Name: 3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprende la agregación magnética 3D de células madre mesenquimales y su maduración dinámica en biorreactor para mejorar la condrogénesis in vitro. Este método potencia la regeneración del cartílago mediante estimulación mecánica.

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Los autores desean reconocer QuinXell Tecnologías y CellD, particularmente Lothar Grannemann y Dominique Ghozlan por su ayuda en el biorreactor. Agradecemos a Catherine Le Visage, que nos proporcionó con los andamios de pululano / polisacárido dextrano. Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea (proyecto de ERC-2014-cog Matisse 648 779) y por el AgenceNationalede la Investigación (ANR), Francia (proyecto MagStem ANR-11 SVSE5).

1. Construcción de los dispositivos magnéticos NOTA: Los dispositivos utilizados para la siembra de células varían dependiendo de la aplicación (Figura 1). Para formar agregados, el número de células está limitado a 2,5 × 10 5 / agregado, por lo que las puntas magnéticas deben ser muy delgada (750 micras de diámetro). Para sembrar los andamios de 1,8 cm 2/7 mm de espesor, los imanes deben ser más grande (3 mm de diámetro) y se asegurará de la migración de células a través de los poros de la andamio. <ol><li> Construcción de un dispositivo con micro-imanes para la formación de agregados (Figura 1A) <ol><li> Hacer micro-orificios con una broca de 0,8 mm a través de placas de aluminio (3 cm de diámetro y 6 mm de espesor). </li><li> Inserte una punta magnética (750 m de diámetro) en cada orificio de la placa. </li><li> Coloca este disco en un imán de neodimio permanente, lo que asegura la magnetización a la saturación. </li></ol></li><li> Construcción de un dispositivo para la siembra andamio ( <strong&gt; Figura 1B) <ol><li> Cortar poliestireno duro en 2,4 cm 2 casillas. </li><li> Inserción 9 imanes pequeños (3 mm de diámetro, 6 mm de largo) a la misma distancia sobre un área superficial de 1,6 cm 2. </li><li> Colocar este dispositivo a través de un imán de neodimio permanente. </li></ol></li></ol> Etiquetado Cell 2. Stem NOTA: células madre fueron etiquetados con nanopartículas magnéticas 0,1 mM durante 30 min (2,6 ± 0,2 pg de hierro / célula) para formar agregados, mientras que se marcaron con nanopartículas magnéticas 0,2 mM durante 30 minutos (5 ± 0,4 pg de hierro / célula) a la semilla andamios. Estas concentraciones de nanopartículas y tiempos de incubación se han utilizado anteriormente y publicado para MSC y otras células 18, 19, y se ha determinado que las nanopartículas afectados ni la viabilidad celular ni capacidad de diferenciación MSC. La masa de hierro incorporada por las células madre se midió a través de un solo cell magnetoforesis 19, 20. <ol><li> Células de cultivo humanos madre mesenquimales (MSC) en medio de crecimiento de células madre mesenquimales completa (MSCGM) a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta cerca de la confluencia (~ 90%). </li><li> Preparar la solución de marcaje magnético mediante la mezcla de 0,1 o 0,2 mM maghemita óxido de hierro citrato recubierto (γFe 2 O 3; núcleo: 8 nm de diámetro) en medio 5A de McCoy exento de suero modificado en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sin glutamina y que contiene 5 citrato de sodio mM. </li><li> Desechar el medio, lavar las células con medio RPMI libre de suero sin glutamina, y añadir 10 ml de disolución de nanopartículas de hierro óxido por 150 cm 2 frasco de cultivo, el volumen mínimo requerido para cubrir todas las células. </li><li> Incubar durante 30 min a 37 ° C y CO 2 al 5% y luego desechar la solución de nanopartículas. Enjuague durante 5 min con medio RPMI libre de suero sin glutamina para internalizar el nanoparticles todavía unido a la membrana plasmática. </li><li> Descartar el medio RPMI y añadir 25 ml de medio MSCGM completa por matraz. Incubar durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2. </li></ol> 3. La siembra de células magnéticas <ol><li> Recién preparar el medio condrogénica usando medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) alto contenido de glucosa con L-glutamina mediante la adición de 50? M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1 M de dexametasona, piruvato de sodio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, cultura universal 1% suplemento que contiene insulina, transferrina humana y ácido selenioso (ITS-Premix), y 10 ng / mL factor de crecimiento transformante beta 3 (TGF-β3). </li><li> Desprender las células magnéticas utilizando 8 ml de 0,05% de tripsina-EDTA por 150 cm 2 matraz de cultivo y centrifugar las células disociadas a 260 x g durante 5 min. Aspirar el medio y contar las células resuspendidas. </li><li> Coloque un plato Petri de cultivo celular con fondo de vidrio (35 mm) en la parte superior de ambos dispositivos magnéticos. </li><li> para magnetically formar agregados, añadir 3 ml de medio de condrogénica a la placa de Petri y suavemente depositar el volumen más pequeño posible (no más de 8 l) que contiene 2,5 × 10 5 células marcadas por agregado (hasta 16 agregados puede ser depositado). Deja la placa de Petri durante 20-30 min sin moverlo, permitiendo que se forman esferoides, y luego colocar el dispositivo completo, incluyendo la placa de Petri que contiene los 16 agregados, en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> agregados control de formulario siguiendo el mismo protocolo y reemplazar el medio completo con medio condrogénica sin TGF-β3. <ol><li> Para generar el constructo agregado 3D, coloque 2 agregados en contacto en el día 8 para formar 8 dobletes e iniciar la fusión. En el día 11, combinar 2 dobletes para formar 4 cuatrillizos. Por último, fusionar las 4 cuatrillizos en el día 15 para obtener la estructura final. </li><li> Al mismo tiempo, formar agregados por centrifugación 2,5 × 10 5 células madre marcaron en los 26015; g durante 5 min en 15 mL tubos con 1,5 ml de medio de condrogénica con o sin TGF-β3 (para la muestra y el control, respectivamente). </li></ol></li><li> Para magnéticamente andamios de semillas, colocar cada andamio se secó en una placa de Petri. Utilice polisacáridos andamios porosos hechos de pululano / dextrano 21. Para cada andamio, diluir 2 × 10 6 células madre marcadas en 350 l de medio de condrogénica sin TGF-β3 y cuidadosamente pipetear las células sobre el andamio. <ol><li> Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir la penetración de células completo dentro del andamio y luego agregar suavemente 3 ml de medio de condrogénica con o sin TGF-β3 (para la muestra o control, respectivamente) para la placa de Petri. </li><li> Incubar el andamio cellularized en su dispositivo magnético a 37 ° C y 5% de CO2 durante 4 días para permitir la migración celular a través de los poros de andamio y confinamiento. </li></ol></li><li> Al mismo tiempo, la semilla de andamios con 2 × 10 6 </sup&gt; células madre etiquetados siguiendo el mismo método y se incuba sin el imán para obtener andamios uniformemente cabezas de serie como controles positivos. </li></ol> 4. La diferenciación en condrocitos NOTA: Después de 4 días de incubación, retirar los imanes y continuar la maduración condrogénica ya sea en una placa de Petri (condiciones estáticas) o en un biorreactor (condiciones dinámicas). muestras de control negativas se maduraron en condiciones estáticas con medio condrogénica sin TGF-β3. <ol><li> En condiciones estáticas, mantener a los andamios cellularized o agregados en la misma placa de Petri. Cambiar el medio condrogénica dos veces por semana durante 21 días. </li><li> En condiciones dinámicas, preparar el biorreactor. <ol><li> Cortar tubo de silicona a la longitud apropiada de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Autoclave todos los materiales: 500-ml cámara de cultivo, la tubería, de 2 vías volteadoras, y jaulas. </li><li> Colocar las piezas de biorreactor en un microbio estérilestación de seguridad lógica. Conecte el tubo a las 2 vías rotadores y de la cámara de cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> transferir con cuidado los andamios cellularized en jaulas esterilizadas utilizando una espátula estéril. Coloque 2 andamios por jaula. Cuando las jaulas están listos, insertarlos en las agujas de la tapa para evitar que se muevan durante la rotación adicional. Llenar la cámara de cultivo con medio condrogénica y cerrarla con la tapa que contiene las jaulas. </li></ol></li><li> A su vez en la bomba peristáltica para llenar el tubo con medio condrogénico y para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Coloque y asegure la cámara llena en el motor del biorreactor y encienda el ordenador, que controla las rotaciones tanto del brazo y de la cámara. </li><li> Aplicar una velocidad de rotación de 5 revoluciones por min (rpm) en el brazo y la cámara. Ajuste de la bomba peristáltica a un caudal de 10 rpm para la alimentación continua de los andamios cellularized. </li></ol> NOTA: Antes de la extracción de ARN, a digerir los andamios con una solución enzimática. <ol><li> Preparar 1 ml de solución enzimática mediante la adición de 100 l de pululanasa (40 U / ml) y 50 l de dextranasa (60 mg / ml) a 850 ml de medio DMEM libre de suero. </li><li> Enjuague los andamios dos veces con medio DMEM libre de suero, desechar el medio, y añadir 800 l de la solución enzimática por andamio. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C bajo agitación suave. </li><li> Cuando el andamio está completamente disuelto, la transferencia de la solución que contiene las células a un tubo de 1,5 ml, centrifugar a 300 xg durante 10 min, aspirar cuidadosamente el medio, lavar dos veces con solución salina estéril 1 × tamponada con fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, y volver a suspender las células en la solución de aislamiento de ARN. </li><li> Para extraer el ARN a partir de los agregados, coloque los esferoides en la solución de aislamiento de ARN yaplastarlos completamente utilizando un homogeneizador antes de realizar la extracción de RNA. </li><li> Aislar el RNA utilizando un kit para la extracción de ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Sintetizar ADN complementaria a partir de 400 ng de ARN total usando la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando 250-ng cebadores aleatorios, 1 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), y 40 U / ml de RNasa inhibidor; el volumen final de reacción es de 20 l. Al final de la reacción, añadir 80 l de agua destilada para obtener un volumen final de 100! L. </li><li> Para la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (PCR), utilizar una mezcla de PCR que contiene un reactivo fluorescente para cuantificar la expresión relativa de los genes de interés, tales como agrecano (AGC) y el colágeno II (Col II), con 10 × cDNA diluido. Normalizar los niveles de expresión génica con la proteína ribosómica gen de referencia, Grande, P0 (RPLP0). Realizar los cálculos con el 2 - fórmula ΔΔCT, Donde ΔΔCT =? Ct de la condición diferenciada - significa? Ct de condición de control, y cada uno? Ct representa el CT del gen de interés - la CT del gen de referencia (RPLP0). </li><li> Determinar mediciones estadísticas como los valores medios ± el error estándar de la media (SEM). Efectuar el análisis con n ≥ 2 experimentos independientes. Utilice la prueba t de Student para analizar las diferencias estadísticas entre los gránulos centrifugó y fusiones magnéticos (* p &lt;0,05). Determinar la significación con una prueba de Kruskal-Wallis (ANOVA de una vía no paramétrico) para analizar las diferencias estadísticas entre los andamios diferenciados y con el andamio de control (* p &lt;0,05). </li></ol> 6. Análisis histológico <ol><li> Enjuague los andamios cellularized o agregados con estéril 1 × PBS, fijarlos en solución de formalina al 10% durante 1 h a temperatura ambiente, y enjuague con 1 × PBS. </li><li> Retire el PBS, incrustar las muestras en cuttin óptimag compuesto temperatura (OCT), y congelarlos en un baño de isopentano sumergido en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a -20 ° C. Cortar las muestras con un criostato para obtener criosecciones de 8 micras para los agregados o 12-m para los andamios cellularized. </li><li> Tinción de las secciones criogénicas con solución de azul de toluidina al 0,5% durante 2 minutos, enjuague con agua del grifo, deshidratar con etanol al 100%, aclarar con tolueno, y montar los portaobjetos con un medio de montaje para microscopía de luz. </li></ol>

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<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En primer lugar, porque las técnicas que aquí se presentan se basan en la internalización de nanopartículas magnéticas, una cuestión importante es el resultado de las nanopartículas una vez que se localizan dentro de las células. Es cierto que las nanopartículas de hierro pueden desencadenar toxicidad potencial o alteración de la capacidad de diferenciación en función de su tamaño, de revestimiento, y tiempo de exposición 19, 22. Sin embargo, varios estudios han...

Las nanopartículas magnéticas se utilizan ya en la clínica como agentes de contraste para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y sus aplicaciones terapéuticas mantienen en expansión. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las células marcadas pueden ser manipuladas in vivo utilizando un campo magnético externo y pueden ser dirigidas y / o mantenidas en un sitio definido de implantación 1, 2, 3. En la medicina regenerativa, que pueden ser utilizados para diseñar tejidos organizados in vitro 4, incluyendo el tejido vascular 5, 6, 7, 8 de hueso y cartílago 9. El cartílago articular está inmerso en un entorno avascular, hacer reparaciones de los componentes de la matriz extracelular muy limitados cuando se producen daños. Por esta razón, research se centra actualmente en la ingeniería de sustitutos cartílago hialino que se pueden implantar en el sitio del defecto. Con el fin de producir un reemplazo autólogo, algunos grupos de investigación están explorando el uso de condrocitos autólogos como una fuente de células 10, 11, mientras que otros hacen hincapié en la capacidad de las células madre mesenquimales (MSC) para diferenciarse en condrocitos 12, 13. En estudios anteriores aquí se ha resumido, se seleccionaron MSC, ya que su toma de muestras de médula ósea es bastante sencillo y no requiere el sacrificio de los condrocitos sanos, que corren el riesgo de perder su fenotipo 14. Un primer paso esencial para iniciar la diferenciación condrogénica de las células madre es su condensación. Los agregados celulares se forman comúnmente usando centrifugación o cultivo en micromasa 15; sin embargo, estos métodos de condensación neither presentar el potencial de crear grupos de células dentro de los andamios de espesor ni el potencial de controlar la fusión de agregados. En este trabajo se describe un enfoque innovador para condensar las células madre utilizando MSC marcaje magnético y la atracción magnética. Esta técnica se ha demostrado para formar constructos 3D libre de andamio a través de la fusión de los agregados entre sí para obtener un tejido cartilaginoso a escala milimétrica 9. siembra magnética de andamios gruesas y grandes también ha permitido la posibilidad de aumentar el tamaño de la ingeniería tisular, el diseño de una forma más fácilmente útil para la implantación, y diversificar el potencial para aplicaciones clínicas en la reparación del cartílago. Aquí, nos detalle el protocolo para la siembra magnético de MSC en andamios porosos compuestas de polisacáridos naturales, pululano y dextrano, andamios utilizado anteriormente para confinar las células madre 16, 17. diferenciación condrogénica era finally lleva a cabo en un biorreactor para asegurar continuos de los nutrientes y la difusión de gas en el núcleo de matriz de los andamios sembradas con una alta densidad de células. Además de proporcionar nutrientes, factores de crecimiento condrogénicas, y gas a las células, el biorreactor ofreció la estimulación mecánica. En general, la tecnología magnética se utiliza para confinar las células madre, combinado con la maduración dinámica en un biorreactor, puede mejorar notablemente la diferenciación condrogénica.

<table><tbody><tr><td>Nanopartículas de óxido de hierro (maghemita) (&gamma;-Fe2O3)</td><td>PHENIX - Universidad de París 6</td><td>Hecho y dado por C. M&eacute; nager</td><td>Diámetro medio de 8,1 nm y carga superficial negativa</td></tr><tr><td>Andamios de polisacárido Pululano/Dextrano</td><td>LIOAD - Universidad de Nantes</td><td>Fabricado y dado por C. Le Visage</td><td>Preparado a partir de una mezcla 75:25 de pululano/dextrano en condiciones alcalinas (10&nbsp; M NaOH). Porosidad: 185-205&nbsp; y micro; m; Grosor: 7&nbsp; milímetro; Superficie: 1,8 &nbsp; cm2.</td></tr><tr><td>Sistema de regeneración TisXell</td><td>QuinXell Technologies</td><td>QX900-002</td><td>Biorreactor biaxial con cámara de cultivo de 500 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Jaula para andamios: Histosette II M492&nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Célula madre mesenquimal (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td> Se <td>han utilizado tres lotes independientes</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit medio</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Para el medio completo, agregue el BulletKit provisto (que contiene suero, glutamina y antibióticos) al medio MSCGM</td></tr><tr><td>DMEM con Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Sin piruvato de sodio, sin HEPES</td></tr><tr><td>RPMI medio 1640, sin glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Sin piruvato de sodio, sin HEPES</td></tr><tr><td>PBS sin CaCl2 sin MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10,000&nbsp; U/mL) / Estreptomicina (10,000&nbsp; y micro; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premezcla Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Solución de piruvato de sodio 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Preparar la solución concentrada (25 mM) en agua destilada extemporáneamente</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Prepare la solución madre de 175 mM diluida en agua destilada y almacene a 4 &nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Prepare la solución madre de 1 mM diluida en etanol al 100% y almacene a -20 &nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>TGF-beta 3 proteína 10&nbsp; y micro; g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Prepare el 1&nbsp; M solución madre diluida en agua destilada y almacenar a 4 &nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Pululanasa de Bacillus acidopullulyticus</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dextranasa de Chaetomium erraticum</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Kit de extracción de ARN</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa</td> Life <td>Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Aleatorio Imprimación - Hexamer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 y micro; g/mL: Usar diluido 1/2 y poner 1 &micro; L por muestra</td></tr><tr><td>ARN recombinantes en inhibidor de la ribonucleasa</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&micro; L: poner 1 &micro; L por muestra</td></tr><tr><td>de mezcla de nucleótidos de PCR dNTP (10&nbsp; mM cada uno)</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Paso Uno Plus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina 10% neutro tamponado</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>OCT solución VWR</td><td></td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Absoluto de etanol</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Imprimación para qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Imprimación</td></tr> <tr><td>agrecan para qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen</td></tr> <tr><td>II Primer para qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'</td></tr></tbody></table>

3d agregación magnética stem cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Ingeniería de cartílago sigue siendo un desafío debido a las dificultades en la creación de un implante funcional in vitro similar al tejido nativo. Un enfoque poco explorado para el desarrollo de reemplazos autólogas implica la diferenciación de células madre en condrocitos. Para iniciar este condrogénesis, un grado de compactación de las células madre se requiere; por lo tanto, hemos demostrado la viabilidad de las células magnéticamente de condensación, tanto dentro de los andamios de espesor y libre de andamio, utilizando fuentes de campo magnético miniaturizados como atractores de células. Este enfoque magnético también se utiliza para guiar fusión agregada y para construir libre de andamio, organizado, en tres dimensiones (3D) tejidos de varios milímetros de tamaño. Además de tener un tamaño mejorada, el tejido formado por la fusión magnético impulsado presentó un aumento significativo en la expresión de colágeno II, y se observó una tendencia similar para la expresión de agrecano. A medida que el cartílago nativo fue sometido a fuerzas tsombrero influenciado su estructura en 3D, también se llevó a cabo la maduración dinámica. Un biorreactor que proporciona estímulos mecánicos se utilizó para la cultura de los andamios magnéticamente sembradas durante un período de 21 días. maduración Bioreactor mejoró en gran medida la condrogénesis en los armazones cellularized; la matriz extracelular obtenido bajo estas condiciones era rico en colágeno II y agrecano. Este trabajo describe el potencial innovador de condensación magnética de las células madre etiquetados y maduración dinámica en un biorreactor para mejorar la diferenciación condrogénica, tanto andamios de polisacárido libre de andamio y dentro.

En primer lugar, los agregados se pueden formar individualmente utilizando micro-imanes depositando 2,5 × 10 5 células madre marcadas (Figura 2A). Estos agregados individuales (~ 0,8 mm de tamaño) pueden entonces ser fusionados en estructuras más grandes gracias a la fusión secuencial, inducida magnéticamente. Por ejemplo, en el día 8 de la maduración condrogénica, los agregados se colocaron en contacto en pares para formar dobletes; cuadrúpedos se ensamblaron...

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

El objetivo general de este método de agregación magnética celular y maduración dinámica es mejorar la condrogénesis in vitro de células estromales mesenquimales o MSC. La agregación magnética de células madre en lugar de la condrogénesis como condensación celular es una etapa clave temprana del proceso de regeneración del cartílago. Después de que las células madre se confinan en andamios, los andamios pueden trasladarse a un biorreactor celular para evaluar la maduración dinámica de las células.El método de dinámica importante puede aplicarse a otros biosistemas, como la reparación muscular, cardíaca o vascular. Pero como verá, es muy adecuado para la regeneración del cartílago. La demostración visual del siembra magnética de células y la maduración celular dinámica utilizando el biorreactor real es fundamental, ya que estas dos técnicas son difíciles de aprender únicamente mediante instrucciones escritas.Para construir el dispositivo de micromagnetos para la formación de agregados, primero inserte una punta magnética de 750 micrómetros de diámetro en cada orificio de tres centímetros de profundidad en una placa de aluminio de seis milímetros de espesor y coloque la placa sobre u

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Objetivo de la presentación es mostrar un método altamente reproducible para generar la matriz asociada implantes de células madre en los defectos del cartílago, que puede ser visualizado con RM. Las células madre son etiquetados con aprobación de la FDA Ferumoxides, mezclado con agarosa, se implantan en los defectos del cartílago y la imagen con un escáner de MR 7T.

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

Hemos diseñado un nuevo biorreactor de carga mecánica que se puede aplicar tensión mecánica uniaxial o biaxial a un biocompuesto cartílago antes del trasplante en un defecto de cartílago articular.

Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

En este trabajo, presentamos una técnica para la fabricación rápida de tejidos vasculares vivos mediante el cultivo directo de colágeno, células musculares lisas y células endoteliales. Además, se describe un nuevo protocolo para la caracterización mecánica de tejidos vasculares artificiales.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

La reparación del cartílago representa un desafío médico no resuelto y los enfoques basados en células para diseñar el cartílago articular humano son una solución prometedora. Aquí, describimos los hidrogeles biomiméticos tridimensionales (3D) como una herramienta ideal para la expansión y maduración de los condrocitos articulares humanos.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

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Un sistema de biorreactor de estimulación mecánica uniaxial tridimensional es un biorreactor ideal para la diferenciación tenogénica específica de las células madre derivadas del tendón y la formación de neo tendones.

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Este estudio describe un método para producir esferoides condrocíticos mediante la agregación de células en esferoides en condiciones de baja adherencia utilizando la gravedad, seguido de un cultivo de los esferoides resultantes en mini-biorreactores.

Generación de esferoides a partir de varios condrocitos utilizando condiciones de baja adherencia por gravedad y mini-biorreactores caseros

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de...

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Aprende la agregación magnética 3D de células madre mesenquimales y su maduración dinámica en biorreactor para mejorar la condrogénesis in vitro. Este método potencia la regeneración del cartílago mediante estimulación mecánica.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

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