La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y In Situ Ligadura ensayo de proximidad

El objetivo general de este experimento es comparar las ventajas y desventajas de la co-inmunoprecipitación, o co-ip, y el ensayo de ligadura de proximidad, o pla, en la visualización de las interacciones proteína-proteína en diferentes compartimentos celulares. La comparación aquí presentada de dos métodos diferentes puede ayudar a los científicos a decidir cuál es el más adecuado para su propósito específico al investigar los patrones de distribución de las interacciones proteína-proteína en el núcleo y el citoplasma de una célula. La principal ventaja de co-ip es que detecta interacciones auténticas entre proteínas y proteínas.

Por el contrario, el beneficio del pla es analizar las interacciones proteína-proteínas del instituto de una manera rápida a nivel de una sola célula. Después de cultivar y cosechar células hex293 de acuerdo con el protocolo de texto, a 3 veces 10 a la sexta celda, agregue 300 microlitros de solución de extracción citoplasmática fría y vórtice las células a la velocidad más alta durante 15 segundos. Incubar el extracto en hielo durante 30 minutos, y cada 10 minutos durante la incubación, vórtice la muestra durante cinco segundos.

A continuación, añada 16,5 microlitros de solución fría de extracción citoplasmática, agite el vórtice durante cinco segundos e incube la muestra en hielo durante cinco minutos. Agitar el extracto durante cinco segundos y centrifugar la muestra a 16.000 x g y 4 grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo preenfriado y manténgalo en hielo hasta su uso, luego use un mililitro de PBS frío para lavar los gránulos insolubles tres veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo y eliminando el PBS después de cada lavado.

A continuación, agregue 150 microlitros de solución de extracción nuclear fría, agite el vórtice durante 15 segundos e incube en hielo durante una hora. Cada 10 minutos durante la incubación, agite la muestra durante 15 segundos y use una punta de 200 microlitros para pipetear la solución 10 veces. Agite el tubo durante 15 segundos y centrifugue la muestra a 16.000 x g a 4 grados centígrados durante 10 minutos, luego transfiera el sobrenadante que contiene el extracto nuclear a un nuevo tubo preenfriado y manténgalo en hielo hasta su uso.

Retire el 10% de cada uno del volumen de extractos nucleares y citoplasmáticos como entradas, luego agregue PBS frío a los extractos restantes hasta un volumen final de un mililitro. Mantener en hielo hasta su uso. Después de preaclarar las perlas magnéticas conjugadas de proteína g, si es necesario, combine 40 microlitros de perlas magnéticas conjugadas de proteína g con cuatro microgramos de anticuerpo policlonal rápido anti-RBM3, o IGG rápido como control negativo en 200 microlitros de PBST.

Incubar hasta temperatura ambiente en un rotador durante 40 minutos. Coloque los tubos en una rejilla magnética, luego retire y deseche el supernatent. Luego, con 200 microlitros de PBST, lave las perlas una vez.

Agregue un mililitro de lisados diluidos a las perlas e incube en un rotador a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, coloque los tubos en la rejilla magnética y aspire el supernatent. Agregue 0,5 mililitros de PBST a las perlas y lávelas tres veces en un rotador a cuatro grados centígrados, con una velocidad fija de 20 rpm durante 10 minutos.

Eluya la proteína de las perlas agregando 40 microlitros de tampón de muestra, luego caliente la muestra a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Después de girar las cuentas, transfiera el líquido a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para llevar a cabo la química inmunocítica, siembre las células HEK293 a 1,5 veces 10 por las cuatro células por cámara en un portaobjetos recubierto de polidelisina de ocho cámaras.

En 0,4 mililitros de DMEM suplementado con 10%FPS y 100 unidades por mililitro de penstrep. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas, luego aspirar el medio y usar 4% de PFA para fijar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos en una campana de flujo laminar. A continuación, aspire el PFA y utilice 0,5 mililitros de PBS por cámara para lavar las células tres veces.

Añadir 0,5%tritonX100 con 5%NGS y PBS para permeabilizar y bloquear las células e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Luego, después de diluir los anticuerpos primarios monoclonales anti NF90 y policlonales anti RBM3 de uno a 100, agregue anticuerpos primarios a los pocillos e incube en el agitador a cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, use 0,5 mililitros de PBS para lavar las cámaras tres veces durante 10 minutos cada una.

Para llevar a cabo la química inmunocítica, agregue una dilución de uno a 500 de anticuerpos antiratón acoplados a colorante fluorescente verde y antirabbit acoplados a colorante fluorescente rojo a las células, e incube a temperatura ambiente durante una hora. Añadir una dilución de uno a 5.000 de DAPHE NBPS para contratinción de los núcleos e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego lavar las muestras con PBS como antes. Retire las cámaras del portaobjetos de vidrio y séquelas, antes de usar 250 microlitros de medio de montaje por portaobjetos para montarlas.

Para preparar las sondas de ensayo de ligadura de proximidad del tubo, después de incubar las células y los anticuerpos primarios, y lavar como se acaba de demostrar, diluir las sondas prefabricadas de uno a 5 en 0,1% tritonx100 y 5% NGS y PBS, en un volumen total de 320 micorrlitros para un portaobjetos de ocho cámaras. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 20 minutos. Retire las cámaras del lado de vidrio y agregue las sondas diluidas, luego incube las cámaras en una incubadora de humedad a 37 grados centígrados durante una hora.

Prepare una solución de ligadura mezclando ocho microlitros de ligasa, 64 microlitros de material de ligadura 5x y 248 microlitros de agua. Retire el líquido del portaobjetos y utilice el tampón de lavado onex A para lavar las muestras dos veces durante cinco minutos cada una. Agregue la solución de ligadura a las muestras e incube en una incubadora de humedad a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Prepare la solución de amplificación mezclando cuatro microlitros de polimerasa, 64 microlitros de material de amplificación 5x y 252 microlitros de agua, y envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz. A continuación, retira el líquido del portaobjetos y utiliza un tampón de lavado A para lavar las muestras dos veces durante dos minutos cada una. Agregue la solución de amplificación a las muestras e incube a 37 grados centígrados en una incubadora oscura y húmeda durante 100 minutos.

Luego, después de golpear el líquido como antes, lave las muestras dos veces durante 10 minutos cada una en el tampón de lavado B antes de lavarlas una vez en 0.1 x tampón de lavado B. Finalmente, seque el portaobjetos y monte las muestras con 250 microlitros de medio de montaje comercial con DAPHE, examine la fluorescencia bajo un microscopio y adquiera imágenes con una cámara CCD. Los experimentos de coinmunoprecipitación con RBM3 como proteína cebo revelaron que las interacciones NF90-RBM3 están predominantemente presentes en el núcleo y una minoría se encuentra en el citoplasma. En este experimento de inmunofluorescencia, NF90 y RBM3 se observan en el núcleo.

Ambas proteínas también se encuentran en el citoplasma en C2, y ambas proteínas muestran una colocalización perfecta en cada compartimento. Como se ve en estas imágenes, el ensayo de ligadura de proximidad reveló el patrón de interacciones NF90-RBM3, que es muy similar a la química inmunocítica convencional, que la mayoría de las interacciones en el núcleo de la mayoría de las células. Solo una pequeña proporción de células mostró una distribución citoplasmática predominante de las interacciones NF90-RBM3.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que, aunque es más conveniente, el PLA no refleja directamente las interacciones proteína-proteína. En su lugar, co-ip detecta la interacción dirigida. Además, la especificidad del anticuerpo primario determina la calidad del resultado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elegir un método apropiado para estudiar las interacciones de proteínas en diferentes compartimentos celulares de acuerdo con su propio propósito experimental.