Una Guía Visual de Ordenación de Registros electrofisiológicos El uso de 'SpikeSorter'

El objetivo general de este video es mostrar a los electrofisiólogos cómo usar el programa, SpikeSorter, para detectar y clasificar picos en registros extracelulares a partir de tejido neuronal hecho con matrices de microelectrodos. Nuestro objetivo era proporcionar una solución sencilla a esta tarea de clasificación de picos utilizando un programa con una interfaz fácil de usar. SpikeSorter puede leer archivos en una variedad de formatos y ofrece una variedad de estrategias de preprocesamiento y detección de eventos, además de opciones de clasificación y exportación de datos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el análisis de los comportamientos neuronales, estudiados mediante registros extracelulares con arrays multielectrodos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la complejidad de la tarea y a la falta de una metodología estándar y de una validación objetiva. Primero tuvimos la idea de este método, cuando nos enfrentamos al problema de clasificar nuestras propias grabaciones, realizadas con matrices de electrodos múltiples de 54 canales y no encontramos ninguna solución disponible.

Para comenzar este procedimiento, abra el programa. Vaya a archivo y abra, y luego seleccione el formato de archivo de grabación de la lista desplegable, en la parte inferior derecha del cuadro de diálogo de archivo abierto resultante. A continuación, seleccione el archivo y haga clic en abrir.

Haga clic en Aceptar cuando la lectura haya finalizado. Las señales de registro ahora se muestran en la pantalla de forma de onda de voltaje. Si la grabación no está filtrada y contiene el potencial de campo local, elimínela haciendo clic en el icono de filtro en la barra de herramientas.

Seleccione el filtro butterworth de paso alto, una frecuencia de corte adecuada y el número de polos, luego presione Hágalo. Presione OK, luego listo, luego inspeccione la forma de onda filtrada en la pantalla. Las señales de voltaje se pueden inspeccionar manteniendo presionado el botón izquierdo del mouse y luego arrastrando. Utilice la rueda de desplazamiento para acercar y alejar características concretas.

Pase el ratón por encima de puntos específicos de forma de onda para mostrar los valores de voltaje correspondientes en la esquina superior izquierda. Al hacer doble clic en la ventana, aparece un cuadro de diálogo que también se puede utilizar para examinar rápidamente cualquier parte de la grabación y para examinar eventos específicos en canales o clústeres, una vez que se haya completado la detección y clasificación de eventos. A continuación, compruebe si hay canales que puedan estar defectuosos y deban enmascararse.

Haga clic en el icono de verificación de canal e inspeccione el gráfico. Para enmascarar un canal periférico, seleccione el número de canal o selecciónelo de la lista de problemas. Cuando haya terminado, cierre el cuadro de diálogo y, a continuación, haga clic en Sí cuando se le solicite para guardar los valores de la máscara.

Los canales enmascarados están atenuados en la pantalla de voltaje. En este procedimiento, vaya a Detección de eventos de preproceso para abrir el cuadro de diálogo de detección de eventos. Use el control deslizante en la parte superior derecha para inspeccionar el nivel de ruido en los canales en particular.

Una inspección cuidadosa de la pantalla de voltaje también puede revelar canales silenciosos o inusualmente ruidosos que deben enmascararse. Elija umbrales variables para la detección de eventos. El rango recomendado de umbrales es de 4,0 a 6,0 veces el ruido.

Seleccione 4.5. Elija el método de detección de filtro multifásico dinámico de la lista desplegable. Establezca la ventana para que sea aproximadamente la mitad del ancho de una forma de onda de pico típica, con los valores en el rango de 0,15 a 0,5 milisegundos.

Después de eso, seleccione el método de alineación eligiendo la opción que mejor identifique una sola característica localizada temporalmente de los picos que se están ordenando. Deje las demás opciones en sus valores predeterminados y pulse Inicio. Pulse Listo para salir del cuadro de diálogo.

La ventana de forma de onda de voltaje muestra los eventos detectados en gris en su canal central asignado. Los parámetros de detección de eventos se pueden ajustar en función de los resultados observados en este punto. Por ejemplo, la detección de eventos se puede volver a ejecutar con un umbral de detección más bajo, para detectar más eventos.

Normalmente, el siguiente paso no se realiza antes de la ordenación rutinaria, pero es útil hacerlo cuando se ordena por primera vez o cuando se encuentran datos desconocidos. Vaya a ordenar, convertir canales en clústeres, para crear un solo clúster para cada canal de electrodo sin enmascarar, suponiendo que cada canal tiene algunos eventos asignados. Examine estos clústeres yendo a revisar, ver, limpiar y dividir clústeres para que aparezca otro cuadro de diálogo.

Utilice el control de número para seleccionar el clúster que se va a ver. Seleccione un clúster que tenga dos o más subclústeres distintos, luego presione el botón realinear para cambiar la hora de cada evento, a fin de que coincida mejor con la forma de la plantilla. A continuación, presione Autosplit para agrupar los eventos en función de la distribución de los componentes principales.

A continuación, haga clic en las casillas de verificación para examinar las formas de onda en los subclústeres. Utilice el control deslizante para examinar las formas de onda correspondientes. Como ejercicio, use uno de los pequeños botones de división para crear un nuevo clúster y examinarlo.

Observe cómo el grupo rojo ahora revela dos subgrupos más claramente, después de que el verde se separa. La clasificación podría continuar manualmente de esta manera, pero es preferible usar el procedimiento de clasificación automática más rápido. Presione Listo y vaya a Ordenar, Ordenar automáticamente.

Deje activada la opción Omitir detección de eventos si ya se ha realizado la detección de eventos, como aquí. Si no está marcada, la detección de eventos se ejecutará automáticamente, utilizando los valores de los parámetros y las opciones heredadas del cuadro de diálogo de detección de eventos. En el panel de agrupación a continuación, seleccione una ventana temporal lo suficientemente grande como para contener la totalidad de la forma de onda del pico, antes y después del punto de alineación.

A continuación, seleccione la opción de realineación que se utilizará durante la agrupación en clústeres y elija un tamaño mínimo de clúster. Decida el número de dimensiones en el espacio del PC que se usarán para la agrupación en clústeres y deje otras opciones en su configuración predeterminada. Después de eso, presione Iniciar para comenzar la clasificación automática.

Una vez completada la ordenación automática, pulse Siguiente para ir a la fase de combinación y división guiada manualmente y, a continuación, pulse Iniciar. En el nuevo cuadro de diálogo, los pares de clústeres que no sean claramente similares o distintos se presentarán en secuencia. Para cada par presentado, use los botones para elegir si fusionar el par, fusionarlo y volver a dividirlo, para marcar el par como distinto o ambiguo, si no está claro cuál es la mejor decisión.

Haga clic en las casillas de verificación para mostrar un gráfico de la altura del pico o del primer o segundo componente principal frente al tiempo o los histogramas de correlación automática y cruzada. Esto puede ayudar con las decisiones. Aquí, vemos un ejemplo de una decisión de fusión.

Seguido de una decisión de fusión y división. Si la opción de combinación y división no puede encontrar clústeres claramente separables, utilice el control deslizante del cuadro de diálogo solicitado para modificar manualmente un parámetro de agrupación en clústeres y encontrar una división que parezca satisfactoria. Si esto no se puede lograr, use el botón Revertir para volver al estado original de los dos clústeres.

Cuando termine, presione dividir como se muestra. Ahora vaya a la revisión, post-procesamiento. Utilice el botón de limpieza de alineación para eliminar eventos de los clústeres que coincidan mal con su plantilla de clúster.

A continuación, use el botón reagrupar para reasignar eventos no agrupados a plantillas concretas en función del valor de coincidencia. Los eventos reclamados se marcan como un subclúster de cada clúster principal y se pueden inspeccionar mediante el cuadro de diálogo ver, limpiar y dividir clústeres. Estos eventos permanecerán en el clúster y se exportarán como tales, a menos que se eliminen.

A continuación, vuelva al cuadro de diálogo de posprocesamiento. Utilice el botón Eliminar y el control de número situado junto a él para eliminar los clústeres con una relación señal-ruido inferior al umbral seleccionado. A continuación, utilice el botón de ordenación para volver a numerar los clústeres según el criterio elegido.

Esta figura muestra la visualización, obtenida al ir a la vista, de las formas de onda ordenadas para la grabación que se acaba de ordenar. La experiencia común es que las formas de onda de un par de clústeres en el mismo canal parecen idénticas, pero el cuadro de diálogo de comparación de pares, sin embargo, muestra clústeres distintos en la proyección de PC. Las decisiones de fusión que siguen las etapas anteriores de la clasificación a veces se sugieren mediante gráficos de tiempo de amplitud y correlatos cruzados.

Esto ilustra una decisión de fusión basada en la presencia de una fuerte correlación cruzada asimétrica a intervalos de tiempo cortos, junto con una relación clara entre los primeros valores de los componentes principales de las dos unidades, que se muestran aquí en el eje vertical. Esta figura muestra un caso en el que no hay pruebas similares para la fusión. El correlato cruzado no es fuertemente asimétrico y los autocorrelogramas son diferentes.

Aunque las formas de onda son similares, podría decirse que las dos unidades no deberían fusionarse, debido a la diferencia en las distribuciones de los componentes principales. Esta figura muestra un caso en el que las formas de onda son similares y los primeros valores de los componentes principales de dos unidades se mezclan cuando una de ellas deja de disparar y la otra comienza. En este caso, la decisión de fusionarse parece sencilla.

Esperamos que esta breve introducción a SpikeSorter haya sido útil. Planeamos continuar desarrollando el programa y agregar nuevas características donde puedan ser útiles. Con este fin, damos la bienvenida a los informes de errores, comentarios constructivos y sugerencias de mejora.