Name: La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y In Situ Ligadura ensayo de proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a comparar co-inmunoprecipitación y ensayo de ligadura de proximidad para visualizar interacciones proteína-proteína en compartimentos nucleares y citoplasmáticos usando células HEK293.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (SNSF, 31003A_163305).

1. Co-inmunoprecipitación <ol><li> Seed HEK293 células a 2 x 10 5 células por pocillo en una placa de 6 pocillos en 2 ml de modificación Medium (DMEM) suplemento de Eagle de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) . </li><li> Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) tres veces. Las células de la cosecha por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Preparación de las dosis nucleares y citoplasmáticos usando reactivos comerciales de extracción nucleares y citoplasmáticos. Siga las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. <ol><li> Utilice 3 x 10 6 células durante un experimento de co-inmunoprecipitación (aproximadamente con un 90% de confluencia de 3 pozos de una placa de 6 pocillos). Añadir 300 l solución fría citoplasmática de extracción (CER I) y agitar durante 15 segundos a la velocidad más alta. </li><li> Incubar durante 30 minutos en hielo. Durante la incubación, vortex para 5 s cada 10 min. </li><li> Añadir 16,5 l fría extracción citoplasmática solución II (CER II) y agitar durante 5 segundos y se incuba durante 5 minutos en hielo. </li><li> Vortex durante 5 segundos y se centrifuga a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante (extracto citoplásmico) en un nuevo tubo de pre-enfriado, y se mantiene en hielo hasta su uso. </li><li> Lavar sedimentos insolubles (núcleos que contienen) tres veces con PBS frío 1 ml cada vez pipeteando arriba y abajo cinco veces. Retirar PBS después de lavado. </li><li> Añadir 150 l solución fría de extracción nuclear (NER) y agitar durante 15 segundos y se incuba 1 hora en hielo. Durante la incubación, vórtice durante 15 segundos y pipeta de 10 veces con una punta de 200 l cada 10 min. </li><li> Vortex durante 15 s y se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante (extracto nuclear) en un nuevo tubo de pre-enfriado, se mantiene en hielo hasta su uso. </li></ol></li><li> Sacar 10% del volumen de los extractos nucleares y citoplasmáticas cada uno como entradas. </li><li> UNdd PBS frío a los extractos restantes a un volumen final de 1 ml. Mantener en hielo hasta su uso. NOTA: Pre-limpieza no es esencial cuando se utilizan perlas magnéticas G-conjugado de proteína. Sin embargo, si el fondo es alto, llevar a cabo pre-compensación mediante la incubación de 40 proteínas l perlas de G-conjugados magnéticos (50% de lechada) y 1 ml diluidos lisado de esta etapa a 4 ° C durante 30 min en un rotador. sobrenadante separado (lisado pre-aclarado) a partir de perlas con rejilla magnética. Desechar las cuentas. </li><li> Para anticuerpo primario pareja con perlas magnéticas de proteína G-conjugados, incubar 40 l de proteína perlas magnéticas G-conjugados (50% de lechada) con anticuerpo 4 g de conejo policlonal anti-RBM3 o IgG de conejo (control negativo) en 200 l de PBS más tampón Tween 20 (PBST, 0,02% de Tween 20) a temperatura ambiente (RT) durante 40 min en un rotador. </li><li> cuentas y sobrenadante separado por anticuerpos acoplados con una cremallera magnética, y desechar el sobrenadante. Se lavan las perlas una vez con 200 l de PBST (0,02%). </li><li> Añadir 1ml diluyó lisados ​​(o si es necesario lisados, pre-limpiado) a las perlas, y se incuba en un rotador a 4 ° C durante la noche. </li><li> En el día siguiente, separar las perlas y el sobrenadante por una cremallera magnético, y descartar el sobrenadante. Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBST (0,02%) para cada tubo a 4 ° C en un rotador con una velocidad fija de 20 rpm. </li><li> Eluir proteínas a partir de las perlas mediante la adición de tampón de muestra de 40 l (tampón de muestra 1x comercial y 50 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT)). Se calienta a 70 ° C durante 10 min. Girar hacia abajo y líquidos para la transferencia a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li><li> Diluir lisados ​​de entrada en tampón de muestra (concentración final: tampón de muestra 1x comercial y DTT 50 mM) y se calienta a 70 ° C durante 10 min. entradas de carga y proteínas inmunoprecipitadas a partir de la última etapa de un prefabricado de gel de bis-Tris al 4-12%. El volumen de carga de cada pocillo no debe exceder de 20 l. Realizar electroforesis en tampón de desarrollo comercial 1x en hielo durante 35 min. NOTA: La carga nuclear y extracto citoplasmáticos en una relación de 1: 2 (V / V), que refleja la misma cantidad inicial de células. </li><li> proteínas de transferencia a una membrana de PVDF en tampón de transferencia comercial 1x a 30 V durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Bloquear la membrana con 5% de leche desnatada en PBST (0,1% de Tween 20) a TA durante 40 min en un agitador. </li><li> Incubar la membrana con anticuerpos primarios (tanto diluido en 1: 1000) en PBST (0,1%) a 4 ° C durante la noche. </li><li> Lavar 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Incubar la membrana con peroxidasa de rábano (HRP) conjugada anti-ratón o anti-conejo secundaria de anticuerpos (tanto diluido en 1: 5000) en PBST (0,1%) a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Lavar 3 x 10 min con PBST (0,1%) a temperatura ambiente en un agitador. </li><li> Utilizar 0,2 ml aumento de quimioluminiscencia (ECL) mezcla de sustrato por membrana cm 2, incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Evitar toda la luz procedente de esta etapa en adelante, excepto las luces rojas. </li><li> Desechar el líquido y exponer a una película de rayos X en un cartucho de película. Desarrollar la película utilizando un pr automático de la películaocessing máquina. </li></ol> 2. La inmunocitoquímica y Proximidad ligadura Ensayo <ol><li> Seed células HEK293 en 1.5 x 10 4 células por cámara en diapositiva estucado por una 8-cámara de poli-D-lisina en 0,4 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 100 U / ml Pen-Strep. </li><li> Se cultivan las células durante 48 horas a 37 ° C con 5% de CO2. </li><li> Aspirar medio, y fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 10 min a RT. </li><li> Aspirar PFA y lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara. </li><li> Permeabilizar y las células de bloque con 0,5% Triton X-100 y 5% de suero normal de cabra (NGS) en PBS a temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Incubar con anticuerpos primarios en 0,1% de Triton X-100 y 5% de NGS en PBS en un agitador a 4 ° C durante la noche. Diluir monoclonal de ratón anti-NF90 anticuerpo y anticuerpo policlonal de conejo anti-RBM3 1: 100 en PBS durante de doble tinción. Para el control negativo, independientemente omitir cualquiera de los dos anticuerpos primarios, y omitir ambos anticuerpos en un tercer control. NOTA: No utilice el bloqueo comercial y reactivos de dilución. </li><li> Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara. </li><li> Sin perjuicio de protocolos de ensayo de ligación de inmunocitoquímica o de proximidad <ol><li> La inmunocitoquímica <ol><li> Incubar con 1: 500 diluido fluorescente anti-ratón de colorante acoplado verde y anti-conejo anticuerpos secundarios acoplados a colorantes fluorescentes rojas a RT durante 1 hr. Evitar la luz de este paso adelante. </li><li> núcleos contratinción con 4 &#39;, 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) diluido 1: 5000 en PBS a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Lavar 3 x 10 min con 0,5 ml de PBS por cámara. </li><li> Retire las cámaras de la lámina de vidrio y seco. Montar con 250 μ, por diapositiva medio de montaje. </li></ol></li><li> ensayo de ligamiento por proximidad <ol><li> Preparar sondas de ensayo de ligadura de proximidad. Mezclar y diluir dos sondas de ensayo de proximidad ligadura (anti-ratón y anti-conejo secundaria de anticuerpos unidos con diferentes oligonucleótidos que pueden ligar los THáspera la adición de otros dos oligonucleótidos en solución de ligación) ambos 1: 5 en 0,1% de Triton X-100 y 5% de NGS en PBS, con un volumen total de 320 l para una diapositiva 8-cámara (aproximadamente 40 l por cm 2) . Incubar a TA durante 20 min. </li><li> Retire las cámaras de la lámina de vidrio y añadir las sondas diluidas. Incubar en una incubadora con humedad a 37 ° C durante 1 hr. </li><li> Preparar la solución de ligación. Mezclar 8 l de ligasa, 64 l 5 x ligadura de valores y 248 l de H2O </li><li> Toque el líquido desde la diapositiva, y lavar 2 x 5 min en 1x tampón de lavado A (suministrado con el kit). </li><li> Añadir solución de ligación y se incuba en un incubador de humedad a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Preparar la solución de amplificación. Mezclar 4 l polimerasa, 64 l de 5x amplificación de valores y 252 l de H2O Evitar la luz de este paso adelante. </li><li> Elimine el líquido de la diapositiva, y lavar 2 x 2 min en 1x tampón de lavado A. </li><li> Añadir el amplificadorlification solución e incubar en una incubadora con humedad oscuridad a 37 ° C durante 100 minutos. </li><li> Toque el líquido desde la diapositiva, y lavar 2 x 10 min en 1x tampón de lavado B (suministrado con el kit). Lavar durante 1 min en tampón de lavado 0,01x B. </li><li> Secar el portaobjetos y montar con 250 l de un medio de montaje comercial (con DAPI) por portaobjetos. </li></ol></li></ol></li><li> Examine las señales fluorescentes bajo el microscopio utilizando una lente ocular 10X y 20X lente objetivo. Adquirir imágenes mediante una cámara CCD. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios beneficios, así como las deficiencias de ambos métodos. Como una técnica relativamente nueva, una ventaja obvia de ensayo de ligamiento por proximidad es la viabilidad de dilucidar las interacciones proteína-proteína a nivel de una sola célula en lugar de un lote de células heterogéneas. Las imágenes con alta resolución y magnitud (por ejemplo, mediante microscopio confocal) proporcionan la posibilidad para la cuantificación contando puntos fluorescentes individuales. En contraste, la combinación con...

Factor nuclear 90 (NF90) es una proteína multi-isoforma con numerosas funciones, incluyendo la respuesta a la infección viral, la regulación de la interleucina-2 post-transcripción y la regulación de los genes miARN la biogénesis 1-3. RBM3 es una proteína de unión al ARN, implicados en la traducción y miARN biogénesis y puede ser inducida por varios factores estresantes incluyendo hipotermia y la hipoxia 4-6. Recientemente, hemos encontrado NF90 y RBM3 en un complejo de proteínas 7. La interacción de NF90 y RBM3 es esencial para modular la actividad de la proteína quinasa ARN-como retículo endoplásmico quinasa (PERK) en respuesta a proteínas desplegadas 7. Tanto NF90 y RBM3 se encuentran predominantemente en el núcleo, pero una pequeña proporción de NF90 y la lanzadera RBM3 en el citoplasma y se unen allí entre sí para funciones específicas, por ejemplo para regular la actividad PERK. Por lo tanto, es importante para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el compartimiento subcelular, lo que puede indicarsus diversos papeles en el compartimento respectivo. Hace décadas, los dos híbridos de levadura (Y2H) fue desarrollado para detectar la interacción entre dos proteínas 8. Sin embargo, debido a la construcción artificial de proteínas fusionadas, resultados falsos positivos han restringido la aplicación de este método. Durante mucho tiempo, co-inmunoprecipitación fue la principal técnica para analizar interacciones proteína-proteína, especialmente en condiciones endógenas 9. Para analizar el complejo de proteínas co-inmunoprecipitó, Western blot es la técnica más conveniente, mientras que la espectrometría de masas se utiliza cuando se desean súper sensibilidad y precisión. En los últimos años, el ensayo de ligamiento por proximidad ha sido desarrollado como un nuevo método para detectar interacciones proteína-proteína en ambas células y tejidos in situ 10,11. A continuación, se comparó el método de co-inmunoprecipitación más popular y relativamente novedoso método de ensayo de ligamiento por proximidad en la captura de NF9interacción 0-RBM3 en fracciones subcelulares. También discutimos las ventajas y limitaciones de ambas técnicas.

<table><tbody><tr><td>El águila modificada de Dulbecco' s Medio (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Alto contenido de glucosa 4.500 mg/L</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Reactivos de extracción nuclear y citoplasmática</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiotritol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein</td><td>G Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90/NF110)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>uso 1:1.000 para WB y 1:100 para el anticuerpo ICC/PLA</td></tr><tr><td>RBM3</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>uso 1:1.000 para WB y 1:100 para el anticuerpo ICC/PLA</td></tr><tr><td>Lamin A/C</td><td>Tecnología</td> <td>de señalización celular#2032</td><td>use 1:1,000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>uso 1:1.000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>conejo normal IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo IgG, anticuerpo secundario ligado a HRP</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#7074</td><td>uso 1:5,000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-ratón anti-ratón anticuerpo secundario HRP</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>uso 1:5.000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>Sustrato secante Clarity Western ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Tampón de muestra LDS (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Tampón de ejecución (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de transferencia NuPAGE (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 Membrana de PVDF</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina 8 pocillos Portaobjetos de cultivo</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG (Anticuerpo H+L), Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG (Anticuerpo H+L), Alexa Fluor 568 conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA sonda Anti-ratón PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp; sonda Anti-conejo MINUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Reactivos de detección Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Tampones de lavado Fluorescencia</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Medio de montaje con DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>SPOT</td><td>INSIGHT 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>Película de rayos X Fujifilm</td><td></td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de procesamiento de película</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

la visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de co-inmunoprecipitación y<em&gt; in situ</em&gt; ligadura ensayo de proximidad

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

Las interacciones proteína-proteína están involucradas en miles de procesos celulares y ocurren en un contexto espacial distinto. Tradicionalmente, la coinmunoprecipitación es una técnica popular para detectar interacciones proteína-proteína. El análisis de Western blot posterior es el método más común para visualizar proteínas coinmunoprecipitadas. Recientemente, el ensayo de ligadura de proximidad se ha convertido en una poderosa herramienta para visualizar las interacciones proteína-proteína in situ y brinda la posibilidad de cuantificar las interacciones proteína-proteína por este método. Al igual que la inmunocitoquímica convencional, la técnica de ensayo de ligadura de proximidad también se basa en la accesibilidad de los anticuerpos primarios a los antígenos, pero por el contrario, el ensayo de ligadura de proximidad detecta interacciones proteína-proteína con una técnica única que implica PCR de círculo rodante, mientras que la inmunocitoquímica convencional solo muestra la colocalización de proteínas.
El factor nuclear 90 (NF90) y la proteína 3 del motivo de unión al ARN (RBM3) han sido previamente demostrados como socios interactivos. Se localizan predominantemente en el núcleo, pero también migran al citoplasma y regulan las vías de señalización en el compartimento citoplasmático. Aquí, comparamos la interacción NF90-RBM3 tanto en el núcleo como en el citoplasma mediante coinmunoprecipitación y ensayo de ligadura de proximidad. Además, discutimos las ventajas y limitaciones de estas dos técnicas en la visualización de las interacciones proteína-proteína con respecto a la distribución espacial y las propiedades de las interacciones proteína-proteína.

La Figura 1 demuestra que NF90 y RBM3 son ambas proteínas nucleares y sólo una pequeña fracción está presente en el citoplasma. En particular, hay tres bandas distintas marcadas positivo para RBM3. El más pequeño justo debajo de 20 kDa refleja el tamaño correcto de RBM3 (el peso molecular predicho de RBM3 es 17 kDa). El origen de las otras dos bandas que queda por investigar. experimentos de co-inmunoprecipitación con RBM3 como la proteína cebo revelaron que las interacc...

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

El objetivo general de este experimento es comparar las ventajas y desventajas de la co-inmunoprecipitación, o co-ip, y el ensayo de ligación por proximidad, o pla, para visualizar interacciones proteína-proteína en diferentes compartimentos celulares. La comparación aquí presentada de dos métodos diferentes puede ayudar a los científicos a decidir cuál es más adecuado para su propósito específico al investigar los patrones de distribución de las interacciones proteína-proteína en el núcleo y el citoplasma de una célula. La principal ventaja de la co-ip es la detección de interacciones proteína-proteína auténticas.Por el contrario, la ventaja de PLA es analizar interacciones proteína-proteína en el instituto de manera rápida a nivel de célula individual. Después de cultivar y recolectar células HEK293 según el protocolo descrito, a 3 × 10⁶ células, añadir 300 µL de solución fría de extracción citoplasmática y vórtex las células a la máxima velocidad durante 15 segundos. Incubar el extracto en hielo durante 30 minutos y, cada 10 minutos durante la incubación, vórtex la muestra durante cinco segundos.Luego, agregue 16,5 µL de solución fría de extracción citoplasmática, mezcle mediante vortex durante cinco segundos e incube la muestra en hielo durante cinco minutos. Mezcle el extracto mediante vortex durante cinco segundos y centrifugue la muestra a 16.000 × g y 4 °C durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo previamente enfriado y manténgalo en hielo hasta su uso. A continuación, use un mililitro de PBS frío para lavar tres veces los pellets insolubles, pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y elimine el PBS después de cada lavado.A continuación, agregue 150 microlitros de solución fría de extracción nuclear, mezcle mediante vortex durante 15 segundos e incube en hielo durante una hora. Cada 10 minutos durante la incubación, agite la muestra mediante vortex durante 15 segundos y use una punta de 200 microlitros para pipetear la solución 10 veces. Agite el tubo mediante vortex durante 15 segundos y centrifugue la muestra a 16.000 × g a 4 grados Celsius durante 10 minutos; luego, transfiera el sobrenadante que contiene el extracto nuclear a un nuevo tubo precargado y manténgalo en hielo hasta su uso.Retire el 10 % del volumen de los extractos nucleares y citoplasmáticos como muestras de entrada; luego, agregue PBS frío a los extractos restantes hasta un volumen final de un mililitro. Mantenga en hielo hasta su uso. Después de pre-limpiar las perlas magnéticas conjugadas con proteína G si es necesario, combine 40 microlitros de perlas magnéticas conjugadas con proteína G con cuatro microgramos de anticuerpo policlonal anti-RBM3 rápido o con IGG rápida como control negativo en 200 microlitros de PBST.Incube hasta temperatura ambiente en un rotador durante 40 minutos. Coloque los tubos en un soporte magnético y luego retire y deseche el sobrenadante. A continuación, lave las perlas una vez con 200 microlitros de PBST.Añada un mililitro de lisados diluidos a las perlas y incube en un rotador a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, coloque los tubos en el soporte magnético y aspire el sobrenadante. Añada 0,5 mililitros de PBST a las perlas y lávelas tres veces en un rotador a cuatro grados Celsius, con una velocidad fija de 20 rpm durante 10 minutos.Eluir la proteína de las perlas añadiendo 40 microlitros de tampón de muestra, luego calentar la muestra a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Después de centrifugar las perlas, transferir el líquido a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para realizar inmunocitoquímica, sembrar células HEK293 a 1,5 veces 10 a la cuatro células por cámara en una placa de ocho cámaras recubierta con polilisina.En 0,4 mililitros de DMEM suplementado con 10% FPS y 100 unidades por mililitro de penstrep. Incube las células a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 48 horas, luego aspire el medio y use PFA al 4% para fijar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos en una cabina de flujo laminar. A continuación, aspire el PFA y use 0,5 mililitros de PBS por cámara para lavar las células tres veces.Añada 0,5 % de Triton X100 con 5 % de NGS y PBS para permeabilizar y bloquear las células e incube a temperatura ambiente durante una hora. Luego, después de diluir los anticuerpos primarios monoclonales anti-NF90 y policlonales anti-RBM3 uno a 100, agregue los anticuerpos primarios a los pocillos e incube en agitador a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use 0,5 mililitros de PBS para lavar las cámaras tres veces durante 10 minutos cada vez.Para realizar la inmunocitoquímica, agregue una dilución de uno a 500 de anticuerpos antirratón acoplados a un colorante fluorescente verde y anticuerpos anticonejo acoplados a un colorante fluorescente rojo a las células, e incube a temperatura ambiente durante una hora. Agregue una dilución de uno a 5.000 de DAPHE NBPS para contrastar los núcleos e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego lave las muestras con PBS como antes. Retire las cámaras del portaobjetos de vidrio y séquelas, antes de montarlas utilizando 250 microlitros de medio de montaje por portaobjetos.Para preparar las sondas del ensayo de ligación por proximidad en tubos, tras incubar las células y los anticuerpos primarios y lavar como se acaba de demostrar, diluya las sondas preelaboradas uno a cinco en tritonx100 al 0,1 %, NGS al 5 % y PBS, en un volumen total de 320 microlitros para un portaobjetos de ocho cámaras. Incube la solución a temperatura ambiente durante 20 minutos. Retire las cámaras del lado de vidrio y agregue las sondas diluidas, luego incube las cámaras en un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante una hora.Prepare una solución de ligación mezclando ocho microlitros de ligasa, 64 microlitros de tampón concentrado de ligación 5x y 248 microlitros de agua. Elimine el líquido del portaobjetos y lave las muestras dos veces con tampón de lavado A 1x, cinco minutos cada vez. Añada la solución de ligación a las muestras e incúbelas en un incubador húmedo a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Prepare la solución de amplificación mezclando cuatro microlitros de polimerasa, 64 microlitros de tampón concentrado de amplificación 5x y 252 microlitros de agua, y envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. A continuación, elimine el líquido del portaobjetos y lave las muestras dos veces con tampón de lavado A 1x, durante dos minutos cada vez. Añada la solución de amplificación a las muestras e incube a 37 grados Celsius en un incubador oscuro y húmedo durante 100 minutos.Luego, después de eliminar el líquido como antes, lave las muestras dos veces durante 10 minutos cada vez con el tampón de lavado B, antes de lavarlas una vez con tampón de lavado B 0,1 x. Finalmente, seque el portaobjetos y monte las muestras con 250 microlitros de un medio de montaje comercial con DAPHE, examine la fluorescencia bajo un microscopio y adquiera imágenes con una cámara CCD. Experimentos de coinmunoprecipitación con RBM3 como proteína atrayente revelaron que las interacciones NF90-RBM3 están predominantemente presentes en el núcleo y una minoría se encuentran en el citoplasma. En este experimento de inmunofluorescencia, tanto NF90 como RBM3 se observan en el núcleo.Ambas proteínas también se encuentran en el citoplasma en C2, y ambas muestran una colocalización perfecta en cada compartimento. Como se observa en estas imágenes, el ensayo de ligación por proximidad reveló el patrón de interacciones entre NF90 y RBM3, que es muy similar al de la inmunocitoquímica convencional, con la mayoría de las interacciones en el núcleo en la mayor parte de las células. Solo una pequeña proporción de células mostró una distribución predominantemente citoplasmática de las interacciones entre NF90 y RBM3.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, aunque es más conveniente, el PLA no refleja directamente las interacciones entre proteínas. En cambio, la co-inmunoprecipitación detecta interacciones dirigidas. Además, la especificidad del anticuerpo primario determina la calidad del resultado.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elegir un método adecuado para estudiar las interacciones proteína-proteína en diferentes compartimentos celulares según su propio objetivo experimental.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

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Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de digestión en la membrana para la preparación de muestras para espectrometría de masas. Esta técnica facilita el análisis conveniente de las interacciones proteína-proteína.

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Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Descrito es un flujo de trabajo proteómico para identificar socios de interacción de proteínas a partir de una fracción subcelular nuclear utilizando el enriquecimiento de inmunoafinidad de una proteína dada de interés y espectrometría de masas sin etiquetas. El flujo de trabajo incluye fraccionamiento subcelular, inmunoprecipitación, preparación de muestras asistidas por filtro, limpieza fuera de línea, espectrometría de masas y una canalización bioinformática aguas abajo.

Flujo de trabajo de espectrometría de masas de inmunoprecipitación sin etiquetas para la generación de perfiles de interactome nuclear a gran escala

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

Las interacciones proteína-proteína son importantes para dilucidar la función de las proteínas diana, y la coinmunoprecipitación (co-IP) puede confirmar fácilmente los IBP. Transfectamos transitoriamente un plásmido que codifica una proteína marcada con un epítopo en células HEK-293 y desarrollamos un método de inmunoprecipitación para confirmar fácilmente la unión de dos proteínas objetivo.

Inmunoprecipitación con un gel de afinidad anti-epítopo para estudiar las interacciones proteína-proteína

Aprende a comparar co-inmunoprecipitación y ensayo de ligadura de proximidad para visualizar interacciones proteína-proteína en compartimentos nucleares y citoplasmáticos usando células HEK293.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y In Situ Ligadura ensayo de proximidad (Video) | JoVE Journal

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y

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