3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

El objetivo general de este método de agregación de células magnéticas y maduración dinámica es mejorar la condrogénesis in vitro de las células estromales mesenquimales o MSC. La agregación magnética de células madre en lugar de condrogénesis como condensación celular es un paso clave temprano del proceso de regeneración del cartílago. Después de que las células madre se confinan en andamios, los andamios se pueden mover al biorreactor celular para evaluar la maduración dinámica de las células.

Un importante método de dinámica se puede aplicar a otros biosistemas, como la reparación muscular, cardíaca o vascular. Pero como verás, es muy adecuado para que el cartílago se regenere. La demostración visual de la siembra de células magnéticas y la maduración dinámica de células utilizando el biorreactor real son críticas porque estas dos técnicas son difíciles de aprender solo con instrucciones de texto.

Para construir el dispositivo de microimán para la formación de agregados, primero inserte una punta magnética de 750 micrómetros de diámetro en cada orificio de tres centímetros en una placa de aluminio de seis milímetros de espesor y coloque la placa sobre un imán de neodimio permanente. Para construir un dispositivo para la siembra de andamios, primero corte el poliestireno duro en cuadrados de 2,4 centímetros cuadrados e inserte imanes de tres milímetros de diámetro y seis milímetros de largo a la misma distancia sobre una superficie de 1,6 centímetros cuadrados. A continuación, coloque el dispositivo sobre un imán permanente de neodimio.

Para etiquetar las MSC humanas, primero cultive las células madre en un medio de crecimiento completo de MSC a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono hasta que estén 90% confluentes. Aspire y luego enjuague las células con suero de tres RPMI sin glutamina, y agregue 10 mililitros de solución de nanopartículas de óxido de hierro por matraz de cultivo de 150 centímetros cuadrados para una incubación de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, enjuague las células durante cinco minutos con medio Serum three RPMI sin glutamina para internalizar las nanopartículas aún adheridas a la membrana plasmática.

A continuación, sustituya el RPMI de cada matraz por 25 mililitros de medio de crecimiento MSC completo y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante la noche. A la mañana siguiente, separe las celdas magnéticas con ocho mililitros de 05% de tripsina-EDTA por matraz. Y recoger las células disociadas por centrifugación.

Colocamos los gránulos para contar y colocamos una placa de Petri de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio en la parte superior de cada dispositivo magnético. Para formar magnéticamente los agregados, agregue tres mililitros de medio condrogénico a cada placa de Petri y deposite suavemente no más de ocho microlitros de 2,5 veces 10 a la quinta celda marcada por agregado. Es fundamental que las células no se depositen ni demasiado lento ni demasiado rápido.

Y ni demasiado cerca ni demasiado lejos del magnetismo. Cuando se hayan colocado todos los agregados, permita que se formen esferoides durante 20-30 minutos sin perturbaciones. A continuación, transfiera los agregados a la incubadora de cultivos celulares.

El mismo día, forme agregados centrifugando 2,5 veces 10 a la quinta células madre marcadas en tubos cónicos de 15 mililitros con 1,5 mililitros de medio condrogénico. Para sembrar magnéticamente los andamios, coloque un andamio poroso de pululano / polisacárido de dextrano seco por placa de Petri y diluya 2 veces 10 hasta la 6ª celda marcada en 350 microlitros de medio condrogénico sin TGFbeta3. Pipetea cuidadosamente las células en los andamios e incuba las estructuras a 37 grados centígrados para permitir la penetración completa de las células.

Después de cinco minutos, agregue suavemente tres mililitros de medio condrogénico a la placa de Petri y devuelva los andamios a la incubadora de cultivo celular durante cuatro días para permitir que las células migren a través de los poros del andamio. El mismo día, también siembre otro conjunto de andamios con 2 veces 10 a la 6ª células madre marcadas como se demostró e incube las células sin el imán para obtener andamios sembrados uniformemente como controles positivos. Para la condrogénesis en andamios el día cinco, retire el dispositivo magnético de todos los andamios y devuelva los andamios estáticos a la incubadora de cultivos celulares hasta el día 25, cambiando el medio dos veces por semana.

Para el cultivo celular dinámico, también en el quinto día corte el tubo de silicona a la longitud adecuada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y marque el tubo, la cámara de cultivo de 500 mililitros, los rotadores de dos vías y las jaulas en una estación de seguridad microbiológica estéril. Siguiendo las instrucciones del fabricante, conecte el tubo a los rotadores de dos vías en la cámara de cultivo. Luego use una espátula estéril para transferir con cuidado dos andamios celulares a cada jaula.

Cuando se hayan transferido todos los andamios, inserte las jaulas a través de las agujas en la tapa para evitar que se muevan durante la rotación. Y llene la cámara de cultivo con medio condrogénico. Utilice una técnica antiséptica estéril en la preparación de las cámaras para evitar la contaminación de cualquiera de las herramientas o andamios.

A continuación, inserte las jaulas en la cámara y luego cierre la cámara y encienda la bomba peristáltica para llenar la tubería con medio condrogénico y eliminar las burbujas de aire. Coloque y asegure la cámara llena dentro del motor del biorreactor y encienda la computadora que controla las rotaciones del brazo y la cámara. A continuación, aplique una velocidad de rotación de cinco rotaciones por minuto tanto en el brazo como en la cámara, y ajuste la bomba peristáltica a un caudal de 10 rotaciones por minuto para la alimentación continua de los andamios celulares.

Para generar una construcción de agregados 3D libre de andamios en el octavo día, inicie la fusión colocando dos agregados en contacto en medio condrogénico para ocho dublets. Luego, en el día 11, fusiona dos dublets para formar cuatro cuatrillizos, y forma la estructura final en el día 15 fusionando los cuatro cuatrillizos. Los tejidos formados por fusión magnética demuestran un aumento significativo en la expresión de colágeno II en comparación con los pellets obtenidos por centrifugación.

Con una tendencia creciente de expresión agregante. En el caso de los andamios estáticos celulares, se observa un aumento de las expresiones de agregante y colágeno II cuando se utiliza la siembra magnética, en comparación con el andamio sembrado sin fuerzas magnéticas. Curiosamente, la expresión de colágeno II es mucho mayor cuando se combina la siembra magnética con la diferenciación dinámica.

El análisis histológico con azul de toluidina revela que la fusión magnética secuencial de 16 agregados exhibe una abundante deposición de glicanos de glucosamina. Además, en los andamios sembrados magnéticamente, el contenido de glicanos de glucosamina es mayor cuando los andamios se diferencian en un biorreactor que cuando se cultivan estáticamente. Una vez dominada, la agregación de células magnéticas puede completarse en dos horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar resuspender las células marcadas en un volumen lo más pequeño posible para facilitar la formación de agregados. Después de la siembra magnética de los andamios, se puede realizar la maduración dinámica utilizando el propio biorreactor para mejorar la expresión de nuevos condrocitos sintetizados. Desde su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina regenerativa exploraran la regeneración del cartílago articular en humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir dispositivos magnéticos, etiquetar células madre para formar agregados de células madre, sembrar andamios magnéticamente y usar un biorreactor real. No olvide que trabajar con células y tejidos humanos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, batas de laboratorio y gafas protectoras.