Name: Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprende a aislar células mesenquimales del estroma de cordón umbilical y placenta fetal mediante cultivo de explantes. Este método no invasivo produce poblaciones celulares homogéneas de alta calidad para aplicaciones en medicina regenerativa.

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El estudio fue apoyado por la OU-WB ISCRM, Oakland University y Michigan cabeza y Spine Institute. N. Beeravolu y C. McKee recibieron el Premio de Investigación de Graduados Provost de la Universidad de Oakland. Apreciamos S. Bakshi por la revisión del manuscrito.

Las muestras (n = 3) se obtuvieron del consentimiento, donantes sanos a través del Beaumont Hospital de BioBanco, Royal Oak, MI y el Hospital Providence, Southfield, MI bajo HIC- (HIC # 2012-101) y IRB- (IRB # 820662- 3), respectivamente, aprobaron protocolos y procesadas según lo aprobado por el IBC (# 2858) de la Universidad de Oakland, Rochester, MI. Cord 1. Procesamiento umbilical humana, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta y células de aislamiento <ol><li> Asépticamente recoger muestras de UC aproximadamente 10 cm de longitud, incluyendo 5 - 6 cm conectados a la CPJ y 3 - 4 cm de FP. Colocar inmediatamente cada muestra en un medio de recipiente de recogida que contiene (DMEM con 4.500 mg / ml de glucosa y solución de antibióticos (0,1% de gentamicina, 0,2% de estreptomicina, y 0,12% de penicilina)) y se almacena a 4 ° C hasta que se transporta al laboratorio por colocándola en hielo en una caja de espuma de poliestireno. Procesar la muestra a 4 ° C dentro de 2 - 4 h de la recogida. </li><li> Colocar la muestra en una placa de Petri de 150 mm siguióhielo en una cabina de bioseguridad. Usando una aguja y una jeringa, enjuagar varias veces con PBS enfriado en hielo para eliminar coágulos de sangre. Asegúrese de que la muestra se mantiene húmeda con PBS durante el proceso y no deje que se seque. Para mantener la esterilidad, manejar la asépticamente muestra usando herramientas de PBS y se quirúrgicos tratados en autoclave largo de procesamiento de la muestra. </li><li> examinar cuidadosamente la muestra para identificar las diferentes regiones anatómicas: UC, el CPJ, y FP. En primer lugar diseccionar la UC. Mantenga el extremo fetal de la UC con pinzas y con cuidado hacer el primer corte justo en la parte superior del CPJ, con un par de tijeras. Hacer que el segundo corte por debajo de la CPJ para separar el CPJ (1,5 - 2,0 cm) de la FP. Coloque la UC separado, CPJ, y FP en placas de Petri separadas para su posterior procesamiento. </li><li> Cortar la UC longitudinalmente con la ayuda de tijeras y fórceps, exponiendo completamente los vasos sanguíneos y que rodea WJ sin perturbar el epitelio. </li><li> Raspe la WJ lejos de los vasos sanguíneos y el epitelio interior del subamnionusando un escalpelo, y luego eliminar los vasos sanguíneos. Asegúrese de recoger cualquier WJ perivascular que queda debajo y alrededor de los vasos sanguíneos, y colocar el WJ recogido en una placa de Petri separada. </li><li> Recoger el tejido restante, forro de cable (CL), en una placa de Petri independiente. </li><li> Después de la separación de los tejidos que representan CL, WJ, CPJ, y FP, reemplace el PBS con 3 - 5 ml de solución de tripsina comercial y cortar por separado cada uno de los tejidos en de 1 a trozos de 2 mm con tijeras. </li><li> Incubar las piezas de tejido en solución de tripsina comercial a 37 ° C durante 30 min en un incubador de CO2 al 5% para la digestión parcial de las muestras. Observe la digestión parcial mediante la visualización de liberación de células utilizando un microscopio de contraste de fase. </li><li> Para las muestras digeridas parcialmente, añadir un volumen igual de medio de cultivo (CM; DMEM con 4.500 mg / ml de glucosa y 2 mM L-glutamina, suplementado con 10% de suero humano / FBS y solución de antibióticos (0,1% de gentamicina, 0,2% de estreptomicina , y 0,12% penicillin)) para neutralizar la solución de tripsina comercial. Transferir el contenido en tubos de centrífuga de 50 ml y dejar que las piezas de tejido parcialmente digeridos se conforman con 3 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, incluyendo las células individuales (que no se expanden de manera eficiente), y la placa 15 - 20 trozos de tejido parcialmente digeridos en un 75-cm matraz de cultivo de 2 tejido y añadir 9 ml de CM. Incubar a 37 ° C y no molestar a los matraces de cultivo durante 2 - 3 días para permitir la adherencia de las piezas de tejido. NOTA: La parte restante de las muestras de tejido parcialmente digeridos puede ser criopreservados para el futuro aislamiento de células. </li><li> Después de 3 días de incubación, cambiar el CM y buscar la aparición de derivación de células del explante sobre una base diaria; crecimiento celular debe ser evidente a partir de los explantes adherentes después de 3 - 4 días, 7 - 10 días, y 11 - 14 días de incubación para CPJ, CL / WJ, y FP, respectivamente. Desde este punto en adelante, cambiar el CM después de cada 3 días o comonecesario. NOTA: El crecimiento celular alcanza el 70% de confluencia 7 - 10 días después de la excrecencia celular inicial a partir del explante. Tenga en cuenta que las piezas de tejido no adherentes no dar lugar a ninguna excrecencia celular hasta que se adhieren al plástico. Se debe tener cuidado para que el frasco no se altera con el fin de evitar el desprendimiento de las piezas de tejido adherentes. Si hay algún piezas flotantes después de los 3 primeros días de cultivo, podrían ser rescatados por su transferencia a un nuevo matraz para fijación. NOTA: Cuando el crecimiento celular a partir de los explantes de tejido alcanza el 70% de confluencia, deben ser subcultivadas. Como se indicó anteriormente, las MSC de CL / WJ, FP, CPJ y alcanzarán confluencia en 10 - 14 días, 14 - 20 días, y 17 - 24 días, respectivamente. </li><li> Para subcultivar células superado de los explantes, disociar las células mediante el uso de 1 - 2 ml de solución de tripsina comercial / 75-cm 2 matraz de cultivo y se incuba a 37 ° C durante 3 min. Neutralizar con 1 - 2 ml de CM y centrifugar 1500 xg durante 3 min. HacerAsegúrese de girar el frasco mientras que la adición de tripsina durante un reparto homogéneo en todas partes. </li><li> NOTA: Las células sedimentadas se consideran paso 0 (P0) y se suspendieron en CM, se contaron, y se subcultivaron a una densidad de siembra de 1 x 10 4 / cm 2 para la amplificación, la caracterización y la crioconservación. Las células exceso puede ser criopreservado en P0. </li></ol> 2. Caracterización de las células aisladas <ol><li> La eficiencia de formación de colonias (CFE) de ensayo <ol><li> Escudo los platos de 100 mm de Petri (superficie de 60 cm 2) con 0,1% de gelatina durante 30 min y colocarlos en el incubador de CO2 a 37 ° C. NOTA: Aunque no es necesario, gelatina de recubrimiento mejora la adherencia celular. </li><li> Eliminar el exceso de gelatina y sembrar la placa revestida con células P0 a una concentración de 1,63 células / cm2. Añadir 3 ml de CM e incubar en el incubador de CO2 a 37 ° C. </li><li> Supervisar las placas sembradas para crecimiento clonalpor microscopía de luz (ML) y cambiar el medio cada 3 días. </li><li> Después de 10 - 14 días de crecimiento de las células, se lavan las placas de Petri dos veces con PBS y fijar las células en 4% de paraformaldehído durante 30 min a temperatura ambiente. NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. </li><li> Tinción de las células fijadas con 0,1% de cristal violeta durante 1 h a temperatura ambiente y enjuagar la placa con agua del grifo hasta que la mancha azul no unido se ha ido. </li><li> Contar el número de colonias que constan de al menos 50 células usando LM. </li></ol></li><li> La expresión de marcadores de superficie celular <ol><li> Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min. Suspender las células en tampón FACS (1x PBS con FBS al 2% y azida sódica al 0,1%). NOTA: La azida sódica es tóxica. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. </li><li&gt; Teñir las células (~ 10 6) con FITC o marcados con APC anticuerpos-MSC específica (anticuerpos conjugados con FITC contra: CD44 y CD90 o anticuerpos APC conjugadas contra: CD29, CD73, y CD105) en tampón FACS para 30 min a 4 ° C en la oscuridad. </li><li> Centrifugar las células teñidas a 670 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 500 l de tampón FACS. </li><li> Analizar las células con anticuerpos teñidas utilizando FACS de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li></ol></li></ol> Potencial 3. Diferenciación <ol><li> diferenciación adipogénica <ol><li> Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min. </li><li> En un incubador de CO2 a 37 ° C, cultivar las células a una concentración de 100.000 células / pocillo de una placa de 6 pocillos que contiene 2 ml de CM. </li><li> Después de 24 h, sustituir la CM con adipogmedio de diferenciación enic (0,5 M isobutil-metilxantina, 1 dexametasona? M, 10? M de insulina, y 200? M de indometacina) e incubar. Cambiar el medio de diferenciación cada 3 días o tan a menudo como sea necesario. </li><li> Después de 3 semanas de incubación, fijar las células con 2 ml de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente y mancha con Oil Red O para detectar la producción de gotitas de lípidos con el fin de analizar para la diferenciación adipogénica. NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. </li><li> Tratar las células fijadas con 60% de isopropanol (2 ml / pocillo de placa de 6 pocillos) durante 5 min. </li><li> Sustituir el isopropanol con 2 ml de Oil Red O mancha (filtro 3 partes Oil Red O mancha y 2 partes de agua destilada), se incuba durante 15-30 min a temperatura ambiente, y lavar 3 - 4 veces con agua del grifo para eliminar cualquier mancha no unido . </li><li> Visualizar las gotas de lípidos rojos manchados, indicativo de linaje celular adipogénica, ucantar LM. </li></ol></li><li> diferenciación condrogénica <ol><li> aislado Cultura células a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y se lavan con PBS. </li><li> Para sedimentar las células para la inducción condrogénica, centrifugar a 250.000 células en un tubo de centrífuga de 15 ml con 2 ml de CM a 11.000 xg durante 8 min. Incubar los gránulos durante la noche a 37 ° C. </li><li> Después de 24 h, reemplazar suavemente el CM con medio condrogénica diferenciación (20 ng TGFß1, 10 insulina ng, 100 nM de dexametasona, y 100? M de ácido ascórbico) sin alterar el sedimento y continuar la incubación. Cambiar el medio de diferenciación cada 3 días o tan a menudo como sea necesario. </li><li> Después de 3 semanas de incubación, fijar las células con 2 ml de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente. Cryosection y mancha con 1% de azul de toluidina para examinar la presencia o producción de matriz extracelular con el fin de determinar la diferenciación condrogénica. NOTA: Paraformaldehyde es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. </li><li> Para cryosectioning, lavar suavemente los sedimentos celulares cosechados dos veces con PBS y fijar con 1 ml de paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente. NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. </li><li> Lavar los pellets dos veces con PBS para eliminar el paraformaldehído y transferir en una solución / PTU sacarosa (1: 2, 20% de sacarosa: OCT). Incubar a temperatura ambiente durante 24 h para permitir que la solución se filtre por completo en los sedimentos celulares; esto permitirá seccionamiento suave. </li><li> La transferencia de las pastillas en los moldes de OCT. Congelar los moldes a -20 ° C durante 4 - 6 h y cryosection aproximadamente 10 - 12 secciones de micras de espesor de los sedimentos celulares usando un criostato para toluidina tinción azul. </li><li> Lavar las criosecciones suavemente con PBS; añadir algunas gotas de 1% azul de toluidina, que cubren las secciones de pellets en la diapositiva completamente; y aumUbaté durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS varias veces para destain. Eliminar el exceso de tinción por inmersión de la diapositiva en solución de alcohol a base de HCl (95% de alcohol + 0,5 ml de HCl) varias veces hasta que el color azul no unido se ha ido. Montar las secciones teñidas utilizando 100 l de solución para la conservación a largo plazo de las diapositivas de montaje. NOTA: La tinción con azul de las secciones indica la presencia de glicosaminoglicanos y glicoproteínas y será observable utilizando LM. </li></ol></li><li> La diferenciación osteogénica <ol><li> Una vez más, cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, y lavar y sedimento por centrifugación a 1500 xg durante 3 min. </li><li> Subcultivo las células a una concentración de 100.000 células / pocillo de placas de 6 pocillos que contiene 2 ml de CM en un incubador de CO2 a 37 ° C. </li><li> Después de 24 h, reemplace el CM con medio de diferenciación osteogénica (0,1 μ; M dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, y 50 mM de fosfato de ascorbato) y continuar la incubación. Cambiar el medio de diferenciación cada 3 días o tan a menudo como sea necesario. </li><li> Después de 3 semanas de incubación, fijar las células con 2 ml de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente y mancha con rojo de alizarina para detectar la presencia de un depósito de calcio con el fin de determinar la diferenciación osteogénica. NOTA: El paraformaldehido es tóxico. Por favor practicar la cautela con el uso de guantes y gafas durante el uso. </li><li> Lavar suavemente las células fijadas dos veces con agua destilada y se trata con 2% mancha roja de alizarina (2 ml / pocillo en una placa de 6 pocillos) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Retire el exceso de colorante lavando suavemente con agua del grifo para que los depósitos de calcio no desplazan. </li><li> Visualizar los depósitos de calcio teñidas de rojo utilizando LM. </li></ol></li></ol> 4. cuantitativa Polimerasa de Transcriptasa Inversa ChaEn la reacción (qRT-PCR) Análisis <ol><li> Cultivar las células aisladas a 70% de confluencia, se disocian con la solución de tripsina comercial, lavado, y pellet por centrifugación a 1500 xg durante 3 min para aislar el ARN celular total. </li><li> Lavar las células con PBS para eliminar las trazas de FBS, y luego proceder al aislamiento de ARN usando un kit de purificación de ARN comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Se purifica el ARN total aislado por tratamiento con DNasa a 37 ° C durante 30 min usando un termociclador. Sintetizar ADNc utilizando el kit comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar reacciones de 10 l de PCR por triplicado en una placa de 96 pocillos, conteniendo cada reacción 5 l de SYBR Green Supermix-PCR; 3 l de agua bidestilada; 0,5! L de cada cebador, directo e inverso; y 1 l de la cDNA diluido (1:10). </li><li> Realizar PCR bajo los siguientes parámetros: 10 min a 98 ° C, seguido por 44 ciclos de 30 s cada uno a 98 y# 176; C, 20 s a 60 ° C, y 30 s a 72 ° C. </li><li> Normalizar la amplificación de los genes diana a los genes de referencia, GAPDH y β-actina; las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1. </li></ol> 5. Análisis estadístico <ol><li> Realizar todos los análisis utilizando el software estadístico. Presentar los datos como la media ± SEM. Los resultados con un valor de p (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05) se consideraron estadísticamente significativos. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Los recientes avances en la investigación de células madre no sólo mejoró la comprensión de los procesos de desarrollo básicas, pero también proporcionan oportunidades prometedoras para el uso de células madre en biotecnológica, farmacéutica, la terapia celular, medicina regenerativa, y las aplicaciones de ingeniería de tejidos 18, 19, 20. Mientras que los CES pluripotentes aisladas de embriones tempranos son los más prometedores, se enfrentan a desafíos técnicos y dilemas éticos 21, 22, 23. Las células inducidas pluripotentes madre (iPSCs) derivadas de células adultas proporcionan una alternativa, pero ellos también se enfrentan a problemas técnicos y de seguridad similar 23. Además, iPSCs puede no ser genéticamente estable o puede tener cambios genéticos sido sometidos, limitando así su uso terapéutico. Las células madre también se han reportado en una variedad de tis posnatalsues y órganos. Las fuentes más comunes de estos ASCs son la médula ósea, tejido adiposo, y el tejido muscular. Sin embargo, las ASC de fuentes postnatales han potencial de crecimiento y diferenciación 24, 25 limitado. También sufren debido al envejecimiento y la exposición a las tensiones ambientales y por lo tanto no siempre son eficaces para aplicaciones terapéuticas 26, 27, 28. Esto nos y otros ha llevado a buscar nuevas fuentes de células madre que son más ingenuo que ASC. Hemos investigado las fuentes perinatal para las células madre primitivas como alternativa a la ASC. En este informe, se proporciona un método fiable, robusta y sencilla para aislar MSC humanas a partir de muestras de cable / placenta. En comparación con otras fuentes y métodos utilizados para el aislamiento de las ASC, este método proporciona un método eficiente y no invasiva para el aislamiento de grandes cantidades de higMSC h calidad. Se acentúa aún más el mayor potencial de crecimiento y la diferenciación de las MSC perinatales en comparación con las MSC de fuentes de adultos tales como BM. La UC unir el feto a la placenta es un órgano grande con regiones anatómicas distintas, incluyendo dos arterias, una vena, Cl, y WJ (tejido que rodea los vasos sanguíneos). Varios estudios han reportado el aislamiento de MSCs de todo el cable, el WJ, o la placenta, con un crecimiento variable y diferenciación potenciales 25, 29. Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha investigado de manera eficaz y en comparación las células de diferentes regiones anatómicas de la muestra de cordón / placenta. Ofrecemos aquí un método sistemático y sencillo para la disección de la UC, el CPJ y conectados FP para el aislamiento de MSC. También mostramos un protocolo completo y sencillo para caracterizar y evaluar la calidad de las células aisladas mediante la determinación de su proliferación capabildades, así como su potencial de auto-renovación y diferenciación. Este método es reproducible y produce una gran cantidad de MSCs calidad superior. Hemos encontrado que la digestión parcial de piezas de tejido de 1-2 mm de tamaño usando una solución de tripsina comercial células reproducible producido a partir de los explantes, mientras que la digestión completa del tejido en células individuales tuvo pobres rendimientos de células aisladas. Sin embargo, un estudio informó que explantes de tejido más grandes de UC aproximadamente 10 mm de tamaño fueron óptimos para el aislamiento de células 30. Por el contrario, otro estudio sugirió que el método de explante de tejido resultó en un ciclo de cultivo más larga y menor rendimiento de las células en comparación con el método de digestión con enzimas de 31. En informes anteriores, el tratamiento de cable de tejidos con colagenasa II y hialuronidasa, por separado o después de la tripsina, se han realizado para aislar células de cordón 32, 33 <sup&gt;, 34. No sólo hay una gran cantidad de variación en los métodos de digestión del tejido del cordón antes del cultivo, sino también las células aisladas parecía ser heterogénea. El uso de enzimas duras durante períodos de tiempo más largos puede degradar la membrana celular, que afecta a la adherencia y proliferación celular. Los resultados de este método mostraron que explantes de tejido perinatales parcialmente digeridos proporcionado derivación de células sin causar extensos daños de células, mantuvieron la viabilidad, y produjeron mayores cantidades de poblaciones homogéneas de MSCs. Mientras que el protocolo para la disección y el aislamiento de las células de los explantes es sencillo, algunos de los pasos que puede llegar a ser un reto. En primer lugar, garantizar la adhesión explante al permitir su fijación a la superficie del matraz de cultivo. Esto se puede facilitar mediante el uso de una pequeña cantidad de medio, solamente cubre las piezas de tejido para las primeras 2 h de cultivo, y después añadiendo cuidadosamente el medio restante. Segundo, limitar el número de explantes a menos del 15 por matraz T75. Demasiado poco espacio entre las piezas o demasiadas piezas por matraz son inhibidora para la excrecencia celular. En tercer lugar, las piezas de tejido que no se adhieren a la superficie del frasco de cultivo después de 3 días de incubación deben ser transferidos a un nuevo matraz para la adherencia y el cultivo. En cuarto lugar, las piezas de tejido a ser cultivadas deben estar libres de restos de células, que inhibe la unión. En quinto lugar, el cultivo de piezas de gran tamaño requiere más medio y no mejora la eficiencia de crecimiento externo celular. Por último, monitorizar los cultivos de explantes de cerca, particularmente después de la aparición del crecimiento de células, como las células pueden rápidamente ser confluente y diferenciar dependiendo de la fuente de tejido. Unas pocas limitaciones de la técnica incluyen la falta de experiencia en la disección de las muestras para separar la CL, WJ, CPJ, y FP; un pequeño tamaño de la muestra, lo que resulta en un rendimiento bajo WJ; y se requieren retraso de procesamiento-las muestras para ser procesados ​​dentro de 2-4 h de la recogida a evIdentificación una pérdida en la recuperación de células. El estándar de oro para la caracterización de MSCs es la capacidad de adherirse al plástico, formar el fenotipo fibroblástico, y diferenciarse en múltiples linajes. Estos son también criterios utilizados comúnmente para la definición de las MSC como se describe por el ISCT 35. En este estudio, las células aisladas a partir de las cuatro fuentes eran adherentes a plástico y tenía expresión positiva para los marcadores de MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, y CD105), pero la expresión negativa para el marcador CD45 hematopoyéticas. Además, expresaron el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I pero fueron negativos para HLA de clase II. En comparación con el BM-MSC, WJ y células derivadas de CPJ eran más altos. Estos resultados son coherentes con los informes anteriores de UC derivado-MSC 33, 36, 37, 38. Además, nuestros resultados mostraron que CL-, WJ, CPJ-, FP-MSC expresó plurigenes potencia, tales como Oct4, Nanog, y Sox2; Sin embargo, su expresión era más bajo que el de los CES, como se informó anteriormente 39. Estos resultados fueron también de acuerdo con un estudio previo que informó de la expresión de marcadores de pluripotencia en células-perinatales derivado 40. Curiosamente, se observó que la expresión de marcador pluripotente fue mayor en CPJ-MSCs que en las células aisladas a partir de otras fuentes. También se observó que la UC-MSC exhibió un mayor potencial de auto-renovación de BM-MSC 41. Curiosamente, a pesar de la similitud en las características fenotípicas, las células aisladas a partir de las cuatro fuentes tenían valores de CFE variables. Sin embargo, a excepción de FP-MSC, todos ellos tenían mejores valores de CFE que BM-MSC. CPJ-MSCs tenía el valor más alto CFE y tasa de proliferación en comparación con todos los otros MSCs. Además, WJ y CPJ-MSCs muestran potenciales de diferenciación más altas que BM-MSC. CL-MSC mostró la menor diferenciaciónpotencial en los tres linajes (es decir, adipogénica, condrogénica y osteogénica), mientras que CPJ-MSCs tuvo el mayor potencial de diferenciación trilinaje y FP-MSCs muestra el potencial de diferenciación adipogénica menos. En conclusión, nuestros resultados mostraron que la calidad y cantidad de las MSC aisladas fueron diferentes entre las cuatro fuentes de la muestra de cordón / placenta. CPJ-MSC tenía más capacidad de proliferación y un mayor potencial de auto-renovación. También eran potentes en su diferenciación en los tipos de células trilinaje. Debido a su tiempo bajo duplicación, CPJ-MSC podría ser rápidamente ampliado 1000 veces y se utiliza para el fármaco de alto rendimiento o de cribado biomaterial. Estas células podrían ser una fuente más prometedora para la terapia celular y aplicaciones de la medicina regenerativa.

Las células madre están presentes en diversos órganos y tejidos del cuerpo. Poseen potencial regenerativo y juegan un papel importante en la reparación de tejidos dañados en el cuerpo durante todo el ciclo de la vida humana 1, 2. Esto ha generado un gran interés en las células madre adultas (ASC), sobre todo porque, a diferencia de las células madre embrionarias (CES), el uso de la ASC no plantean dilemas morales y éticos. Varios estudios han reportado el aislamiento de las ASC, tales como células mesenquimales del estroma (MSC); células madre hematopoyéticas (HSCs); y diferentes progenitores, incluyendo diversas fuentes adultas que van desde la médula ósea (BM) para el tejido adiposo (AT) y la pulpa dental 3, 4, 5. Sin embargo, el número de ASC presentes en la mayoría de los nichos adultos es limitado, y su aislamiento generalmente implica un procedimiento invasivo y doloroso con posible donantemorbilidad del sitio. Además, la edad del donante y el estrés ambiental también podrían desempeñar un papel significativo en la determinación de la calidad y la actividad biológica de las células aisladas 6, 7, 8. ASCs también muestran la proliferación limitada y potencial de diferenciación durante el cultivo in vitro. Para superar estas desventajas de ASC actual, las nuevas fuentes que se hayan intentado aislar células madre. Estos esfuerzos han conducido al aislamiento de células madre a partir de fuentes perinatales, incluyendo sangre del cordón umbilical, el tejido del cordón, la placenta y líquido amniótico 9. Estas fuentes han ganado la atención debido a su fácil disponibilidad y abundante 10, 11, 12, 13. células Además, tejidos perinatales se pueden obtener de forma no invasiva, y madre derivadas de ellos sonmás primitivo que ASCs aislados de fuentes de adultos 14, 15. Ellos se aíslan de los tejidos obtenidos en el nacimiento y se considera que han sufrido alteraciones mínimas en el genoma debido al envejecimiento y ambientales tensiones 16. Sin embargo, las características reportados de células madre procedentes de fuentes perinatales y su potencial de auto-renovación, así como para diferenciar varían ampliamente 11, 17. Esto podría ser en parte debido al hecho de que el cordón umbilical humano (UC) es un órgano complejo. Se postula que las regiones discretas de tejido perinatal crear nichos específicos responsables de las variaciones y la naturaleza más primitiva de estas células madre en comparación con las ASC derivadas de fuentes no perinatales. Este estudio describe la disección de las muestras de cable / placenta en tres regiones discretas anatómicas: UC, Junction cordón placenta (CPJ), unad placenta fetal (FP). La UC se diseccionó además en dos zonas: forro de cable (CL) y gelatina de Wharton (WJ). Análisis de las células aisladas a partir de CL, WJ, CPJ, y FP demostró que todos ellos exhiben morfología fibroblastoide y expresaron marcadores MSC, pero que diferían en su auto-renovación y potencial de diferenciación. células derivadas de CPJ exhiben una mayor tasa de proliferación y la auto-renovación potencial en comparación con UC y células derivadas de FP, haciéndolos una fuente más prometedora para la terapia celular, medicina regenerativa, y la ingeniería de tejidos.

<table><tbody><tr><td>DMEM con 4.500 mg/mL de glucosa</td><td>Invitrogen</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>Isobutil-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879-250mg</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Prospec</td><td>CYT-270</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>TGF y beta; 1</td><td>Prospec</td><td>CYT-716</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A-7631</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A-8960</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G-6251</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>50591419</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de ARN GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>iScript kit</td><td>Biorad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit</td><td>Biorad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Rojo O&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>STORO100</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina</td><td>Thermo Scientific</td><td>S71363</td><td></td></tr><tr><td>Violeta cristalino</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Tinción roja de alizarina</td><td>Thermo Scientific</td><td>S25131</td><td></td></tr><tr><td>APC Ratón anti-humano CD29</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>559883</tr><tr><td>Ratón APC anti-humano CD34</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555824</tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD44</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555478</tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD45</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>555482</tr><tr><td>Ratón APC anti-humano CD73</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>560847</tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD90</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>561969</tr><tr><td>Ratón APC anti-humano CD105</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>de 562408 IEC</td><td>93522M-2</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 2</td><td>Microscopio óptico Thermo Scientific</td><td>Hera Cell 150i</td><td></td></tr><tr><td>(LM)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Hemacitómetro Olympus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>0267151B</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II y Diva Software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>Canto II&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>MJ Research Inc.</td>Sistema de PCR en tiempo real <td>PTC-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal placenta

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

El cordón umbilical humano (UC) y la placenta son fuentes no invasivos, primitivas y abundante de células estromales mesenquimales (MSC) que han ganado cada vez más atención, ya que no plantean preocupaciones éticas o morales. Los métodos actuales para aislar MSCs de UC producen bajas cantidades de células con potencial de proliferación variables. Desde UC es un órgano anatómicamente compleja, diferencias en las propiedades de MSC pueden ser debido a las diferencias en las regiones anatómicas de su aislamiento. En este estudio, hemos diseccionado primero las muestras de cable / placenta en tres regiones anatómicas discretas: UC, Junction cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP). En segundo lugar, dos zonas distintas, forro de cable (CL) y gelatina de Wharton (WJ), se separaron. a continuación, se utilizó la técnica de cultivo de explante para aislar las células de las cuatro fuentes. El tiempo requerido para el cultivo primario de células de los explantes varió dependiendo de la fuente del tejido. Consecuencia de las células se produjo dentro de 3 - 4 days de los explantes CPJ, mientras que se observó crecimiento después de 7 - 10 días y 11 - 14 días de CL / WJ y FP explantes, respectivamente. Las células aisladas eran adherentes a plástico y muestran morfología y de la superficie marcadores fibroblastoides, tales como CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 y, de manera similar a la médula ósea (BM) MSCs derivada de. Sin embargo, la eficiencia de formación de colonias de las células variada, con CPJ-MSCs y WJ-MSC que muestra mayor eficiencia que BM-MSC. MSC de las cuatro fuentes diferencian en adipogénica, condrogénica y linajes osteogénicos, indicando que eran multipotentes. CPJ-MSC diferenciado de manera más eficiente en comparación con otras fuentes de MSC. Estos resultados sugieren que el CPJ es la región anatómica más potente y produce un mayor número de células, con mayores capacidades de proliferación y de auto-renovación in vitro. En conclusión, el análisis comparativo de los MSCs de las cuatro fuentes indicó que CPJ es una fuente más prometedora de las MSC para la terapia celular, regenerative medicina y la ingeniería de tejidos.

La disección y el aislamiento de células de cordón umbilical humano Umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta tejido Perinatal consiste en tres regiones anatómicas discretas. La primera es la UC, que contiene dos arterias y una vena, así como dos zonas distintas: CL (el revestimiento exterior del cable) y WJ (el material gelatinoso que rodea a los vasos sanguíneos dentro del cordón). El segundo es CPJ (la conexión entre el cable y la placenta), y el tercero es FP, que es inmediatamente después de la CPJ (el cable se inserta en la placenta, que está unido a la pared del útero de la madre). El esquemática del protocolo de aislamiento de células a partir de tejido perinatal se representa en la Figura 1. Las cuatro fuentes-CL, WJ, CPJ, y FP-son claramente identificables y se separaron para aislar células de los explantes, tal como se muestra en la Figura 2. Tél aparición del crecimiento de células a partir de cultivos de explantes se controló rutinariamente y grabada por LM. se observaron células fibroblastoides adherentes después de 3-4 días de cultivo de los explantes del CPJ. Las células con morfología similar apareció 7-8, 9-10, y 11-14 días después de cultivar los explantes WJ, Cl, y FP, respectivamente. La derivación de células de los explantes que representan las diversas fuentes (CL, WJ, CPJ, y FP) se representa en la figura 3A. Estas células fueron considerados como P0. Cuando se subcultivaron células P0, que parecían crecer clonal, mostrando una morfología fibroblastoid similar a la de BM-MSC. Sin embargo, ellos exhiben variación en el tiempo de duplicación de la población, que van desde 32 h a 94 h para células de CPJ y FP, como se muestra en la Figura 3B y C. Las células de WJ y CL tuvieron tiempos de duplicación similares medial a CPJ y FP. Un análisis más detallado de las células P0 indicó que también variaron en el CFE, que van desde 16 a 92 colonias.Las células de la CPJ tenía el más alto (92), mientras que las células de PF tenían el más bajo (16) CFE. Las células de CL y WJ tenían valores de CFE de 59 y 80 colonias, respectivamente (Figura 4A) -C. Las células de CL tuvieron valores de CFE similares a la BM-MSC. Estos resultados sugieren que las células CPJ derivados tienen capacidades proliferativas y de auto-renovación más altas. Immunoprofile de las células aisladas Las células aisladas de la CL, WJ, CPJ, y FP se investigaron para la expresión de marcadores específicos de célula. Células P3-5 muestran expresión positiva para los marcadores de MSCs tales como CD29, CD44, CD73, CD90, y CD105 (Figura 5A y B). También se sabe que estas células para expresar principal de histocompatibilidad de clase I marcador, HLA-ABC, y no expresan clase marcador II, HLA-DR 3. Los porcentajes de células positivas para el thESE marcadores seleccionados de las cuatro fuentes fueron similares a la expresada por la norma BM-MSC. Sin embargo, las relaciones de las IFM indican que WJ y células derivadas de CPJ son casi similares y son incluso más alta que la CL- y células derivadas de FP (Figura 5C). Curiosamente, a pesar de la variación de los valores de CFE, todas las células de diferentes fuentes expresaron niveles similares de marcadores MSC. Basándose en los resultados de los marcadores de la superficie celular, las células aisladas a partir de las cuatro fuentes fueron considerados como MSCs. El análisis adicional de estas células reveló que también expresan genes pluripotencia, Oct4, NANOG, KLF4, y SOX2, como se muestra en la Figura 5D. El CPJ-MSCs tenía la más alta expresión de marcadores de pluripotencia, seguido por WJ, Cl- y FP-MSC. Potencial de diferenciación de las MSC aisladas El estándar de oro para la caracterización de las MSC es su capacidad para diferentiate en múltiples linajes. Nuestros resultados mostraron que las MSC aisladas de todas las fuentes perinatales fácilmente diferenciarse en tipos de células adipogénicas, condrogénicas y osteogénicas. Derivados adipogénica producen gotitas de lípidos que se tiñeron positivamente con Oil Red O, como se muestra en la Figura 6A. Azul de toluidina tinción del derivado condrogénica de las MSC demostró la presencia de proteoglicanos y glicoproteínas que ayudaron en la producción de matriz extracelular (Figura 6B). Derivados osteogénica de las MSC teñidas positivamente con rojo de alizarina indican la presencia de los depósitos de calcio que participan en la mineralización ósea, como se muestra en la Figura 6C. Como era de esperar, el análisis de la transcripción de las MSC aisladas de todas las fuentes mostró diferenciación trilinaje (Figura 6D -F). Sin embargo, el boteential de diferenciación variarse dependiendo de la fuente de MSCs. derivados adipogénica de WJ-MSC tenían 2 veces mayores niveles de expresión de los genes adipogénicos seleccionados (CEBPβ, FABP4, y PPAR) en comparación con CPJ-MSC. CL- y FP-MSC tenían la menor expresión de estos genes. En el caso de la diferenciación condrogénica, derivados CPJ-MSC expresaron seleccionan genes condrogénicas (SOX9 y COL2) 50 veces mayor que los derivados de WJ y FP-MSC. Similar a la pobre diferenciación adipogénica de CL-MSC, que tenían un menor potencial condrogénica, como es evidente por la expresión de los genes más bajo condrogénicas. CPJ-MSC también mostró el más alto potencial de diferenciación osteogénica, como se indica por las 2 veces mayores niveles de transcripción de genes osteogénicas seleccionadas (COL1, OPN, y OCN). Sin embargo, la expresión de RUNX2 marcador progenitor fue más alta en los derivados osteogénica de WJ-MSC, lo que indica que estas células eran lentos en responder a condiciones de diferenciación. Una vez más, CL-MSC mostró una pobrela diferenciación en el linaje osteogénico. Estos resultados sugieren que CPJ-MSCs y WJ-MSC muestran mayor potencial de diferenciación de CL- y FP-MSC. La CL-MSC tenía el menor potencial de diferenciarse en derivados trilinaje. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig1.jpg" /> Figura 1: Representación esquemática de la Aislamiento de células de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. Inspeccionar la muestra recogida y proceder con la disección. Paso 1. diseccionar y separar la muestra de cable / placenta en tres regiones discretas Manualmente: cordón umbilical (CU), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP). Separar las dos zonas distintas de la UC en forro de cable (CL) y de Wharton Jelly (WJ) usando tijeras y pinzas. Paso 2. Cortar cada uno de los tejidos diseccionados por separado en 1- to trozos de 2 mm con tijeras y digerir parcialmente las piezas. Paso 3. Cultura las piezas de tejido. Paso 4. aislar las células de los explantes por tratamiento con tripsina. Subcultivo y caracterizar las células aisladas. Paso 5. Las células aisladas y caracterizadas pueden amplificarse y usarse para diversas aplicaciones. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig2.jpg" /> Figura 2: La disección y Cultura de explantes de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. Se muestran las tres regiones diferentes anatómicas de la muestra de cordón / placenta: UC (split en la CL y WJ), CPJ, y FP, así como las arterias y venas asociado. CL, WJ, CPJ,y FP se separaron por disección manual para aislar las células de los explantes. Cada una de las regiones disecadas se cortó por separado en pequeños fragmentos y se cultivaron en 75-cm 2 placas usando 9 ml de CM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig3.jpg" /> Figura 3: Morfología de células aisladas de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. (A) excrecencia de la célula a partir de los explantes de CL, WJ, CPJ, y FP, como se visualiza por LM. (B) El subcultivo de las células aisladas a partir de CL, WJ, CPJ, y explantes FP mostró morfología fibroblastoide. La barra de escala representa 100 m (ampliación: 4X). (C) Población tiempo de t duplicarél aislaron células de CL, WJ, CPJ, y FP. BM-MSC se utiliza como un estándar. Las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig4.jpg" /> Figura 4: Colonia formador de eficiencia de las células de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. (A) Crecimiento de las células (P0) aisladas de CL, WJ, CPJ, y FP, en placas a una densidad clonal de 1,63 células / cm2, se visualizaron por LM. (B) Las fotomicrografías de células teñidas con cristal violeta se presentan la capacidad de formación de colonias. (C) de colonias individuales de células ingenio manchadoh cristal violeta. Las barras de escala representan 100 m (ampliación: 4X). (D) Representación gráfica del número de colonias formadas a partir de las células derivadas de CL, WJ, CPJ, y FP. BM-MSC se utiliza como un estándar. Las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55224/55224fig5.jpg" /> Figura 5: Análisis de MSC marcadores expresados por las células aisladas de Cordón umbilical, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. (A) Expresión de marcadores de superficie mesenquimales (CD29, CD44, CD73, CD90, y CD105) por las células de CL, WJ, CPJ, y FP, como disuadirminado por citometría de flujo. (B y C) Representación gráfica de los porcentajes de células positivas y los ratios de la mediana de intensidad de fluorescencia (MFI) para los marcadores de superficie mesenquimales seleccionados. ratios de IMF se calcularon dividiendo el valor MFI del marcador (generada por el software basado en la intensidad de fluorescencia de poblaciones de células cerradas) por el valor MFI del isotipo. Las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado. (D) Expresión de los genes de pluripotencia (OCT4, NANOG, Klf4, y SOX2) por las células de CL, WJ, CPJ, y FP, según se determina mediante qRT-PCR. (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). La expresión génica se normalizó a GAPDH y β-actina, y las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 6: multilinaje La diferenciación de las MSC aisladas del cordón umbilical humana, Junction Cord-placenta, y Fetal Placenta. Las células (A) se incubaron en medio de diferenciación adipogénica durante 3 semanas y se tiñeron con Oil Red O, lo que indica la presencia de gotitas de lípidos. (B) Los sedimentos celulares se incubaron en medio de diferenciación condrogénica durante 3 semanas. criosecciones histológico de los cultivos de pellets se tiñeron con azul de toluidina, que muestra la presencia de glicosaminoglicanos. (C) Las células se incubaron en medio de diferenciación osteogénica durante 3 semanas y se tiñeron con rojo de alizarina, mostrando la producción de depósitos de calcio que sugieren la mineralización ósea. Todas las imágenes fueron obtenidas por LM. La barra de escala representa 100 m (ampliación: 4X). BM-MSC nosre utilizado como un estándar. (DF) La expresión de genes seleccionados (CEBPβ, FABP4, y PPAR; SOX9, ACAN, y COL2; y COL1, RUNX2, OPN, y OCN que representa la diferenciación de las MSCs en adipogénica, condrogénica, y linajes osteogénicos, respectivamente), como se determina por análisis de QRT-PCR (** p ≤ 0,01 y * p ≤ 0,05). La expresión génica se normalizó a GAPDH y β-actina, y las barras de error representan el error estándar de la media de las mediciones por triplicado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55224/55224fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Gene </td><td> Las secuencias de cebadores </td><td> Longitud del producto </td></tr><tr><td> Oct4 </td><td> Forward-CCCCTGGTGCCGTGAA </td><td> 97 </td></tr><tr><td></td><td> Reverse-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> NANOG </td><td> orientadas hacia el AAAGAATCTTCACCTATGCC </td><td> 110 </td></tr><tr><td></td><td> GAAGGAAGAGGAGAGACAGT inversa </td><td></td></tr><tr><td> KLF4 </td><td> orientadas hacia el CGAACCCACACAGGTGAGAA </td><td> 94 </td></tr><tr><td></td><td> TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC inversa </td><td></td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> orientadas hacia el TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA </td><td> 75 </td></tr><tr><td></td><td> CTGGGGCTCAAACTTCTCTC inversa </td><td></td></tr><tr><td> SOX9 </td><td> orientadas hacia el AGCGAACGCACATCAAGAC </td><td> 85 </td></tr><tr><td></td><td> CTGTAGGCGATCTGTTGGGG inversa </td><td></td></tr><tr><td> col2 </td><td> orientadas hacia el CTCGTGGCAGAGATGGAGAA </td><td> 252 </td></tr><tr><td></td><td> CACCAGGTTCACCAGGATTG inversa </td><td></td></tr><tr><td> UNA LATA </td><td> orientadas hacia el AGCCTGCGCTCCAATGACT </td><td> 103 </td></tr><tr><td></td><td&gt; inversa GGAACACGATGCCTTTCACC </td><td></td></tr><tr><td> col1 </td><td> orientadas hacia el AAGGTCATGCTGGTCTTGCT </td><td> 114 </td></tr><tr><td></td><td> GACCCTGTTCACCTTTTCCA inversa </td><td></td></tr><tr><td> RUNX2 </td><td> orientadas hacia el TGCTTCATTCGCCTCACAAA </td><td> 111 </td></tr><tr><td></td><td> AGTGACCTGCGGAGATTAAC inversa </td><td></td></tr><tr><td> OPN </td><td> orientadas hacia el CATACAAGGCCATCCCCGTT </td><td> 112 </td></tr><tr><td></td><td> TGGGTTTCAGCACTCTGGTC inversa </td><td></td></tr><tr><td> OCN </td><td> orientadas hacia el TAAACAGTGCTGGAGGCTGG </td><td> 191 </td></tr><tr><td></td><td> CTTGGACACAAAGGCTGCAC inversa </td><td></td></tr><tr><td> CEBPβ </td><td> orientadas hacia el TATAGGCTGGGCTTCCCCTT </td><td> 94 </td></tr><tr><td></td><td> AGCTTTCTGGTGTGACTCGG inversa </td><td></td></tr><tr><td> FABP4 </td><td> orientadas hacia el TTAGATGGGGGTGTCCTGGT </td><td> 158 </td></tr><tr><td></td><td> GGTCAACGTCCCTTGGCTTA inversa </td><td></td></tr><tr><td> PPAR? </td><td> orientadas hacia el GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC </td><td> 74 </td></tr><tr><td></td><td> ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG inversa </td><td></td></tr><tr><td> GAPDH </td><td> orientadas hacia el ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG </td><td> 101 </td></tr><tr><td></td><td> GCCATCACGCCACAGTTTC inversa </td><td></td></tr><tr><td> actina </td><td> orientadas hacia el AATCTGGCACCACACCTTCTAC </td><td> 170 </td></tr><tr><td></td><td> ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC inversa </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: Lista de Secuencias de los Cebadores humanos utilizados en este estudio.

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

El objetivo general de este protocolo es aislar células estromales mesenquimales de cuatro fuentes distintas de tejido perinatal: el revestimiento del cordón umbilical, la gelatina de Wharton, la unión cordón-placenta y la placenta fetal. Este método puede contribuir al avance de la biología de células madre y de la medicina alternativa, al obtener células madre mesenquimales de calidad especial sin procedimientos invasivos. La principal ventaja de esta técnica es que produce de forma eficiente grandes cantidades de poblaciones celulares homogéneas de alta calidad a partir de distintas fuentes de tejido perinatal.Las células estromales mesenquimales multivalentes derivadas de esta técnica pueden utilizarse para tratar diversas enfermedades y trastornos, ya que son más primitivas que las células madre mesenquimales aisladas de tejidos adultos. Este método puede proporcionar información sobre las características de las células estromales mesenquimales provenientes de diferentes segmentos y nichos específicos del cordón y la placenta. Comience colocando la muestra en una placa de Petri de 150 milímetros sobre hielo en una cabina de seguridad biológica y utilice una aguja y una jeringa para enjuagar el tejido varias veces con PBS frío.Una vez que se hayan eliminado todos los coágulos de sangre, examine cuidadosamente la muestra para identificar las diferentes regiones anatómicas. Luego, use pinzas para sujetar el extremo fetal del cordón umbilical y tijeras para realizar cuidadosamente una incisión en la parte superior de la unión entre el cordón y la placenta. Haga una segunda incisión debajo de la unión para separar la unión del cordón placentario de la placenta.Y divida los tejidos separados en placas de Petri individuales. A continuación, corte longitudinalmente el cordón umbilical para exponer completamente los vasos sanguíneos y la gelatina de Wharton circundante sin alterar el epitelio. Utilice un escalpelo para raspar la gelatina de Wharton separándola de los vasos sanguíneos y del interepitelio del subamnios.Luego, retire los vasos sanguíneos, transfiriendo cualquier gelatina perivascular restante debajo y alrededor de los vasos sanguíneos al recipiente de gelatina de Wharton y coloque el tejido restante del revestimiento del cordón en su propio recipiente. Cuando todos los tejidos hayan sido diseccionados, reemplace el PBS en cada recipiente con tres a cinco mililitros de tripsina y use tijeras para cortar cada muestra de tejido en fragmentos de uno a dos milímetros para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Utilice un microscopio de contraste de fases para observar la digestión parcial visualizando la liberación de células del tejido.Al final del período de digestión parcial, neutralice la tripsina con un volumen igual de medio de cultivo y transfiera las muestras a tubos cónicos individuales de 50 mililitros. Deje asentar los fragmentos de tejido durante tres minutos. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante y siembre de 15 a 20 fragmentos de tejido parcialmente digeridos por muestra en frascos individuales de cultivo de tejidos de 75 centímetros cuadrados.A continuación, agregue nueve mililitros de medio de cultivo para una incubación de dos a tres días a 37 grados Celsius. Cambie el medio de cultivo después de tres días y examine los injertos mediante microscopía de contraste de fases para observar el crecimiento celular. Cuando el crecimiento celular alcance una confluencia del 70 por ciento, disocie las células en uno o dos mililitros de solución de tripsina por frasco, rotando el frasco para lograr una cobertura uniforme con la solución enzimática e incube los cultivos durante tres minutos a 37 grados Celsius.Luego, neutralice la reacción con uno a dos mililitros de medio de cultivo. Recupere las células por centrifugación, resuspendiendo el sedimento en medio de cultivo para su subcultivo a una densidad de siembra de una vez diez a la cuarta células por centímetro cuadrado. Las células procedentes de los cultivos del revestimiento del cordón y de la gelatina de Wharton presentan valores de eficiencia de formación de colonias de 59 y 80 colonias, respectivamente.El valor de eficiencia de formación de colonias de las células de la unión cordón-placenta, sin embargo, es similar al observado para las células madre mesenquimales de la médula ósea, lo que sugiere que las células derivadas de la unión cordón-placenta tienen mayores capacidades proliferativas y de autorrenovación. Un análisis citométrico de flujo de las suspensiones celulares individuales aisladas de estos tejidos perinatales indica que los porcentajes de células positivas para marcadores específicos de células madre mesenquimales de las cuatro fuentes tisulares son similares a los expresados por las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea estándar. Las relaciones de intensidad de fluorescencia mediana, sin embargo, indican que las células derivadas de la gelatina de Wharton y de la unión cordón-placenta son muy similares o superiores a las células derivadas del revestimiento del cordón en la placenta fetal.Curiosamente, a pesar de sus diferentes valores de eficiencia formadora de colonias, todas las células procedentes de las distintas fuentes perinatales expresan niveles similares de marcadores de pluripotencia mediante análisis de RT-PCR cuantitativa, excepto las células estromales mesenquimales derivadas de la unión cordón-placenta, que expresaron los niveles más altos de expresión para todos los marcadores de pluripotencia analizados. Además, las células estromales mesenquimales aisladas de todas las fuentes perinatales se diferencian fácilmente en tipos celulares adipogénicos, condrogénicos y osteogénicos, demostrando así una diferenciación trilineal. Aunque el potencial de diferenciación varía según el origen de las células estromales mesenquimales.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos o tres horas si se realiza de manera eficiente. Al intentar este procedimiento, es importante practicar la técnica lateral y evitar la contaminación cruzada entre las fuentes de tejido. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran la naturaleza de los nichos de células madre en tejidos perinatales.

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Investigación

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Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Las células madre mesenquimales (MSCs) tienen un potencial de diferenciación hacia el linaje osteoblástico cuando se estimulan con factores solubles o biomateriales específicos. Este trabajo presenta una opción novedosa para la administración de MSCs de la membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emplea la matriz ósea bovina Nukbone (NKB) como andamio.

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En este documento se describen los métodos para la disección de tejidos fetales y maternas de placenta humana a término, seguido por el aislamiento y expansión de células madre mesenquimatosas / estroma (MSC) de estos tejidos.

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Cordón umbilical humano (UC) puede obtenerse durante el período perinatal como consecuencia de la prematuro, término y entrega de postterm. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-derivados de células madre mesenquimales (MSCs-UC) de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

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Describimos un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético.

Generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético

Este estudio presenta un procedimiento único de disección roma para preservar la integridad de la jalea de Wharton (WJ), lo que resulta en WJ menos dañado y una mayor cantidad y viabilidad de las células madre mesenquimales (MSC) recolectadas. El método demuestra un rendimiento y una capacidad proliferativa superiores en comparación con los métodos convencionales de disección aguda.

Aislamiento de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical con alto rendimiento y bajo daño

El aislamiento delas MSCsBAMBI altasen MFGE8, uno de los tres subgrupos principales que constituyen las UC-MSCs humanas heterogéneas, es útil para comprender completamente las características y funciones de este subtipo para su futura aplicación para mejorar la eficacia clínica en enfermedades específicas. Aquí, presentamos un método para clasificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Aislamiento de células estromales mesenquimales derivadas del cordón umbilical BAMBIhumano con altocontenido de MFGE8

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

La heterogeneidad transcripcional dentro de las células estromales derivadas del tejido adiposo humano se puede definir a nivel de célula individual utilizando marcadores de superficie celular y genes osteogénicos.  Describimos un protocolo que utiliza citometría de flujo para el aislamiento de subpoblaciones celulares con mayor potencial osteogénico, que puede usarse para mejorar la reconstrucción esquelética craneofacial.

El aislamiento y enriquecimiento de Human adiposo derivado de células estromales de la osteogénesis mejorada

Este protocolo describe el aislamiento de las células satélite de músculos de la cabeza branchiomeric de una rata 9 semanas de edad. Los músculos se originan a partir de diferentes arcos branquiales. Posteriormente, las células satélite son cultivadas en un recubrimiento de punto de tamaño de milímetro para estudiar su diferenciación. Este enfoque evita la expansión y pases de las células satélite.

Aislamiento y caracterización de las células satélite de Músculos Rata Head Branchiomeric

Aprende a aislar células mesenquimales del estroma de cordón umbilical y placenta fetal mediante cultivo de explantes. Este método no invasivo produce poblaciones celulares homogéneas de alta calidad para aplicaciones en medicina regenerativa.

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