación de las imágenes a través de-focales en cada ángulo de inclinación.Apilar las imágenes alineadas a través de interés secundario para mejorar la inspección visual. NOTA: Sólo la zona que está en el foco debe moverse durante la navegación a través de la pila. La alineación exacta es lo más importante, ya que el siguiente paso consiste en la recuperación de la información que está en el foco de diferentes imágenes. </li><li> Combinar la información que está en el foco usando profundidad de campo 19, un plugin de ImageJ; esto eventualmente generará una sola imagen de la pila de imágenes. Existen varios valores se pueden utilizar durante la recuperación de la profundidad de campo, pero el uso de la configuración más alta para preservar la información de la imagen. NOTA: La serie de inclinación está compuesta de una sola imagen por ángulo de inclinación, cada imagen que contiene la información de enfoque se recuperó de las imágenes a través de-focales. </li><li> Procesar los datos. NOTA: Las herramientas estándar para la alineación y la reconstrucción se puede utilizar ya que los datos se ha reducido ahora a una serie de inclinación estándar. En este protocolo, TomoJ nosotros esed para la alineación de los datos y la reconstrucción de datos 20, 21. Más detalles acerca de cómo utilizar TomoJ se pueden encontrar en la publicación original 22. </li><li> Realizar ajuste fino de la serie de inclinación. NOTA: Una buena estrategia es utilizar cuentas de oro como marcadores de referencia para rastrear con precisión los cambios entre imágenes. mínimos locales también se puede utilizar si cuentas de oro no se pueden añadir a la muestra. </li><li> Realizar una reconstrucción 3D de los datos alineados; varios algoritmos están disponibles para la realización de las reconstrucciones en el espacio real o en el espacio de Fourier, cada uno con ventajas y limitaciones. </li><li> Si la alineación final de la serie de inclinación es pobre, hacer algunas mejoras mediante la optimización de los pasos iniciales. Reiterar los pasos de alineación si la reconstrucción 3D final aparece borrosa o deformada; en la práctica, mayor será el número de planos focales recogidos, mejor será el contraste y detalles de la reconstrucción 3D. NOTA: Seprogramas de software Veral se pueden usar para procesar la inclinación de la serie a través de-focal. porque sin embargo, se eligieron las herramientas utilizadas en este protocolo, en nuestra experiencia, se obtuvieron los mejores resultados. Turboreg 18 obtenido mejores resultados en cuanto a la alineación de las imágenes cuando estaba presente un gradiente de concentración. Más información se puede encontrar en el sitio web dedicado 23. La gran profundidad de campo Plugin 19 realiza muy bien en términos de recuperación de la información de enfoque a partir de diferentes imágenes, mientras que otras herramientas resultaron en pixeles modificaciones visibles. Más información, especialmente en relación con la escritura de guiones, se puede encontrar en este sitio web dedicado 24. </li></ol>

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<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li>
<li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041(2016).</li>
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No tenemos ningún conflicto de intereses que divulgar.

En este artículo, se presenta un protocolo de preparación de muestras convencional junto con una guía paso a paso para realizar el análisis 3D en muestras biológicas de espesor utilizando la tomografía por STEM-focal. Resina incrustación de muestras biológicas se ha utilizado durante décadas 26 y protocolos alternativos que se adaptan a diferentes tipos de muestras se pueden encontrar en la literatura 27. Por el contrario, las muestras gruesas de imagen en STEM está utiliz...

Desde principios de la década de 1970, la tomografía se acerca en la microscopía electrónica de transmisión (TEM) han sido ampliamente utilizados para la caracterización estructural de las muestras biológicas 1, 2, 3. El atractivo de la tomografía electrónica de transmisión era que podría ser utilizado para estudiar una amplia gama de estructuras biológicas a escala nanométrica, de la arquitectura de las células y la ultraestructura de los orgánulos a la estructura de los complejos macromoleculares y proteínas. Sin embargo, la tomografía electrónica de transmisión no se podría utilizar para estudiar muestras muy gruesas (mayor de 0,5 m). De hecho, las muestras gruesas producen demasiados electrones dispersos, la generación de imágenes de baja relación señal-ruido (SNR). Además, la tomografía implica la colección de imágenes de especímenes inclinados, con el espesor aparente de la muestra aumenta con el ángulo de inclinación. A pesar de que la dispersión inelástica se puede filtrarutilizando filtros de energía, la cantidad crítica de electrones necesarios para imágenes de alto SNR apenas se alcanza en TEM. Por lo tanto, las muestras biológicas de espesor sólo se han estudiado utilizando seccionamiento 4. Algunas muestras no pueden ser cortadas: algunos pueden degradar cuando se cortan, y otros necesitan ser estudiados en su totalidad con el fin de comprender su complejidad. Un enfoque alternativo es utilizar TEM en el modo 5, 6, 7, 8 de exploración. En microscopía de barrido electrónico de transmisión (STEM), la trayectoria óptica de los electrones es diferente de la de TEM convencional. Los electrones pasan a través de la muestra sin dispersión se pueden recoger en el eje óptico con un detector de campo brillante (BF) 9, mientras que dispersa elásticamente se pueden recoger en un cierto ángulo desde el eje óptico con un detector de campo oscuro (DF).La otra ventaja de STEM es que el haz de electrones enfocado es escaneado en la superficie de la muestra, lo que permite la colección de píxel por píxel de las imágenes. A pesar de que el haz de electrones se ensancha mientras pasa a través de la muestra 10, este sistema de recogida es menos sensible a los electrones inelástica dispersos que TEM convencional. Además, no hay lente post-espécimen en STEM, evitando así las aberraciones cromáticas que pueden ocurrir en TEM. La longitud de la cámara se puede ajustar de manera que el detector detecta BF principalmente electrones dispersados. Utilizando el detector DF para estudiar muestras gruesas, no se recomienda debido a la dispersión múltiple, que produce imágenes imprecisas. En lugar de ello, el detector de BF se puede utilizar 11. Mientras STEM puede producir imágenes de alta SNR, tiene una relativamente baja profundidad de campo debido a la relativamente alta convergencia de haz en comparación con TEM, disminuyendo la cantidad de información en profundidad que se puede recuperar a partir de espesorespecímenes. En el caso de microscopios de STEM de aberración corregida, en el que el ángulo de convergencia puede ser tan alta como 30 mrad, el campo de profundidad de puede ser lo suficientemente baja para que la información que está en el foco origina a partir de un plano focal de sólo unos pocos nanómetros . Configuración del haz de electrones en el modo paralelo aumenta la profundidad de campo del haz de electrones en detrimento de la resolución 12. Sin embargo, esta disposición no siempre es posible. Siempre que sea necesario el uso de un haz de electrones convergente, deberán utilizarse las técnicas que mejoran la profundidad de campo del haz de electrones en el estudio de muestras de espesor. Estudios recientes han informado de la adquisición de varias imágenes en diferentes planos focales en toda la muestra de recuperar la máxima cantidad de información que tiene el foco 13, 14. Los dos estudios describen diferentes maneras de manejar la información de los diferentes planos focales. Hovden et al.combinan en el espacio de Fourier de las imágenes que se recogieron en diferentes planos focales, y se obtuvo la reconstrucción final directamente a partir de la inversa 3D transformada de Fourier 13. Por el contrario, Dahmen et al. desarrollado un motor de reconstrucción de haz convergente para reconstruir en el espacio real del volumen 3D a partir de los diferentes planos focales 14. Nuestro laboratorio también desarrolló un método para obtener imágenes de muestras biológicas de espesor. Nuestra estrategia era diferente de los dos métodos descritos anteriormente en que nos fusionamos la información que está en el foco en los diferentes planos focales y reconstruido el volumen final en 3D en el espacio real mediante un proyector de haz paralelo 15. Nuestro objetivo fue desarrollar un método que se puede realizar fácilmente en cualquier laboratorio de microscopía electrónica. Con este fin, que tuvo como objetivo recoger las imágenes focales en una cantidad limitada de tiempo, comparable con el marco de tiempo de los experimentos de tomografía convencionales. Además, nuestra propuesta de método de could ser adaptado para su uso con diferentes tipos de alineación y software de reconstrucción. En el contexto de nuestra publicación a partir de 2015 15, queríamos visualizar y caracterizar la recuperación de la profundidad de campo, por lo que se utilizó una gran convergencia semi-ángulo de 25 mrad. A continuación, presentamos un protocolo paso a paso para realizar a través focal imágenes in STEM de acuerdo con el método desarrollado en nuestro laboratorio en 2015 15, y presentamos cómo se procesan los datos de 2015. Este método recupera la información que tiene el foco de varios planos focales a lo largo de un (750 nm) muestra biológica de espesor y permite reconstrucciones en 3D de alta calidad. En su caso, también se presentan las diferencias en esta metodología en comparación con los métodos utilizados por otros grupos.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Resina epoxi</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Agregue polvo de paraformaldehído al PBS calentado a aproximadamente 60 °C. Aumente el pH agregando 1 N NaOH hasta que no se vea polvo de PFA.</td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>Cápsula de gelatina</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillos de recorte e histo</td><td>Distribución LFG Cuchillos</td><td></td><td>de diamante de diatomeo</td></tr><tr><td>Microscopía electrónica Rejilla de cobre</td><td>LFG Distribution</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de recubrimiento de rejilla</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso electrónica de transmisión de positrones

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Este informe describe un protocolo para preparar especímenes biológicos gruesos para su posterior observación utilizando un microscopio electrónico de transmisión de barrido. También describe un método de imagen para estudiar la estructura 3D de especímenes biológicos gruesos mediante tomografía electrónica de transmisión de barrido. El protocolo de preparación de muestras se basa en métodos convencionales en los que la muestra se fija mediante agentes químicos, se trata con un agente de contraste de sal de átomos pesados, se deshidrata en una serie de baños de etanol y se incrusta en resina. A continuación, se describen las condiciones de imagen específicas para la observación de muestras gruesas mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido. Las secciones de la muestra se observan utilizando un método de enfoque continuo que implica la recopilación de varias imágenes en varios planos focales. Esto permite la recuperación de información enfocada a varias alturas a lo largo de la muestra. Este patrón de recolección particular se realiza en cada ángulo de inclinación durante la recopilación de datos de tomografía. A continuación, se genera una sola imagen, fusionando la información enfocada de todos los diferentes planos focales. A continuación, se genera un conjunto de datos clásico de la serie de inclinación. La ventaja del método es que la alineación y reconstrucción de la serie de inclinación se puede realizar con herramientas estándar. La colección de imágenes focales permite la reconstrucción de un volumen 3D que contiene todos los detalles estructurales de la muestra enfocada.

En nuestro estudio, los electrones se aceleran a 200 kV en el microscopio electrónico de transmisión cañón de emisión de campo. Las imágenes se recogieron en modo STEM BF utilizando un tiempo de permanencia de 20 mu s. En cuanto al diseño de la serie de inclinación a través de-focal, encontramos que los intervalos de enfoque de 150 nm dieron resultados satisfactorios para el estudio ultraestructural de una muestra, incluso biológica 750 nm de espesor, aunque la profundidad de campo de ha...

Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones de imagen específicas para realizar tomografía electrónica de transmisión de barrido de muestras biológicas gruesas.

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener una reconstrucción tridimensional con recuperación en profundidad de campo de un espécimen biológico grueso mediante tomografía electrónica de transmisión de barrido de haz convergente. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la biología estructural sobre la tomografía electrónica de muestras biológicas gruesas. La principal ventaja de esta técnica es que las imágenes se pueden adquirir en modo de bits convergentes y el procesamiento de datos se puede realizar en la mayoría de los programas dedicados a la tomografía.Para comenzar a preparar la muestra de cultivo celular, centrifugue la muestra a 5000 x g durante cinco minutos. Utilice estos parámetros de centrifugación durante la preparación de la muestra. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS enriquecido con 4% de paraformaldehído y 2% de gluteraldehído.Incubar la suspensión durante 30 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la mezcla, desechar el sobrenadante y lavar el pellet tres veces con porciones de un mililitro de PBS. Utilizando las mismas condiciones de incubación y procedimiento de lavado, incubar el pellet en un mililitro de PBS, enriquecido con tetróxido de osmio al 1%, y en un mililitro de PBS enriquecido con acetato de uranilo al 2%.A continuación, enfríe la muestra a cuatro grados centígrados. Deshidratar el pellet mediante incubaciones sucesivas en soluciones de etanol cada vez más concentradas. Mantener la temperatura de la muestra de cuatro grados centígrados durante la incubación, la centrifugación y el lavado.Resuspender el pellet deshidratado en un mililitro de etanol puro e incubar durante la noche a 4 grados centígrados. Luego, deje que la muestra se caliente a temperatura ambiente y centrifugue la muestra. Incubar el pellet en soluciones de resina epoxi cada vez más concentradas a temperatura ambiente.Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de resina epoxi pura e incube durante la noche a temperatura ambiente. Centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante, y luego volver a suspender el pellet en 200 microlitros de resina epoxi y endurecedor. Transfiera la suspensión a la cápsula.Incubar la cápsula de plástico a 60 grados centígrados durante 48 horas para polimerizar la resina. Retire la cápsula de la incubadora y verifique la polimerización de la resina. Añadir una capa de resina epoxi y endurecedor sobre la muestra incrustada y volver a incubar la cápsula en las mismas condiciones.Monta la muestra incrustada en resina al revés en un portamuestras. Fije de forma segura la muestra en el bloque de recorte de un ultramicrótomo. Corta la cápsula de plástico de la muestra en la resina.Dale forma piramidal a la resina expuesta. A continuación, transfiera la cápsula y el portamuestras al brazo móvil del ultramicrótomo. Instale un cuchillo de podar y, guiado por un microscopio, perfeccione la forma de la pirámide.Reemplace el cuchillo de corte por un cuchillo de histología. Bajo el microscopio, ajuste el ángulo de inclinación de la cápsula para que la pirámide quede perpendicular al borde de la cuchilla. Ajuste la velocidad de corte y corte la muestra.Después de seccionar la muestra, transfiera la sección elegida a una rejilla de cobre tratada sobre papel de filtro. Deje que la muestra se seque y, a continuación, cargue la muestra en el microscopio electrónico. Para diseñar la serie de inclinación focal pasante, primero calcule la profundidad de campo del haz de electrones y el grosor aparente máximo de la muestra.En función de estos valores, seleccione un intervalo de enfoque y determine el número de pasos focales necesarios para obtener imágenes de toda la muestra con el grosor aparente máximo. A continuación, con un aumento bajo, localice la región de interés dentro de la muestra. Ajuste la altura eucéntrica para que el ROI no parezca moverse cuando se gira la muestra.Verifique que el ROI permanezca visible en todo el rango de inclinación. Rellene los parámetros de la serie de inclinación focal para la recopilación automatizada de imágenes y adquiera las imágenes. Importe la serie de imágenes en un programa de procesamiento de imágenes y alinee las imágenes recopiladas con el mismo ángulo de inclinación en una jerarquía piramidal.Encuentre la alineación en cada ángulo de inclinación apilando las imágenes alineadas. Examine la pila para asegurarse de que solo la región enfocada se mueve de una imagen a otra y realinee las imágenes según sea necesario. Una vez verificada la alineación en toda la muestra, combine la información enfocada en los ajustes altos para obtener la serie con una sola imagen por ángulo de inclinación.Realice la búsqueda de la alineación de la serie de inclinación en función de los mínimos locales o los marcadores de referencia. Realice una reconstrucción en 3D e inspeccione la imagen resultante. Si la reconstrucción aparece borrosa o deformada, vuelva a alinear la serie de imágenes original.Se obtuvo una imagen de una muestra de T. brucei y se analizó utilizando este método. En un ángulo de inclinación de cero grados, se ven varios detalles de la bolsa flagelar.En el ángulo de inclinación más alto de 70 grados, solo una parte de cada imagen recopilada en la serie focal completa está enfocada. Esta posición cambia a lo largo de la serie. Al fusionar las secciones enfocadas, se produce una sola imagen con una zona enfocada más grande.Este efecto es aún más pronunciado cuando se resaltan las áreas de alta frecuencia de la serie de inclinación focal pasante. La información de alta frecuencia abarca la mayor parte de la imagen combinada, lo que indica que la serie de inclinación focal a través se ha procesado bien. Una vez dominado, la parte de procesamiento de la imagen se puede realizar en unas tres o cuatro horas, dependiendo de los parámetros de alineación y reconstrucción elegidos.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de la reconstrucción final depende en gran medida de la calidad de las pruebas de alineaciones anteriores. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la recopilación y el procesamiento de imágenes de una serie de inclinación focal pasante.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

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Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

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