Name: Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a cuantificar la expresión génica en células individuales mediante qPCR microfluídica con estándares internos. Este método permite medir múltiples genes simultáneamente de forma rentable en biología de célula única.

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Nos gustaría dar las gracias a V. Kapoor en el CCR ETIB Citometría de Flujo Core por su ayuda en la realización de la clasificación de células durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos también a la Unidad de Diagnóstico Molecular CCR LP M. y J. Raffeld y Zhu y el NHLBI ADN Secuenciación y Genómica por su ayuda en la realización de la qPCR durante el desarrollo de este protocolo. Esta investigación fue apoyada por el Programa Intramural del NIH.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos presentado un método para aislar células de mamíferos individuales de una población de células adherentes cultivadas en cultivo y para someter a ensayo la expresión de aproximadamente 96 genes en cada célula. Buena preparación previa es fundamental para que este método funcione bien. En particular, el diseño y las pruebas de imprimación pares específicos de las transcripciones de interés (pasos 1.2-1.3) son mucho tiempo, pero importantes pasos, como los cebadores determinan la calidad de las mediciones de una sola...

Las células individuales en una población pueden mostrar respuestas muy diferentes a un estímulo fisiológico uniforme 1, 2, 3, 4. La variación genética de las células en una población es un mecanismo para esta variedad de respuestas, pero también hay varios factores no genéticos que pueden aumentar la variabilidad de respuestas, incluso en una población clonal de células. Por ejemplo, los niveles de proteínas individuales y otras moléculas de señalización importantes pueden variar sobre una base de celda por celda, dando lugar a la variación en los perfiles de expresión de genes aguas abajo. Además, la activación de genes puede ocurrir en ráfagas de corta duración de las transcripciones de 5, 6 que puede estar limitado a un número relativamente pequeño de las transcripciones por ráfaga 7, 8, 9. Talestocasticidad en la activación de genes puede contribuir en gran medida a la variabilidad en las respuestas biológicas y puede proporcionar una ventaja selectiva en los microorganismos 10 y en células de mamíferos 1, 2 de responder a un estímulo fisiológico. Debido a ambas fuentes genéticos y no genéticos de variación, el perfil de expresión génica de cualquier célula dada en respuesta a un estímulo puede diferir en gran medida de perfil de expresión génica medio obtenido de la medición de la respuesta a granel. La determinación de la medida en la que las células individuales muestran variabilidad en la respuesta a un estímulo requiere de técnicas para el aislamiento de células individuales, la medición de los niveles de expresión de los transcritos de interés, y el análisis computacional de los datos de expresión resultantes. Existen varios enfoques para ensayar la expresión génica en células individuales, que cubren una amplia gama de costos, número de transcripciones sondeó, yexactitud de la cuantificación. Por ejemplo, una sola célula RNA-Seq ofrece una amplia profundidad de la cobertura transcripción y la capacidad de cuantificar miles de distintas transcripciones de los genes más altamente expresado en las células individuales; sin embargo, el costo asociado con tal profundidad de secuenciación puede ser prohibitivo, aunque los costos continúan disminuyendo. Por el contrario, una sola molécula de ARN hibridación in situ fluorescente (FISH smRNA) ofrece una cuantificación precisa de las transcripciones para incluso bajo la expresión de genes a un costo razonable por gen de interés; sin embargo, sólo un pequeño número de genes diana puede ensayarse en una célula dada por este enfoque. ensayos basados ​​en PCR cuantitativa, que se describe en este protocolo, proporcionan un término medio entre estas técnicas. Estos ensayos emplean una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos para cuantificar hasta 96 transcripciones de interés en un momento en hasta 96 células. Si bien cada uno de los métodos antes mencionados tiene los costos de hardware necesarios, el costo de cualquier ensayo qPCR individuo es relativamentebajo. Este protocolo es una adaptación de uno sugerido por el fabricante de una máquina de PCR en tiempo real de microfluidos (Protocolo de ADP 41, Fluidigm). Para habilitar la estimación del número absoluto de cada una transcripción en un enfoque basado en la PCR, hemos ampliado el protocolo para hacer uso de los controles internos de los amplicones del gen diana preparados que se pueden utilizar a través de múltiples experimentos. Como ejemplo de esta técnica, la cuantificación de la expresión de genes regulados por la p53 supresor de tumores en células MCF-7 de carcinoma de mama humano se describe 11. Las células se expusieron a un agente químico que induce ADN de doble filamento se rompe. Estudios anteriores han demostrado que la respuesta de p53 al ADN doble filamento se rompe exhibe una gran cantidad de heterogeneidad en las células individuales, tanto en términos de los niveles de p53 12 y en la activación de genes diana distintas 11. Además, p53 regula la expresión de más de 100bien caracterizado los genes diana implicados en numerosas vías aguas abajo, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis, la senescencia y 13, 14. Puesto que la respuesta mediada por p53 en cada celda es complejo y variable, el análisis de los beneficios del sistema a partir de un enfoque en el que cerca de 100 genes diana se puede probar de forma simultánea en las células individuales, como la que se describe a continuación. Con ligeras modificaciones (tales como métodos alternativos para el aislamiento de células individuales y la lisis), el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar una amplia gama de tipos de células de mamíferos, transcripciones, y las respuestas celulares. Con una preparación previa adecuada, una ronda de clasificación de células y medida de la expresión génica puede llevarse a cabo de acuerdo con este protocolo en un período de tres días. El siguiente calendario se sugiere: por adelantado, seleccionar las transcripciones de interés, identificar y validar los pares de cebadores que amplifican el ADNc a partir de los transcrIPTS, y preparar las normas y las mezclas de iniciadores que utilizan estos cebadores. En el Día 1, después del tratamiento de células, la cosecha y ordenar las células, lleve a cabo la transcripción inversa y la amplificación de la diana específica y el tratamiento de las muestras con una exonucleasa para eliminar los cebadores no incorporados. En el día 2, lleve a cabo el control de calidad en células clasificadas utilizando qPCR. Por último, el día 3, medir la expresión génica en las células clasificadas utilizando microfluidos qPCR. La Figura 1 resume los pasos involucrados.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad con inhibidor de RNasa</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S Kit de</td><td></td></tr><tr><td>extracción de gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de ensayo de dsDNA de alta sensibilidad</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baja adherencia de 2,0 ml USA</td><td>Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de suspensión de ADN</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Tubos de PCR de pared delgada</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Kit de reactivos de carga de ensayo</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 medios</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado (EE. UU.)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatina</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINasa</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsKit qRT-PCR directo de un solo paso</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado ThermalSeal, estéril</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Filtro de células</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix con bajo ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC para la expresión génica (chip qPCR microfluídico)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>Controlador IFC HX (máquina de carga)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark o BioMark HD (máquina de qPCR microfluídica)</td><td>Software</td> de análisis de PCR en tiempo real Fluidigm<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Software Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una sola célula de perfiles de expresión génica el uso de facs y qpcr con las normas internas

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Las mediciones de la expresión génica de poblaciones masivas de células pueden oscurecer la considerable variación transcriptómica de las células individuales dentro de esas poblaciones. Las mediciones de la expresión génica de una sola célula pueden ayudar a evaluar el papel del ruido en la expresión génica, identificar correlaciones en la expresión de pares de genes y revelar subpoblaciones de células que responden de manera diferente a un estímulo. En este trabajo describimos un procedimiento para medir la expresión de hasta 96 genes en células individuales de mamífero aisladas de una población en cultivo de tejidos. Las células se clasifican en tampón de lisis mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y las especies de ARNm de interés se transcriben y amplifican de forma inversa. A continuación, se mide la expresión génica utilizando una máquina de PCR microfluídica en tiempo real, que realiza hasta 96 ensayos de qPCR en hasta 96 muestras a la vez. También describimos la generación y el uso de patrones de amplicón de PCR para permitir la estimación del número absoluto de cada transcripción. En comparación con otros métodos de medición de la expresión génica en células individuales, este enfoque permite la cuantificación de transcripciones más distintas que el ARN FISH a un costo menor que el ARN-Seq.

Una visión general del protocolo se muestra en la Figura 1, incluyendo los pasos para el tratamiento de células, el aislamiento de células individuales mediante FACS, la generación y pre-amplificación de las bibliotecas de ADNc a partir de lisados de una sola célula, la confirmación de bibliotecas de ADNc de una sola célula en pozos ordenados, y la medición de la expresión génica por qPCR. En preparación para ...

Describimos un método para clasificar células individuales de mamíferos y cuantificar la expresión de hasta 96 genes diana de interés en cada célula. Este método incluye el uso de estándares internos de qPCR para permitir la estimación de recuentos absolutos de transcripciones.

Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los niveles de ARNm en células individuales mediante qPCR microfluídica con estándares internos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de célula individual, como si las poblaciones celulares responden a un estímulo de maneras característicamente diferentes. La ventaja principal de esta técnica es que puede medir la expresión de más genes que la hibridación in situ con ARN (RNA FISH) y a un costo menor que la secuenciación de ARN (RNA-Seq) en células individuales.La idea de este método surgió por primera vez cuando explorábamos protocolos para medir la expresión génica en células individuales mediante qPCR microfluídica. Queríamos modificar los métodos existentes para estimar con mayor precisión el número absoluto de diferentes transcritos en células individuales. William Telford, el encargado de la instalación de citometría de flujo utilizada por mi laboratorio, demostrará el procedimiento de clasificación celular.Después de generar y purificar amplicones de los genes de interés según el protocolo descrito en el texto, combine 18 microlitros de cada amplicón purificado en un tubo microcentrífugo de baja unión de 2,0 mililitros y luego agregue tampón de suspensión de ADN hasta completar 1.800 microlitros, de modo que la concentración de cada amplicón sea de cinco veces 10 a la sexta moléculas por microlitro. Agite vigorosamente el estándar 5e6 y divídalo en alícuotas de 20 microlitros en tubos PCR de baja unión. Después de sembrar células MCF7 p53-Venus según el protocolo descrito en el texto, agregue 400 nanogramos por mililitro de neocarzinostatina a las células y trátelas durante 3, 8,5, 14 o 24 horas.Para preparar el tampón de lisis, combine los reactivos enumerados en esta tabla. Transfiera 92,4 microlitros del tampón a un tubo separado para usarlo como tampón de lisis para los estándares de amplicón. El tampón de lisis restante se utilizará para las células.Prepare y agregue el ADN de E.coli al tampón de lisis para las células, según el protocolo descrito en el texto. Para preparar los patrones, etiquete seis tubos centrífugos de baja unión. Añada 90 microlitros de tampón de suspensión de ADN al tubo 5e5.Añada 90 microlitros de tampón que contenga 6,2 picogramos por microlitro de ADN de E.coli a cada uno de los otros cinco tubos y mantenga todos los tubos en hielo. Después de retirar una alícuota de 5e6 estándar del almacenamiento, vortexe brevemente el tubo, luego centrifúguelo para asegurar que el líquido esté en el fondo del tubo; a continuación, utilizando una punta de pipeta de baja retención, añada 10 microlitros del estándar 5e6 al tubo 5e5. Vortexe, centrifugue y devuelva el tubo al hielo.A continuación, pipete 10 microlitros del tubo 5e5 al tubo 5e4, luego agite brevemente el tubo con un vórtex, centrifúguelo y regrese el tubo al hielo. Repita las diluciones seriadas en cada tubo, agregando 10 microlitros del tubo anterior, hasta que todos los tubos contengan una dilución del patrón. Después de preparar los tubos de PCR con tampón de lisis, utilizando una pipeta de 12 canales, distribuya nueve microlitros de tampón de lisis celular desde la fila de tubos de PCR hacia cada pocillo de las primeras siete filas de una placa para PCR.Distribuya siete microlitros de tampón de lisis estándar en cada pocillo de la última fila de la placa, y luego, utilizando puntas de pipeta de baja retención, agregue dos microlitros de estándar en cada pocillo de la fila inferior según el mapa de la placa. Añada dos microlitros de 3,1 picogramos por microlitro de ADN de E.coli en los pocillos de 10 células y 100 células, luego agregue dos microlitros de 6,2 picogramos por microlitro de ADN de E.coli en los pocillos sin células. Después de programar el citómetro de flujo con clasificación por fluorescencia para ordenar en una placa de 96 pocillos según el mapa de la placa, para alinear el equipo, selle una placa PCR vacía y utilice el chorro de prueba para clasificar gotas y PBS sobre el sello de la placa vacía.Si las gotas no caen en la posición correcta, elimínelas de la superficie del sello, recalibre el clasificador de células según las instrucciones del fabricante del equipo y repita el procedimiento hasta que las gotas en el chorro de clasificación se depositen correctamente. Recoga las células mediante tripsinización y resuspenda las células en 0.5 mililitros de PBS con 2% de FBS, luego transfiera a un tubo de citometría de flujo. Para clasificar las células, inserte el tubo con la suspensión celular en el clasificador de células, abra el sello en la placa de tampón de lisis y clasifique cuidadosamente las células de interés en la placa según el mapa de la placa.Para asegurar que las células individuales se clasifiquen con la máxima pureza, ejecute la máquina en modo de célula individual y utilice el enriquecimiento estándar de citometría de flujo basado en la dispersión directa y lateral. Tras la corrida, use un sello térmico estéril nuevo para sellar la placa y centrifugue a 400 veces g a cuatro grados Celsius durante un minuto; luego coloque la placa en el termociclador y ejecute el programa RT-STA previamente preparado. Después de centrifugar la placa RT-STA completada, use una pipeta de 12 canales para distribuir 3,6 microlitros de exónucleasa I diluida en cada pocillo de la placa.Cierre y centrifugue brevemente la placa, luego coloque la placa en el ciclador térmico y ejecute el programa de exo I. Para medir la expresión del gen de mantenimiento en cada muestra, prepare 900 microlitros de la mezcla maestra de tinción de unión al ADN para qPCR para 96 reacciones utilizando cebadores de uno de los genes de mantenimiento seleccionados. Distribuya nueve microlitros de la mezcla maestra en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos, luego agregue un microlitro de muestra de la placa de muestras al pocillo correspondiente de la placa PCR.Corra la placa en una máquina de PCR en tiempo real utilizando un protocolo de ciclado térmico sugerido por el fabricante de la mezcla maestra o siguiendo un protocolo estándar, luego analice las muestras y elabore un mapa de placas de mezclas de muestras de acuerdo con el protocolo descrito. Etiquete una placa como mezclas de muestras y, utilizando una pipeta de ocho canales, distribuya 3,3 µL de la mezcla de mezcla maestra y reactivo de carga de muestra en cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos. Para cada placa PCR de muestras, agite la placa en vórtex durante 10 segundos y centrifúguela a 500 × g durante 10 segundos.Retire la tapa y transfiera 2,7 microlitros de cada muestra positiva de una célula al pozo correspondiente en la placa de mezclas de muestras, según los pozos de una célula indicados en el mapa de la placa. Retire la etiqueta adhesiva de la parte inferior de un nuevo chip microfluídico de qPCR; luego, utilizando una jeringa con líquido de control con la tapa aún puesta, presione cada resorte acumulador para aflojarlo e inyecte entre 100 y 200 microlitros de líquido de control en cada acumulador. Inserte el chip en la máquina de carga y ejecute el script de cebado; a continuación, utilizando una pipeta multicanal de ocho canales, transfiera 4,5 microlitros de cada mezcla de ensayo al lado izquierdo del chip microfluídico de qPCR.Es fundamental evitar la formación de burbujas de aire en el fondo de los pocillos. Esto causará problemas de carga. Para prevenirlo, toque las puntas de pipeta contra la pared del pocillo y luego aspire o expulse el líquido solo hasta el primer tope.Transfiera 4,5 microlitros de cada mezcla de muestra al lado derecho del chip de qPCR microfluídico, luego inserte el chip en la máquina de carga y ejecute el script de carga de la mezcla. Cuando finalice el script de carga de la mezcla, verifique que no haya líneas atravesando el chip, lo cual indicaría un problema de carga; a continuación, use cinta para retirar cuidadosamente cualquier partícula de polvo del chip, luego inserte el chip en la máquina de PCR en tiempo real microfluídica y ejecute el script de recopilación de datos. Finalmente, analice los datos según el protocolo descrito en el texto.Esta figura muestra los niveles de expresión de un gen de referencia medidos mediante qPCR para determinar qué pocillos recibieron una sola célula. Las muestras que recibieron una célula presentan valores de CT bajos. Las muestras sin célula tienen valores de CT mucho más altos.Los pocillos para el estándar de amplicón deben mostrar curvas de amplificación espaciadas uniformemente. También debe haber una clara separación entre las curvas de los pocillos sin células, con 10 células y con 100 células. Las muestras de ADN sembradas que representan células reales se seleccionan cuidadosamente de múltiples placas de 96 pocillos ordenadas y se combinan en una sola placa para preparar la qPCR en microfluido.Este mapa de calor resume los resultados de la qPCR en microfluidos. La variación de color en cada columna muestra la variabilidad en la expresión de cada gen entre diferentes células. Las dos filas que son mucho más oscuras que las demás probablemente representan muestras defectuosas.Al realizar este procedimiento, es importante mantener el área de trabajo libre de RNasas y de ADN, especialmente al preparar los patrones y el tampón de lisis. Las partes del protocolo previas a la PCR son sensibles a la contaminación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la expresión de múltiples genes de interés en células individuales.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la hibridación in situ de ARN a nivel de molécula individual, para validar las mediciones de la abundancia de ARNm en células individuales.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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