Name: Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a cuantificar la expresión génica en células individuales mediante qPCR microfluídica con estándares internos. Este método permite medir múltiples genes simultáneamente de forma rentable en biología de célula única.

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Nos gustaría dar las gracias a V. Kapoor en el CCR ETIB Citometría de Flujo Core por su ayuda en la realización de la clasificación de células durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos también a la Unidad de Diagnóstico Molecular CCR LP M. y J. Raffeld y Zhu y el NHLBI ADN Secuenciación y Genómica por su ayuda en la realización de la qPCR durante el desarrollo de este protocolo. Esta investigación fue apoyada por el Programa Intramural del NIH.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos presentado un método para aislar células de mamíferos individuales de una población de células adherentes cultivadas en cultivo y para someter a ensayo la expresión de aproximadamente 96 genes en cada célula. Buena preparación previa es fundamental para que este método funcione bien. En particular, el diseño y las pruebas de imprimación pares específicos de las transcripciones de interés (pasos 1.2-1.3) son mucho tiempo, pero importantes pasos, como los cebadores determinan la calidad de las mediciones de una sola...

Las células individuales en una población pueden mostrar respuestas muy diferentes a un estímulo fisiológico uniforme 1, 2, 3, 4. La variación genética de las células en una población es un mecanismo para esta variedad de respuestas, pero también hay varios factores no genéticos que pueden aumentar la variabilidad de respuestas, incluso en una población clonal de células. Por ejemplo, los niveles de proteínas individuales y otras moléculas de señalización importantes pueden variar sobre una base de celda por celda, dando lugar a la variación en los perfiles de expresión de genes aguas abajo. Además, la activación de genes puede ocurrir en ráfagas de corta duración de las transcripciones de 5, 6 que puede estar limitado a un número relativamente pequeño de las transcripciones por ráfaga 7, 8, 9. Talestocasticidad en la activación de genes puede contribuir en gran medida a la variabilidad en las respuestas biológicas y puede proporcionar una ventaja selectiva en los microorganismos 10 y en células de mamíferos 1, 2 de responder a un estímulo fisiológico. Debido a ambas fuentes genéticos y no genéticos de variación, el perfil de expresión génica de cualquier célula dada en respuesta a un estímulo puede diferir en gran medida de perfil de expresión génica medio obtenido de la medición de la respuesta a granel. La determinación de la medida en la que las células individuales muestran variabilidad en la respuesta a un estímulo requiere de técnicas para el aislamiento de células individuales, la medición de los niveles de expresión de los transcritos de interés, y el análisis computacional de los datos de expresión resultantes. Existen varios enfoques para ensayar la expresión génica en células individuales, que cubren una amplia gama de costos, número de transcripciones sondeó, yexactitud de la cuantificación. Por ejemplo, una sola célula RNA-Seq ofrece una amplia profundidad de la cobertura transcripción y la capacidad de cuantificar miles de distintas transcripciones de los genes más altamente expresado en las células individuales; sin embargo, el costo asociado con tal profundidad de secuenciación puede ser prohibitivo, aunque los costos continúan disminuyendo. Por el contrario, una sola molécula de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH smRNA) ofrece una cuantificación precisa de las transcripciones para incluso bajo la expresión de genes a un costo razonable por gen de interés; sin embargo, sólo un pequeño número de genes diana puede ensayarse en una célula dada por este enfoque. ensayos basados ​​en PCR cuantitativa, que se describe en este protocolo, proporcionan un término medio entre estas técnicas. Estos ensayos emplean una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos para cuantificar hasta 96 transcripciones de interés en un momento en hasta 96 células. Si bien cada uno de los métodos antes mencionados tiene los costos de hardware necesarios, el costo de cualquier ensayo qPCR individuo es relativamentebajo. Este protocolo es una adaptación de uno sugerido por el fabricante de una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos (Protocolo de ADP 41, Fluidigm). Para habilitar la estimación del número absoluto de cada una transcripción en un enfoque basado en la PCR, hemos ampliado el protocolo para hacer uso de los controles internos de los amplicones del gen diana preparados que se pueden utilizar a través de múltiples experimentos. Como ejemplo de esta técnica, la cuantificación de la expresión de genes regulados por la p53 supresor de tumores en células MCF-7 de carcinoma de mama humano se describe 11. Las células se expusieron a un agente químico que induce ADN de doble filamento se rompe. Estudios anteriores han demostrado que la respuesta de p53 al ADN doble filamento se rompe exhibe una gran cantidad de heterogeneidad en las células individuales, tanto en términos de los niveles de p53 12 y en la activación de genes diana distintas 11. Además, p53 regula la expresión de más de 100bien caracterizado los genes diana implicados en numerosas vías aguas abajo, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis, la senescencia y 13, 14. Puesto que la respuesta mediada por p53 en cada celda es complejo y variable, el análisis de los beneficios del sistema a partir de un enfoque en el que cerca de 100 genes diana se puede probar de forma simultánea en las células individuales, como la que se describe a continuación. Con ligeras modificaciones (tales como métodos alternativos para el aislamiento de células individuales y la lisis), el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar una amplia gama de tipos de células de mamíferos, transcripciones, y las respuestas celulares. Con una preparación previa adecuada, una ronda de clasificación de células y medida de la expresión génica puede llevarse a cabo de acuerdo con este protocolo en un período de tres días. El siguiente calendario se sugiere: por adelantado, seleccionar las transcripciones de interés, identificar y validar los pares de cebadores que amplifican el ADNc a partir de los transcrIPTS, y preparar las normas y las mezclas de iniciadores que utilizan estos cebadores. En el Día 1, después del tratamiento de células, la cosecha y ordenar las células, lleve a cabo la transcripción inversa y la amplificación de la diana específica y el tratamiento de las muestras con una exonucleasa para eliminar los cebadores no incorporados. En el día 2, lleve a cabo el control de calidad en células clasificadas utilizando qPCR. Por último, el día 3, medir la expresión génica en las células clasificadas utilizando microfluidos qPCR. La Figura 1 resume los pasos involucrados.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de RNasa</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S Kit de</td><td></td></tr><tr><td>extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de ensayo de dsDNA de alta sensibilidad</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baja adherencia de 2,0 ml USA</td><td>Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de suspensión de ADN</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Tubos de PCR de pared delgada</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Kit de reactivos de carga de ensayo</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 medios</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado (EE. UU.)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatina</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINasa</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsKit qRT-PCR directo de un solo paso</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado ThermalSeal, estéril</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Filtro de células</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix con bajo ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC para la expresión génica (chip qPCR microfluídico)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>Controlador IFC HX (máquina de carga)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark o BioMark HD (máquina de qPCR microfluídica)</td><td>Software</td> de análisis de PCR en tiempo real Fluidigm<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Software Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una sola célula de perfiles de expresión génica el uso de facs y qpcr con las normas internas

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Las mediciones de la expresión génica de poblaciones masivas de células pueden oscurecer la considerable variación transcriptómica de las células individuales dentro de esas poblaciones. Las mediciones de la expresión génica de una sola célula pueden ayudar a evaluar el papel del ruido en la expresión génica, identificar correlaciones en la expresión de pares de genes y revelar subpoblaciones de células que responden de manera diferente a un estímulo. En este trabajo describimos un procedimiento para medir la expresión de hasta 96 genes en células individuales de mamífero aisladas de una población en cultivo de tejidos. Las células se clasifican en tampón de lisis mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y las especies de ARNm de interés se transcriben y amplifican de forma inversa. A continuación, se mide la expresión génica utilizando una máquina de PCR microfluídica en tiempo real, que realiza hasta 96 ensayos de qPCR en hasta 96 muestras a la vez. También describimos la generación y el uso de patrones de amplicón de PCR para permitir la estimación del número absoluto de cada transcripción. En comparación con otros métodos de medición de la expresión génica en células individuales, este enfoque permite la cuantificación de transcripciones más distintas que el ARN FISH a un costo menor que el ARN-Seq.

Una visión general del protocolo se muestra en la Figura 1, incluyendo los pasos para el tratamiento de células, el aislamiento de células individuales mediante FACS, la generación y pre-amplificación de las bibliotecas de ADNc a partir de lisados de una sola célula, la confirmación de bibliotecas de ADNc de una sola célula en pozos ordenados, y la medición de la expresión génica por qPCR. En preparación para ...

Describimos un método para clasificar células individuales de mamíferos y cuantificar la expresión de hasta 96 genes diana de interés en cada célula. Este método incluye el uso de estándares internos de qPCR para permitir la estimación de recuentos absolutos de transcripciones.

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los niveles de ARNm en células individuales mediante qPCR microfluídica con estándares internos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de célula individual, como si las poblaciones celulares responden a un estímulo de maneras característicamente diferentes. La ventaja principal de esta técnica es que puede medir la expresión de más genes que la hibridación in situ con ARN (RNA FISH) y a un costo menor que la secuenciación de ARN (RNA-Seq) en células individuales.La idea de este método surgió por primera vez cuando explorábamos protocolos para medir la expresión génica en células individuales mediante qPCR microfluídica. Queríamos modificar los métodos existentes para estimar con mayor precisión el número absoluto de diferentes transcritos en células individuales. William Telford, el encargado de la instalación de citometría de flujo utilizada por mi laboratorio, demostrará el procedimiento de clasificación celular.Después de generar y purificar amplicones de los genes de interés según el protocolo descrito en el texto, combine 18 microlitros de cada amplicón purificado en un tubo micr

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

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Investigación

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Genética

Perfiles de expresión de células individuales permite el análisis detallado de la expresión génica de células individuales. Se describen los métodos para el aislamiento de los cardiomiocitos, y la preparación de los lisados ​​resultantes, ya sea para toda microarrays transcriptoma o qPCR de objetivos específicos.

Perfiles de transcripción de los organismos unicelulares de los cardiomiocitos de ratón adulto

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Se necesita ensayo de expresión de un solo gen celular para comprender las heterogeneidades de células madre.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Los cromosomas de diseño del proyecto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, se pueden distinguir de sus homólogos nativos utilizando un ensayo de genotipado basado en PCR llamado PCRTagging, que tiene un punto final de presencia/ausencia. Aquí describimos un método de detección de PCR en tiempo real de alto rendimiento para el genotipado de PCRTag.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

Este protocolo describe la forma de evaluar la expresión de una gran variedad de genes a nivel clonal. Una sola célula de RT-qPCR produce resultados altamente fiables con una fuerte sensibilidad para cientos de muestras y los genes.

Una sola célula de la expresión génica utilizando multiplex RT-qPCR para caracterizar heterogeneidad de las poblaciones linfoides Raras

A granel gene expresión medidas nube célula individual diferencias en poblaciones celulares heterogéneas. Aquí, describimos un protocolo para análisis de expresión génica e índice cómo sola célula clasificación de Florescence activa célula clasificación (FACS) puede combinarse para delinear la heterogeneidad y immunophenotypically caracterizar poblaciones celulares molecularmente distintos.

Una combinatoria unicelular enfoque para caracterizar Molecular y heterogeneidad de Immunophenotypic de madre humana y de las poblaciones progenitoras

Este método describe los pasos para mejorar la calidad y la cantidad de datos de secuencia que se pueden obtener a partir de muestras de ARN incrustadas de parafina fija de formalina (FFPE). Describimos la metodología para evaluar con mayor precisión la calidad de las muestras de FFPE-RNA, preparar bibliotecas de secuenciación y analizar los datos de muestras de ARN FFPE.

Optimización para la secuenciación y el análisis de muestras de FFPE-ARN degradadas

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH) es un método para cuantificar con precisión los niveles y la localización de ARN específicos a nivel de una sola célula. Aquí, informamos nuestros protocolos de laboratorio validados para el procesamiento de bancos húmedos, imágenes y análisis de imágenes para la cuantificación de células individuales de ARN específicos.

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Aprende a cuantificar la expresión génica en células individuales mediante qPCR microfluídica con estándares internos. Este método permite medir múltiples genes simultáneamente de forma rentable en biología de célula única.

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

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