Una sola célula de perfiles de expresión génica El uso de FACS y qPCR con las Normas Internas

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar los niveles de ARNm en células individuales mediante qPCR microfluídica con estándares internos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de células individuales, como si las poblaciones celulares de células responden a un estímulo de maneras característicamente diferentes. La principal ventaja de esta técnica es que puede medir la expresión de más genes que el ARN FISH a un coste menor que el ARN-Seq en células individuales.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos explorando protocolos para medir la expresión génica en células individuales mediante qPCR microfluídica. Queríamos modificar los métodos existentes para estimar con mayor precisión el número absoluto de transcripciones diferentes en células individuales. William Telford, el director de la instalación de citometría de flujo utilizada por mi laboratorio, demostrará el procedimiento de clasificación de células.

Después de generar y purificar amplicones a partir de genes de interés de acuerdo con el protocolo de texto, combine 18 microlitros de cada amplicón purificado en un tubo de microcentrífuga de baja unión de 2.0 mililitros, luego agregue tampón de suspensión de ADN hasta 1,800 microlitros para que la concentración de cada amplicón sea cinco veces 10 a la sexta molécula por microlitro. Vértice a fondo el estándar 5e6 y divídalo en alícuotas de 20 microlitros en tubos de PCR de baja unión. Después de sembrar las células MCF7 p53-Venus de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 400 nanogramos por mililitro de neocarzinostatina a las células y trátelas durante tres, 8,5, 14 o 24 horas.

Para hacer tampón de lisis, combine los reactivos enumerados en esta tabla. Transfiera 92,4 microlitros del tampón a un tubo separado para que sirva como tampón de lisis para los patrones de amplicón. El tampón de lisis restante será para las células.

Prepare y agregue ADN de E. coli al tampón de lisis para las células, según el protocolo de texto. Para preparar los estándares, etiquete seis tubos de centrífuga de baja fijación. Agregue 90 microlitros de tampón de suspensión de ADN al tubo 5e5.

Agregue 90 microlitros de tampón que contenga 6.2 picogramos por microlitro de ADN de E. coli a cada uno de los otros cinco tubos y mantenga todos los tubos en hielo. Después de retirar una alícuota del estándar 5e6 del almacenamiento, agite brevemente el tubo, luego gírelo para asegurarse de que el líquido esté en el fondo del tubo, luego, usando una punta de pipeta de enlace bajo, agregue 10 microlitros de estándar 5e6 al tubo 5e5. Vórtice, gira y vuelve a poner el tubo en hielo.

A continuación, pipetee 10 microlitros del tubo 5e5 en el tubo 5e4, luego haga un vórtice breve del tubo, gírelo y vuelva a poner el tubo en hielo. Repita las diluciones en serie con cada tubo, recibiendo 10 microlitros del tubo anterior hasta que todos los tubos tengan una dilución de estándar. Después de preparar los tubos de PCR con tampón de lisis, utilizando una pipeta de 12 canales, distribuya nueve microlitros de tampón de lisis celular de la fila de tubos de PCR a cada pocillo de las primeras siete filas de una placa de PCR.

Distribuya siete microlitros de tampón de lisis estándar a cada pocillo de la última fila de la placa, luego, usando puntas de pipeta de baja unión, agregue dos microlitros de estándar a cada pocillo de la fila inferior de acuerdo con el mapa de la placa. Agregue dos microlitros de 3.1 picogramos por microlitro de ADN de E. coli en los pocillos de 10 células y 100 células, luego agregue dos microlitros de 6.2 picogramos por microlitro de ADN de E. coli en los pocillos sin celdas. Después de programar el clasificador de células activado por fluorescencia para clasificar en una placa de 96 pocillos de acuerdo con el mapa de placas, para apuntar la máquina, selle una placa PCR vacía y use el flujo de prueba para clasificar gotas y PBS en el sello de la placa vacía.

Si las gotas no caen en la posición correcta, límpielas de la superficie del sello, vuelva a calibrar el clasificador de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la máquina y repita hasta que las gotas en el flujo de clasificación se depositen correctamente. Recolectar células por tripsinización y volver a suspenderlas en 0,5 mililitros de PBS con 2% de FBS, luego transferirlas a un tubo de citometría de flujo. Para clasificar las células, inserte el tubo con la suspensión celular en el clasificador de células, abra el sello de la placa de tampón de lisis y clasifique cuidadosamente las células de interés en la placa de acuerdo con el mapa de placas.

Para asegurarse de que las celdas individuales se clasifiquen con la máxima pureza, haga funcionar la máquina en modo de celda única y utilice la compuerta de citometría de flujo estándar basada en la dispersión frontal y lateral. Después de la ejecución, use un nuevo sello térmico estéril para sellar la placa y centrifugarla a 400 veces g durante cuatro grados Celsius durante un minuto, luego coloque la placa en el termociclador y ejecute el programa RT-STA previamente preparado. Después de girar la placa RT-STA completa, utilice una pipeta de 12 canales para distribuir 3,6 microlitros de exonucleasa I diluida en cada pocillo de la placa.

Selle y gire brevemente la placa, luego colóquela en el termociclador y ejecute el programa exo I. Para medir la expresión génica de mantenimiento en cada muestra, prepare 900 microlitros de mezcla maestra de qPCR con colorante de unión al ADN para 96 reacciones utilizando cebadores de uno de los genes de mantenimiento seleccionados. Distribuya nueve microlitros de mezcla maestra a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos, luego agregue un microlitro de muestra de la placa de muestra al pocillo correspondiente de la placa de PCR.

Ejecute la placa en una máquina de PCR en tiempo real utilizando un protocolo de ciclo térmico sugerido por el fabricante de la mezcla maestra o siguiendo un protocolo estándar, luego analice las muestras y haga un mapa de placas de mezclas de muestra de acuerdo con el protocolo de texto. Etiquete una placa de muestras de mezclas y luego, con una pipeta de ocho canales, distribuya 3,3 microlitros de mezcla maestra de mezcla maestra y mezcla de reactivo de carga de muestras en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Para cada placa de PCR de muestras, agite la placa durante 10 segundos y gírela a 500 veces g durante 10 segundos.

Retire la tapa y transfiera 2,7 microlitros de cada muestra positiva de una célula a su pocillo correspondiente en la placa de mezclas de muestras para los pocillos de una celda indicados en el mapa de placas. Despegue la etiqueta de la parte inferior de un nuevo chip de qPCR microfluídico, luego, con una jeringa de líquido de línea de control con la tapa aún puesta, empuje hacia abajo cada resorte del acumulador para aflojarlo e inyecte cada acumulador con 100 a 200 microlitros de líquido de línea de control. Inserte el chip en la máquina de carga y ejecute el script principal, luego, con una pipeta de ocho canales, transfiera 4,5 microlitros de cada mezcla de ensayo al lado izquierdo del chip qPCR microfluídico.

Es fundamental evitar la creación de burbujas de aire en el fondo de los pozos. Esto creará problemas de carga. Para evitar esto, toque las puntas de las pipetas contra el costado del pocillo y, a continuación, pipetee solo hasta el primer tope.

Transfiera 4,5 microlitros de cada mezcla de muestra al lado derecho del chip de qPCR microfluídico, luego inserte el chip en la máquina de carga y ejecute el script de mezcla de carga. Cuando termine el script de mezcla de carga, verifique que no haya líneas en el chip, lo que indicaría un problema de carga, luego use cinta adhesiva para eliminar cuidadosamente cualquier partícula de polvo del chip, luego inserte el chip en la máquina de PCR microfluídica en tiempo real y ejecute el script de recopilación de datos. Por último, analice los datos según el protocolo de texto.

Esta figura muestra los niveles de expresión de un gen de mantenimiento medidos por qPCR para determinar qué pocillos recibieron una sola célula. Las muestras que recibieron una célula tienen valores bajos de CT. Las muestras sin célula tienen valores de CT mucho más altos.

Los pocillos para el patrón de amplicón deben mostrar curvas de amplificación espaciadas uniformemente. También debe haber una separación clara en las curvas para los pozos sin celda, 10 celdas y 100 celdas. Las muestras de ADN de semillas que representan células reales se seleccionan cuidadosamente de múltiples placas de 96 pocillos clasificadas y se combinan en una sola placa para prepararse para la qPCR microfluídica.

Este mapa de calor resume los resultados de la qPCR microfluídica. La variación de color en cada columna muestra la variabilidad en la expresión de cada gen entre diferentes células. Lo más probable es que las dos filas que son mucho más oscuras que el resto representen muestras incorrectas.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener su área de trabajo libre de ARNasa y ADN, especialmente cuando se fabrican los estándares y el tampón de lisis. Las partes pre-PCR de este protocolo son sensibles a la contaminación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la expresión de múltiples genes de interés en células individuales.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el FISH de ARN de una sola molécula, para validar las mediciones de la abundancia de ARNm en células individuales.