Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta
3 de abril de 2017
Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.
El objetivo general de este protocolo es aislar células estromales mesenquimales de cuatro fuentes distintas de tejido perinatal: el revestimiento del cordón umbilical, la gelatina de Wharton, la unión cordón-placenta y la placenta fetal. Este método puede ayudar a avanzar en el campo de la biología de las células madre, la medicina alternativa mediante la obtención de células madre mesenquimales de calidad especial, de forma no invasiva. La principal ventaja de esta técnica es que produce productivamente un gran número de poblaciones de células homogéneas de alta calidad a partir de distintas fuentes de tejido perinatal.
Las células estromales mesenquimales multipotentes del cordón derivadas de esta técnica se pueden utilizar para tratar diversas enfermedades y trastornos, ya que son más primitivas que las células madre mesenquimales aisladas de tejidos adultos. Este método puede proporcionar información sobre las características de las células estromales mesenquimales de diferentes segmentos y nichos específicos del cordón y la placenta. Comience colocando la muestra en una placa de Petri de 150 milímetros sobre hielo en un gabinete de bioseguridad y use una aguja y una jeringa para enjuagar el tejido varias veces con PBS helado.
Cuando se hayan eliminado todos los coágulos de sangre, examine cuidadosamente la muestra para identificar las diferentes regiones anatómicas. Luego, use fórceps para agarrar el extremo fetal del cordón umbilical y use tijeras para hacer cuidadosamente una incisión en la parte superior de la unión entre el cordón y la placenta. Haga una segunda incisión debajo de la unión para separar la unión del cordón y la placenta de la placenta.
Y divida los tejidos separados en placas de Petri individuales. A continuación, corte el cordón umbilical longitudinalmente para exponer completamente los vasos sanguíneos y la gelatina de Wharton circundante sin alterar el epitelio. Utilice un bisturí para raspar la gelatina de Wharton de los vasos sanguíneos y el interepitelio del subamnios.
A continuación, extraiga los vasos sanguíneos, transfiriendo los restos de gelatina perivascular por debajo y alrededor de los vasos sanguíneos a la placa de gelatina de Wharton y coloque el tejido restante del revestimiento del cordón en su propia placa. Cuando se hayan diseccionado todos los tejidos, reemplace el PBS en cada plato con tres a cinco mililitros de tripsina y use tijeras para cortar cada muestra de tejido en trozos de uno a dos milímetros para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Utilice un microscopio de contraste de fase para observar la digestión parcial visualizando la liberación de células del tejido.
Al final del período de digestión parcial, neutralice la tripsina con un volumen igual de medio de cultivo y transfiera las muestras a tubos cónicos individuales de 50 mililitros. Deje que los trozos de tejido se asienten durante tres minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y coloque de 15 a 20 trozos de tejido parcialmente digeridos por muestra en matraces individuales de cultivo de tejido de 75 centímetros cuadrados.
A continuación, agregue nueve mililitros de medio de cultivo para una incubación de dos a tres días a 37 grados centígrados. Cambie el medio de cultivo después de tres días y examine las plantas X mediante microscopía de contraste de fase para detectar el crecimiento celular. Cuando el crecimiento celular alcance el 70 por ciento de confluencia, disocie las células en uno o dos mililitros de solución de tripsina por matraz, gire el matraz para obtener un recubrimiento uniforme con la solución enzimática e incube los cultivos durante tres minutos a 37 grados Celsius.
Luego neutralice la reacción con uno o dos mililitros de medio de cultivo. Recoja las células por centrifugación, resuspendiendo el pellet en el medio de cultivo para el subcultivo a una densidad de siembra de una vez diez a la cuarta célula por centímetro cuadrado. Las células del revestimiento del cordón y de los cultivos de gelatina de Wharton exhiben valores de eficiencia de formación de colonias de 59 y 80 colonias, respectivamente.
Sin embargo, el valor de la eficiencia de formación de colonias de las células de la unión cordón-placenta es similar al observado para las células madre mesenquimales de la médula ósea, lo que sugiere que las células derivadas de la unión cordón-placenta tienen una mayor capacidad proliferativa y de autorrenovación. Un análisis métrico de las suspensiones unicelulares aisladas de estos tejidos perinatales indica que los porcentajes de células positivas para marcadores específicos de células madre mesenquimales de las cuatro fuentes de tejido son similares a los expresados por las células mesenquimales derivadas de la médula ósea estándar. Sin embargo, las proporciones medias de intensidad de fluorescencia indican que las células derivadas de la gelatina y de la unión cordón-placenta de Wharton son muy similares o superiores al revestimiento del cordón en las células derivadas de la placenta fetal.
Curiosamente, a pesar de sus diferentes valores de eficiencia en la formación de colonias, todas las células de las diferentes fuentes perinatales expresan niveles similares de marcadores de pluripotencia mediante análisis cuantitativo de RTPCR, excepto las células estromales mesenquimales derivadas de la unión cordón-placenta, que expresaron los niveles más altos de expresión para todos los marcadores de pluripotencia probados. Además, las células estromales mesenquimales aisladas de todas las fuentes perinatales se diferencian fácilmente en tipos de células adipogénicas, condrogénicas y osteogénicas, así como una diferenciación trilinaje demostrada. Aunque el potencial de diferenciación varía según la fuente de células estromales mesenquimales.
Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos o tres horas si se realiza de manera eficiente. Al intentar este procedimiento, es importante practicar la técnica lateral y evitar la contaminación cruzada entre las fuentes de tejido. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la naturaleza de los nichos de células madre en los tejidos perinatales.
Descripción general
Este protocolo describe la disección del cordón umbilical humano y de la placenta fetal para aislar células mesenquimales estromales (CMSE) mediante la técnica de cultivo por explante. El método permite la caracterización de CMSE procedentes de distintas fuentes de tejidos perinatales, contribuyendo así a los avances en la biología de células madre.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Medicina Regenerativa
- Técnicas de Cultivo Celular
Antecedentes
- Las células estromales mesenquimales (MSCs) tienen potencial terapéutico debido a su pluripotencialidad.
- Los tejidos perinatales son fuentes ricas en MSCs primitivas.
- Este protocolo tiene como objetivo mejorar el rendimiento de MSCs de alta calidad a partir de cordón umbilical y placenta.
- Comprender las características de las MSCs provenientes de diferentes fuentes tisulares puede orientar sus aplicaciones clínicas.
Objetivo del estudio
- Aislar CMM del revestimiento del cordón umbilical, la gelatina de Wharton, la unión cordón-placenta y la placenta fetal.
- Evaluar la calidad y características de las CMM derivadas de estos tejidos.
- Proporcionar un método no invasivo para obtener CMM para uso en investigación y terapéutico.
Métodos Utilizados
- Diseción del cordón umbilical y la placenta en regiones anatómicas distintas.
- Uso de tripsina para la digestión parcial de muestras de tejido.
- Cultivo de tejidos disecados en condiciones específicas de medio.
- Evaluación del crecimiento celular y caracterización mediante microscopía y citometría de flujo.
Resultados principales
- Se observó una alta eficiencia de formación de colonias en las células de la gelatina de Wharton y de la unión cordón-placenta.
- Todas las CMM expresaron marcadores de pluripotencia similares, con variaciones en los niveles de expresión.
- Las CMM demostraron la capacidad de diferenciarse en múltiples líneas celulares.
- La técnica puede completarse eficientemente en dos a tres horas.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método confiable para aislar MSC de alta calidad a partir de tejidos perinatales.
- Comprender las propiedades de las MSC procedentes de diferentes orígenes puede mejorar sus aplicaciones terapéuticas.
- Se recomienda una mayor exploración de los nichos de células madre en los tejidos perinatales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el aislamiento de células estromales mesenquimales (MSCs) a partir de distintas fuentes de tejidos perinatales, ofreciendo una alternativa no invasiva y éticamente favorable frente a las MSCs derivadas de médula ósea. Al comparar regiones anatómicas como la unión cordón-placenta (CPJ), la gelatina de Wharton (WJ), el revestimiento del cordón (CL) y la placenta fetal (FP), el método apoya la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las líneas de investigación de medicina regenerativa. La mayor eficiencia de formación de colonias y la expresión de marcadores de pluripotencialidad observadas en las MSCs derivadas de CPJ proporcionan una confianza predictiva para aplicaciones en terapia celular, facilitando la identificación de candidatos prometedores y la selección de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de células madre mesenquimales (MSC) de nichos perinatales discretos con distintas capacidades de proliferación y autorrenovación.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la validación funcional de la multipotencialidad en líneas adipogénica, condrogénica y osteogénica.
- Valor científico: Mejora la confianza en el blanco al identificar la CPJ como una fuente potente de MSC con mayor eficiencia de formación de colonias y expresión de marcadores de pluripotencialidad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor operativo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores al obtener poblaciones homogéneas de CMM adherentes con perfiles definidos de marcadores de superficie (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105).
- Valor científico: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante técnicas consistentes de cultivo por explante y resultados cuantitativos como la eficiencia de formación de colonias y métricas de citometría de flujo.
- Valor operativo: Destaca la preparación para cribado y la escalabilidad, con un protocolo completado en dos o tres horas, lo que permite una evaluación confiable de compuestos en cascadas de cribado preclínicas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad y la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la demostración de la capacidad de diferenciación trilinaje, un indicador funcional clave para la validación preclínica.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar MSC que mantienen una morfología adherente y fibroblastoide, así como expresión de marcadores superficiales comparables a los de MSC derivadas de médula ósea.
- Valor científico: Se centra en el valor predictivo de reducción de riesgos al mostrar que las MSC derivadas de CPJ se diferencian con mayor eficiencia que otras fuentes, lo que respalda decisiones de avance ajustadas al riesgo.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento desde el Descubrimiento Inicial hasta la Identificación de Compuestos Prometedores y el trabajo Preclínico, apoyando la comprobación de hipótesis, la clarificación de vías y la reducción de riesgos biológicos mediante el aislamiento de MSC resueltos anatómicamente.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la comparación de las propiedades de las CMM procedentes del revestimiento del cordón umbilical, la gelatina de Wharton, la unión cordón-placenta y la placenta fetal.
- Selección: Describe la preparación del ensayo, su reproducibilidad y sus resultados cuantitativos, como la eficiencia de formación de colonias (59 para CL, 80 para WJ, similar a la médula ósea para CPJ) y el análisis de expresión de marcadores mediante citometría de flujo.
- Análisis: Destaca mediciones como la eficiencia de formación de colonias, las relaciones de intensidad de fluorescencia y la RT-PCR cuantitativa para marcadores de pluripotencia que ayudan a los equipos a comparar condiciones y evaluar su valor predictivo.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al demostrar la diferenciación de las CMM en linajes adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos, lo que respalda la alineación de biomarcadores y la validación funcional.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable y no como una técnica de un solo uso, lo que permite la estandarización entre fuentes de tejidos perinatales para garantizar un suministro constante de CMM en programas de medicina regenerativa.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista mediante el aislamiento anatómicamente resuelto de CMM y su caracterización funcional.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad mediante cultivo por explante, parámetros definidos de digestión y densidad de siembra constante (1×10⁴ células/cm²).
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías al identificar tempranamente fuentes de CMM de alta potencia, como la CPJ, durante el descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en la proliferación diferencial, el autoabastecimiento y la eficiencia de diferenciación entre fuentes de CMM perinatales.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos obligatorios en disección de tejidos, cultivo celular estéril y citometría de flujo para el análisis de marcadores.
- Los requisitos de instrumentación e infraestructura analítica incluyen microscopía de contraste de fase, centrífugas, incubadoras (37°C, 5% CO₂) y citómetros de flujo para la evaluación de marcadores CD y la intensidad de fluorescencia.
- Los requisitos de estandarización entre equipos implican protocolos consistentes de disección de tejidos, neutralización de tripsina y densidades de siembra para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios.
- Las consideraciones para la adaptación en distintos sistemas modelo incluyen el ajuste del tamaño del explante y del tiempo de digestión según la fuente del tejido, ya que el tiempo de crecimiento varía (3–4 días para CPJ, 7–10 días para CL/WJ, 11–14 días para FP).
- Las limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía incluyen la necesidad de evitar la contaminación cruzada entre fuentes de tejido durante la disección y la variabilidad en la eficiencia de formación de colonias y en el tiempo de crecimiento entre regiones anatómicas.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
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Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
