Name: Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a aislar la médula espinal por extrusión hidráulica e identificar ganglios de la raíz dorsal en roedores. Este método rápido minimiza el daño tisular y facilita análisis neurobiológicos posteriores.

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Nos gustaría agradecer a David Kiel, de la Universidad de Aarhus, por filmar y editar. Se utilizó el software VirtualDub para el procesamiento de secuencias de vídeo de microscopio. Agradecemos al Instituto Danés de Investigación de Neurociencia Traslacional - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, por el acceso al equipo y a la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus, al proyecto PAINCAGE de la UE 7FP, Det Frie Forskningsrad (DFF) y a la Fundación Lundbeck por su financiación.

Todos los animales fueron manejados en plena conformidad con los reglamentos daneses y europeos. Número de Permiso: 2012-15-2934. 1. Preparación de la jeringuilla por extrusión hidráulica de la Médula Espinal <ol><li> Para una rata adulta, utilice una jeringa de 10 ml. Para un ratón adulto, utilizar una jeringa de 5 ml. Para los cachorros, utilice una jeringa de 2,5 ml. </li><li> Ajuste una punta de pipeta no universalmente filtro adecuado para 2-200 pipetas mu L por el recorte de la gran final de la punta de la pipeta hasta que se ajuste firmemente a la jeringa. Coloque la punta de la pipeta ajustada en la jeringa. Para los cachorros, utilizar una aguja de 23 G o similar en lugar de una punta de pipeta ajustada. </li><li> Aspirar PBS estéril y dejar la jeringa en hielo hasta su uso posterior en frío de hielo. </li></ol> 2. La eutanasia <ol><li> No realice dislocación cervical, ya que esto perturbe la columna vertebral representación de extrusión imposible. </li><li> Para el adulto de rata / ratón, la eutanasia usando gas tal como CO2 o isofluRane. Estas sustancias son dañinas. Realizar la eutanasia en una campana de humos y manejar las sustancias de acuerdo con directrices de la institución. (PRECAUCIÓN: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Para asegurarse de que el roedor está muerto, garantizar la ausencia de reflejo pellizcando una pata con pinzas. Decapitar al roedor usando tijeras grandes. Para los cachorros, la eutanasia por decapitación. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de la columna vertebral <ol><li> Espolvorear agua sobre la piel para controlar el cabello. </li><li> El uso de un par de tijeras, corte abierto la piel a lo largo de la columna vertebral en una dirección distal y aislar la columna vertebral mediante el corte en ambos lados a lo largo de la columna vertebral más allá del hueso de la pelvis. Cortar la médula espinal distal al hueso pélvico con un par de tijeras. NOTA: El eje rostral-caudal se denota como el eje proximal-distal durante todo el protocolo. <ol><li> Recorte de la columna vertebral con un par de tijeras para evitar la proximal-más y más distal áreas, ya que pueden hacer que la columna vertebral también en forma de S para el éxito de la extrusión de la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal es visible en ambos extremos. Si la médula espinal no es visible, el asiento de la columna vertebral con tijeras hasta la médula espinal se hace visible. </li></ol></li></ol> 4. hidráulica de extrusión de la Médula Espinal <ol><li> Colocar una placa de Petri (100 mm de diámetro) lleno de PBS estéril en hielo. </li><li> Enderezar la columna vertebral mediante la aplicación de un dedo índice en la parte doblada (extremo más proximal) de la columna vertebral, enderezando de ese modo la columna vertebral lo más posible. <ol><li> Para cachorros, evitar doblar la columna vertebral, como las vértebras se interrumpirá la prestación de extrusión de la médula espinal imposible. </li></ol></li><li> Insertar la punta de la pipeta (23 G aguja para cachorros, de forma alternativa 18 de la aguja G para ratones adultos) en el extremo más distal de la columna vertebral. Si se inserta correctamente, la punta se estabiliza en la cavidad de la médula. </li><li> Asegúrese de que la columna vertebral se endereza tanto como sea posible. Aplique una presión constante, y la extrusión de la médula espinal en la placa de Petri en el hielo. Asegúrese de que la médula espinal se mantiene húmedo en hielo por mantenerla en PBS hasta su posterior manipulación. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figura 1: médulas espinales representativos. Hidráulicamente extruido médula espinal. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón. ampliaciones lumbares marcados por caja. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. Identificación de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) <ol><li> Dividir la columna vertebral en dos partes longitudinales iguales utilizando tijeras y colocar la columna vertebral de división bajo el microscopio. </li><li> Identificar el segmento T13 vértebra a<html> localizar el sitio de unión de la más distal costillas sobre la columna vertebral prestar atención para no confundir la costae con los nervios intercostales cercanas. Los más distal costae están unidos a la parte proximal del segmento vértebra T13 y el T13 DRG está situado distalmente a T13 vértebra y proximalmente a la vértebra L1. </li><li> Identificar los GRD concomitantes en la dirección distal. Para una rata adulta, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para un ratón adulto, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para los cachorros, los GRD concomitantes aparecen como esferas claras. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figura 2: Identificación de los GRD en la columna vertebral después de la extrusión de la médula espinal. La columna vertebral se ha dividido que permite la visualización de los GRD, como se indica por las flechas. Ejemplificado por rata adulta y la cría de ratón.<html> ref = objetivo &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Aislamiento de los GRD <ol><li> Platos Número de Petri (30 mm de diámetro) de acuerdo con los GRD específicos a ser aislados, por ejemplo, L3, L4, L5. Llenar las cajas de Petri con helado de PBS estéril y colocarlos en hielo. </li><li> Con unas tijeras micro, dorsal y cortar las raíces ventrales tan cerca de los GRD como sea posible para liberarlos, evitando dañar los GRD. </li><li> Con la punta de las pinzas cerradas, suavemente sáquele GRD y transferirlos a las placas de Petri numeradas correspondientes. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figura 3: Representante aislado GRD. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón.&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 7. Tratamiento de tejidos para su posterior análisis <ol><li> Western Blot <ol><li> Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación. Si es necesario, separar la médula espinal en ipsilateral y contralateral partes y más en la dorsal y ventral cuernos. </li><li> Coloque el tejido en tampón de lisis tal como tampón TNE de lisis (10 mM Tris-base, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP40 en bidestilada H 2 O) que contiene inhibidores de la enzima apropiados sobre hielo. </li><li> Homogeneizar el tejido durante aproximadamente 30 s en hielo usando una mano de mortero de molienda mecánica. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 16.000 xg a 4 ° C y utilizar el sobrenadante para su posterior procesamiento de acuerdo con protocolos estándar 5, 6 o mantener el sobrenadante a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> RNA-análisis <ol><li> Aislar el tejido de interés. </li><li> Colocar inmediatamente el tejido en una solución de estabilización de ARN para estabilizar el ARN para el almacenamiento. </li><li> Aislar ARN de acuerdo con protocolos estándar 7. </li><li> Convertir RNA a cDNA y realizar qPCR acuerdo con protocolos estándar 7. </li></ol></li><li> La inmunohistoquímica <ol><li> Para tejido fresco congelado (aplicable a la médula espinal): <ol><li> Preparar polvo de hielo seco pulverizando los cubos de hielo seco a una cantidad correspondiente a dos cucharadas de polvo. Cubra cubos de hielo seco en un paño y pulverizar los cubos con un martillo. Coloque la hoja de plata (aproximadamente 5 cm x 5 cm) sobre una capa de cubos de hielo seco y cubrir la hoja de plata con el polvo de hielo seco. </li><li> Coloque el área de la médula espinal seleccionado para profundizar el análisis sobre el polvo de hielo seco con unas pinzas, se deja complemento de congelación, y la transferencia de la médula espinal a un tubo criogénico. Mantener en hielo seco en todo momento o almacenarla a -80 ° C hasta auxílianosmi. </li><li> La transferencia de la médula espinal para un criostato (-20 ° C). Si es necesario, cortar la médula espinal dentro del criostato. Coloque la médula espinal en el interior del material aglomerante criostato con el fin de adjuntarlo a la platina. </li><li> Cortar la médula espinal en el espesor deseado, por ejemplo, 5 m, y recoger sobre placas de vidrio. Calentar las placas de vidrio con un dedo inmediatamente antes de la recogida de tejidos para un mejor agarre. Mantenga cualquier tejido sobrante en tubos criogénicos a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Deje las secciones sobre placas de vidrio en el interior del criostato hasta que esté listo para la post-fijación. </li><li> Post-fijar las secciones por inmersión en 4% PFA durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8. </li></ol></li><li> tejido fijado para la sección crio (aplicable a la médula espinal y los GRD) <ol><li> Fijar la médula espinal y los GRD en PFA al 4% (2 h de la médula espinal, 1,5 h para GRD ratón y 4 h de GRD de rata) a4 ° C (lugar de la médula espinal en posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada). </li><li> Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior. Si es necesario, recortar la médula espinal para compensar la ampliación lumbar solamente en un tablero de silicona o similar. </li><li> Con la punta de una toalla de papel, aspirar el exceso de solución de sacarosa a partir del tejido. </li><li> Llenar hasta la mitad un molde crio con material aglomerante. Empuje las burbujas a los lados del molde crio con herramientas tales como pinzas cerradas. </li><li> Coloque el tejido en el material de incrustación con unas pinzas y garantizar la orientación tejido deseado. </li><li> Llenar el molde crio completamente con el material de incrustación y empujar las burbujas tan lejos de los tejidos como sea posible (por ejemplo, usando pinzas cerradas). </li><li> Llene una placa de Petri (100 mmde diámetro) con 2-metilbutano. Esta sustancia es perjudicial. Realice este paso en una campana de humos y manejar la sustancia de acuerdo con directrices de la institución (PRECAUCIÓN: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Coloque la placa de Petri sobre una capa de hielo seco y añadir dos cubos de hielo seco a la placa de Petri. Coloque el molde crio en la placa de Petri y permitir que el material de incrustación para congelar completamente. </li><li> Mantener el tejido embebido en hielo seco en todo momento o a -80 ° C envueltos en Parafilm hasta su posterior procesamiento. </li><li> Cortar el tejido en un criostato (-20 ° C) en el espesor deseado, por ejemplo 5 m. </li><li> Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8. </li></ol></li><li> tejido fijado para la inclusión en parafina (aplicable a la médula espinal y los GRD) <ol><li> Fijar la médula espinal y los GRD en 4% PFA (2 h para la médula espinal, 1,5 h para GRD de ratón y de 4 h de GRD de rata) a 4 ° C (lugar de la médula espinalen posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada). </li><li> Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación. </li><li> Llenar hasta la mitad un molde de inclusión con parafina. </li><li> Enfriar el molde brevemente la incrustación colocándolo en la zona de refrigeración de la máquina de incrustación para endurecer la parafina ligeramente. Esto permite un mejor posicionamiento de los tejidos. </li><li> Coloque el tejido en la orientación deseada en el molde de inclusión. Llenar el molde de inclusión con parafina y enfriar inmediatamente. </li><li> Coloque el molde de inclusión en parafina que contiene a 4 ° C durante la noche para dejar que se endurezca por completo y retire el bloque de parafina que contiene el tejido del molde de inclusión. </li><li> secciones de corte omicrotomo na en el espesor deseado, por ejemplo 5 m. </li><li> Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot ">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot </a> (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583035/">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014).</li>
<li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+C+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).</li>
<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si se altera la columna vertebral, por ejemplo, por dislocación cervical, la médula espinal se dividirá durante la extrusión. Si la médula espinal no se puede extruir, la columna vertebral puede ser recortado ligeramente en ambos extremos y el intento de extrusión se puede repetir. En caso de que se necesita toda la médula espinal para su posterior análisis, es decir, que consiste en la ampliación de cuello uterino, así como la ampliación lumbar, la columna vertebral sólo debe ser recortado ligeramente. Si sólo se necesita la ampliación lumbar para su posterior análisis, la médula espinal se debe ajustar de acuerdo con el presente protocolo. La columna vertebral debe enderezarse usando las yemas de los dedos para facilitar la extrusión. El protocolo es aplicable a los roedores de todas las edades y es aquí ejemplificado por un ratón adulto (8 semanas), una cría de ratón (5 días) y una rata adulta (10 semanas). Dependiendo del tipo de animal y la tensión, el número de secciones torácica y lumbar puede variar 9, </sup&gt; 10, 11. Dependiendo de las proteínas a analizar, roedores adultos pueden ser perfundidos con soluciones de inhibidores de enzimas antes de la eutanasia. Si se realiza un experimento con lesión del nervio unilateral, la médula espinal se puede dividir en los lados ipsilaterales y contralaterales utilizando pinzas ultra-finas inmediatamente después de la extrusión. Además, cada lado se puede dividir en lados dorsal y ventral. El tejido puede ser procesada para análisis adicionales, por ejemplo, transferencia Western. Transcardial perfusión-fijación con PFA antes de la extrusión de la médula espinal debe evitarse, ya que esto hace que la médula espinal no flexible y evita cable de extrusión hidráulica espinal. Hidráulica de extrusión de la médula espinal será arrancar las raíces dorsales. Para los experimentos en los adjuntos raíces dorsales son necesarias, se recomienda laminectomía. Además, meninges espinales se pierden por extrusión hidráulica, que se puede evitar mediante laminectomía estándar extrusión hidráulica de la médula espinal y el aislamiento DRG también podría llevarse a cabo utilizando oxigenado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en lugar de PBS enfriado en hielo. El uso de ACSF permite la conservación del tejido aislado en un mejor entorno fisiológico, que es particularmente importante en el caso de registros electrofisiológicos posteriores 12, 13. Una alternativa a ACSF podría ser PBS que contiene 1 g / l de glucosa para la generación de cultivos de DRG primaria 14. extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, lo que reduce el tiempo de manipulación de tejido y por lo tanto reducir el riesgo de daño a las proteínas. La perfusión con un fijador antes de aislar de la médula espinal por laminectomía puede reducir el riesgo de daños en los tejidos durante la disección y durante la extracción final de lade la médula espinal de la columna vertebral. Sin embargo, la fijación del tejido se opone a su aplicabilidad a los análisis, tales como transferencia Western. Los rendimientos de extrusión hidráulicas estructuralmente tejido intacto 3 adecuado para una gama más amplia de análisis. la definición constante de los GRD puede ser difícil. Sin embargo, esto es esencial para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. La tinción de tejido de la médula espinal, así como de los GRD se puede optimizar mediante la realización de las variaciones de tratamiento de tejido ilustradas descritas en el paso 7 de protocolo.

El objetivo general de este método consiste en aislar la médula espinal, así como para identificar y aislar los GRD 1, 2. Extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, es decir, romper la columna vertebral de una en una, y este método reduce el riesgo de daño tisular causado por el proceso de disección de 3, 4 . GRD puede ser difícil de identificar. La identificación correcta es muy importante para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. Tejido aislado por las técnicas demostradas aquí se puede aplicar a una amplia gama de análisis, incluyendo transferencia de Western 5,6, 7 y qPCR tinción inmunohistoquímica 8. Cuando la identificación de los GRD, es importante tener en cuenta que el número de segmentos de la médula espinal se sabe que varían con el tipo de animal y tensión 9, 10, 11. Las ventajas en la realización de este método en los ratones son el elevado número de variantes modificadas genéticamente disponibles y los gastos relativamente bajos de vivienda. Las ventajas de usar las ratas son el rendimiento tejido relativamente alta y si la participación de las lesiones nerviosas, el procedimiento se aliviaron con el tamaño.

<table><tbody><tr><td>Tijeras Bonn, extra finas, rectas, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Para abrir la médula espinal antes del aislamiento de DRG (ratón adulto, rata adulta); Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>Para la centrifugación de tejido homogeneizado</td></tr><tr><td>Microtomo de criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>Para cortar el tejido incrustado antes de la tinción; Se puede utilizar otro modelo y fabricante</td></tr><tr><td>Pinzas, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11231-30</td><td>Para el manejo de la médula espinal después de la extrusión; Se puede utilizar otro fabricante/tipo</td></tr><tr><td>Pinzas, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>Para el aislamiento de DRG (ratón adulto, rata adulta, cachorro); Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Isoflurano (furano) IsoFlo Vet 100%</td><td>Abbott</td><td># 002185</td><td>Para la eutanasia; Se puede utilizar otro fabricante; ATENCIÓN:</td></tr><tr><td>Isopentano tóxico GPR rectapur VWR</td><td>químicos</td><td># 24872.298</td><td>Para la congelación instantánea de tejidos; Se puede utilizar otro fabricante; PRECAUCIÓN:</td></tr><tr><td>micrótomo</td> tóxico <td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Para el corte de tejido embebido en parafina; Se puede utilizar otro modelo y fabricante</td></tr><tr><td>Pellets de cera de parafina</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 76243</td><td>Para la inclusión en parafina; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Estación de inclusión de tejido de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Para la inclusión de tejido en parafina para su posterior seccionamiento; Se puede utilizar otro modelo y fabricante</td></tr><tr><td>Granulometría, motor inalámbrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>Para la homogeneización mecánica de tejido aislado antes de la transferencia occidental; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>Para el almacenamiento de DRG aislados; Se puede utilizar otro fabricante y tamaño Placa</td></tr><tr>de<td>Petri, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># P7741</td><td>Para la extrusión de la médula espinal; Se puede utilizar otro fabricante y tamaño</td></tr><tr><td>Inhibidor de la fosfatasa, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 04906845001</td><td>cóctel de inhibidores de la fosfatasa para agregar al tampón de TNE-lysis si es necesario; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, 1-200 &mu; L, sin filtro</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Para extrusión hidráulica; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa,</td><td>Complete Sigma-Aldrich</td><td># 05892791001</td><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa para agregar al tampón TNE-lysis si es necesario; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Solución RNAlater</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># R0901</td><td>Para la estabilización de ARN para el almacenamiento; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td> <td># 74124</td><td>para el aislamiento de ARN; Se puede utilizar</td></tr><tr><td>otro fabricante de bisturí; Cuchilla quirúrgica Swann-Morton n.º 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Para el aislamiento de la zona lumbar de la médula espinal; Se puede utilizar otro fabricante/tipo</td></tr><tr><td>Tijeras, rectas, tipo 3, filo de corte de 25 mm</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Para el aislamiento de la columna vertebral; Se puede utilizar otro fabricante/tipo</td></tr><tr><td>Tijeras, filo de 130 mm</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Para el aislamiento de la médula espinal (rata adulta)</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte, rectas, filo de corte de 8 mm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Para abrir la columna vertebral antes del aislamiento de DRG (cachorro) y para el aislamiento de DRG (ratón adulto, rata adulta, cachorro); Se pueden utilizar</td></tr><tr><td>jeringas estándar de otro fabricante, 2.5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>Para extrusión hidráulica; Se puede utilizar otro fabricante:</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico MZ12.5 con objetivo 1X y ocular 10X</td>: <td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Se puede utilizar otro fabricante/tipo</td></tr><tr><td>PBS estéril</td><td>GIBCO#</td> <td>10010-015</td><td>Para extrusión hidráulica; También se puede fabricar de acuerdo con los protocolos estándar</td></tr><tr><td>Aguja de jeringa 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Para extrusión hidráulica en pups; Se puede utilizar otro fabricante/tipo</td></tr><tr><td>Aguja de jeringa 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternativa a la punta de pipeta para la extrusión hidráulica en ratones adultos; Se puede utilizar otro fabricante</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>Tssue material de inclusión para la criosección posterior</td></tr><tr><td>tampón TNE-lysis</td><td>VWR chemicals</td><td># 10128-582</td><td>Para la lisis de tejidos antes de la Western blot; Se puede utilizar otro fabricante; También se puede fabricar de acuerdo con protocolos estándar</td></tr></tbody></table>

extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Tradicionalmente, la médula espinal se aísla mediante laminectomía, es decir, rompiendo las vértebras espinales de una en una. Esto lleva mucho tiempo y puede provocar daños en la médula espinal causados por el proceso de disección. Aquí, mostramos cómo se puede extruir la médula espinal utilizando presión hidráulica. El tiempo de manipulación se reduce significativamente a solo unos minutos, lo que probablemente disminuya el daño a las proteínas. El bajo riesgo de daño al tejido de la médula espinal mejora el análisis inmunohistoquímico posterior. Al realizar la extrusión hidráulica de la médula espinal en lugar de la laminectomía tradicional, los roedores se pueden utilizar aún más para el aislamiento de DRG, lo que reduce el número de animales y permite el análisis a través de tejidos del mismo roedor. Demostramos un método consistente para identificar y aislar los GRD de acuerdo con su localización en relación con las costas. Sin embargo, es importante ajustar este método al animal particular utilizado, ya que el número de segmentos de la médula espinal, tanto torácicos como lumbares, puede variar según el tipo de animal y la cepa. Además, ilustramos ejemplos de procesamiento adicionales de los tejidos aislados.

Médulas espinales hidráulicamente extruidos presentan una superficie lisa sin daños muestra en la Figura 1. La ampliación lumbar puede ser fácilmente identificado como el área engrosada de la médula espinal, encajonado en la Figura 1. Los lados dorsal y ventral de la médula espinal pueden ser identificados por los ojos de acuerdo con la morfología. En la Figura 1, el lado ventral se enfrenta al espectador, identificable por una línea media clara a lo largo de toda la médula espinal. Dos líneas más generales a lo largo de la médula espinal permiten la identificación de la cara dorsal. En el extremo más distal, la cola de caballo a veces puede permanecer unido en ratas adultas y ratones adultos. GRD individuales sólo pueden ser identificados mientras se encuentra en la columna vertebral, la Figura 2. Después del aislamiento, la Figura 3, los GRD individuales no pueden ser identificados por la apariencia. Si es necesario, es por lo tantoimportante mantenerlos claramente separados tras el aislamiento. Después del aislamiento, la médula espinal y los GRD pueden ser procesados y se tiñeron como se indica en el paso 7.3 y representado en la Figura 4. La figura 4a muestra una tinción inmunohistoquímica de una sección donde los DRG neuronas y células gliales sus alrededores satélite son claramente visibles. Por la correcta identificación del DRG es posible analizar el efecto de las lesiones del nervio ciático en el soma de la neurona lesionada, así como en sus células gliales satélite circundante. La figura 4b muestra una tinción de Nissl de una médula espinal hidráulicamente extruido en el que el tejido está intacto como se refleja por los bordes lisos de la sección. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figura 4: secciones de tejido representativas. A. La tinción inmunohistoquímica de la sección DRG. B. Nissl manchadas sección de la médula espinal hidráulicamente extruido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para la extrusión hidráulica de la médula espinal, así como la identificación y el aislamiento de ganglios específicos de la raíz dorsal (DRG) en el mismo roedor. En comparación con los métodos estándar de aislamiento de la médula espinal, este método es significativamente más rápido y reduce el riesgo de daño tisular.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

El objetivo general de este método es aislar la médula espinal mediante extrusión hidráulica, así como identificar y aislar los ganglios de la raíz dorsal en ratones y ratas. Esto se logra primero mediante la eutanasia del roedor, seguida de la decapitación. Se realiza un corte en la piel a lo largo de la columna vertebral y se separa del tejido subyacente.A continuación, se separa la columna vertebral del tejido circundante cortando a ambos lados de la columna vertebral en dirección distal, más allá del hueso pélvico. Luego, se corta la columna vertebral en la región distal al hueso pélvico. Se inserta una jeringa con una punta de pipeta ajustada en el extremo más distal de la médula espinal.Aplicando presión constante, se extruye la médula espinal en una placa de Petri sobre hielo utilizando PBS estéril frío. Con tijeras de resorte, se divide longitudinalmente la columna vertebral. A continuación, se localizan los sitios de inserción de la costilla más distal.Esto permite la identificación de los ganglios de la raíz dorsal torácicos más distales en cada lado, denominados T13. Ahora se pueden identificar los ganglios de la raíz dorsal subsiguientes. Los ganglios de la raíz dorsal correspondientes al ensanchamiento lumbar de la médula espinal se encuentran en posición distal.Utilizando tijeras de resorte, se cortan las raíces dorsal y ventral y se extraen suavemente los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de la cavidad, transfiriéndolos a placas de Petri etiquetadas que contienen PBS estéril sobre hielo. La extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la laminectomía tradicional, en la que las vértebras espinales se rompen una a una. Este método reduce el riesgo de daño tisular causado por el proceso de disección y produce tejido adecuado para una amplia gama de análisis.Generalmente, los ganglios de la raíz dorsal pueden ser difíciles de identificar. Sin embargo, la identificación correcta es muy importante para el análisis posterior del tejido, por ejemplo, tras una lesión del nervio ciático. Por lo tanto, al numerar los ganglios de la raíz dorsal según su localización en relación con la costilla, se pueden identificar de manera consistente.Prepare una jeringa para la extracción de la médula espinal cortando el extremo grande de una punta de pipeta sin filtro. La punta encajará firmemente cuando se ajuste correctamente. Aspire PBS estéril frío con hielo y deje la jeringa sobre hielo hasta su uso posterior.Para roedores adultos, realizar eutanasia con gas, como CO2 o isoflurano, seguida de decapitación. No realizar dislocación cervical, ya que esto alteraría las vértebras espinales y haría imposible la extracción de la médula espinal. Las crías pueden ser sometidas a eutanasia mediante decapitación directa.Espolvoree agua sobre el pelaje para controlar el vello. A continuación, corte el pelaje a lo largo de la columna vertebral en dirección distal. Aísle la columna vertebral cortando por ambos lados a lo largo de la columna más allá del hueso pélvico y corte la columna vertebral proximal a la pelvis.Recorte la columna vertebral para evitar las áreas más proximales y más distales, ya que estas podrían hacer que la columna vertebral adopte una forma demasiado en S, dificultando la extracción exitosa de la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal sea visible en ambos extremos. Si la médula espinal no es visible, recorte la columna vertebral hasta que la médula espinal quede expuesta.Coloque una placa de Petri que contenga PBS sobre hielo. Enderece la columna vertebral colocando el dedo índice sobre la parte doblada en el extremo proximal de la columna vertebral. Introduzca la punta de la pipeta en el extremo distal de la médula espinal.Aplique presión constante y extruya la médula espinal hacia la placa de Petri. Corte abierta la columna vertebral. Corte algunas vértebras en el lado ventral de la columna y luego pase a cortar algunas vértebras en el lado dorsal.Continúe alternando lados a lo largo de toda la columna vertebral. Coloque la médula espinal abierta bajo un microscopio. Identifique el segmento de la vértebra T13 localizando el sitio de inserción de la costilla más distal en la columna vertebral.Tenga cuidado de no confundir la costilla más distal con los nervios intercostales cercanos. La costilla más distal está unida a la parte proximal del segmento de la vértebra T13, y los ganglios dorsales T13 se encuentran distalmente a la vértebra T13 y proximalmente a la vértebra L1. Identifique los ganglios dorsales correspondientes en dirección distal. Prepare placas de Petri numeradas que contengan PBS estéril frío sobre hielo. Para evitar dañar el ganglio de la raíz dorsal durante su extracción, sujete las raíces dorsal y ventral en lugar del ganglio de la raíz dorsal mismo con un par de pinzas n.º 5. Utilizando tijeras microquirúrgicas, primero corte el nervio periférico, seguido de las raíces dorsal y ventral. En las crías, estos nervios no son tan claramente visibles como en los roedores adultos.Con el fin de cortar los nervios lo más cerca posible del ganglio de la raíz dorsal (GRD), deslice suavemente la punta de las tijeras a lo largo del GRD para posicionarla antes de realizar el corte. Utilizando la punta de las pinzas cerradas, extraiga con cuidado los GRD y transfiéralos al platillo de Petri correspondiente. En ratas y ratones adultos, los GRD son blancos y presentan raíces dorsal y ventral claramente visibles, mientras que en las crías los GRD aparecen como esferas transparentes.Para inmunotransferencia, aísle el tejido de interés y coloque el tejido en tampón de lisis. A continuación, homogenice el tejido, centrifugue, recoja el sobrenadante y realice la inmunotransferencia según protocolos estándar. Para el análisis de ARN, aísle el tejido de interés y coloque inmediatamente el tejido en solución de estabilización de ARN.A continuación, realice la qPCR según protocolos estándar. Para inmunohistoquímica en tejido congelado rápidamente, prepare polvo de hielo seco sobre un trozo de papel de aluminio. Coloque el tejido sobre el polvo de hielo seco para permitir su congelación rápida.Luego, transfiera el tejido a un criostato e incluya el tejido para su corte. Post-fije el tejido en PFA al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente y realice la tinción inmunohistoquímica según protocolos estándar. Para inmunohistoquímica en cortes congelados, fije el tejido en PFA al 4 % a cuatro grados y transfiera el tejido a sacarosa al 25 % peso por volumen durante la noche a cuatro grados.Coloque el tejido en material de inclusión y congele el tejido utilizando 2-metilbutano enfriado. Corte el tejido en un criostato y realice la tinción inmunohistoquímica según protocolos estándar. Para inmunohistoquímica en secciones de parafina, fije el tejido en PFA al 4 % a cuatro grados y transfiera el tejido a sacarosa al 25 % peso por volumen durante la noche a cuatro grados.Incrustar el tejido en parafina, cortar el tejido en un microtomo y realizar la tinción inmunohistoquímica según protocolos estándar. Dependiendo de los anticuerpos utilizados para la tinción inmunohistoquímica, cualquiera de los métodos de tratamiento de tejido ejemplificados podría resultar aplicable. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar la médula espinal mediante extrusión hidráulica y de cómo identificar y aislar los ganglios de la raíz dorsal de manera consistente.Los métodos mostrados aquí son aplicables a ratones y ratas de todas las edades, y el tejido aislado puede utilizarse para una amplia gama de análisis, incluidos métodos que requieren un aislamiento rápido de tejido no fijado.

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Investigación

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Neurociencia

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

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En este video, describimos un protocolo paso a paso para aislar la médula espinal de un modelo de ratón para estudios in vitro.

Extracción de la médula espinal: un protocolo para aislar la médula espinal murina para estudios in vitro

Este video muestra un procedimiento para aislar neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de embriones de rata y co-cultivarlas con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann maduras. Los DRG aislados se procesan para aislar las neuronas y las células gliales. Las células aisladas se cultivan para purificar las neuronas, que luego se cultivan conjuntamente con células similares a las células de Schwann (SCLC) en un medio de cocultivo. La interacción con las neuronas...

Aislamiento de neuronas DRG y cocultivo con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann

Este video presenta un método para aislar células madre/progenitoras neurales del tejido periventricular de la médula espinal en ratas adultas. La técnica incluye la incubación de los fragmentos de tejido en una solución que contiene enzimas proteolíticas para alterar la matriz extracelular y liberar las células. Posteriormente, las células liberadas se colocan en un medio que contiene factores de crecimiento específicos que mejoran la proliferación de troncos y progenitores neurales y...

Aislamiento de células progenitoras madre neurales de la región periventricular de la médula espinal de una rata adulta

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de la columna vertebral de rata. Los GRD extirpados de la columna vertebral se tratan con enzimas y se disocian mecánicamente para obtener una suspensión unicelular. Las células se cultivan en un medio que contiene inhibidores y factores de crecimiento que limitan la proliferación de células gliales y promueven el crecimiento neuronal, respectivamente.

Establecimiento de un cultivo primario de células de ganglios de raíz dorsal a partir de una columna vertebral de rata

La médula espinal de los mamíferos adultos contiene células madre/progenitoras neurales (NSPCs) que pueden ser aisladas y expandidas en cultivo. Este protocolo describe la recolección, el aislamiento, el cultivo y el paso de NSPC generados a partir de la región periventricular de la médula espinal adulta de la rata y de donantes de trasplante de órganos humanos.

Aislamiento de células neurales madre / progenitoras de la región periventricular de la rata de Adultos y de la médula espinal humana

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Este protocolo presenta el uso de una inyección de ganglios de la raíz dorsal (DRG) con un vector viral y una lesión concurrente por aplastamiento de la raíz dorsal en una rata adulta como modelo para estudiar la regeneración sensorial de los axones. Este modelo es adecuado para investigar el uso de la terapia génica para promover la regeneración sensorial de los axones.

Inyección de raíz dorsal ganglio de raíz dorsal y Lesión por aplastamiento como modelo para la regeneración del axón sensorial

Este protocolo proporciona una técnica para cosechar y cultivar ganglios de raíz dorsal explantados (DRG) de ratas Sprague Dawley adultas en un dispositivo multicompartimento (MC).

Cosecha, incrustación y cultivo de ganglios de la raíz dorsal en dispositivos multicompartimentales para estudiar las características neuronales periféricas

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales primarias y transmiten señales sensoriales periféricas a la médula espinal. Este protocolo describe un método para la disección por DRG en ratón que permite el aislamiento estandarizado de ganglios estructuralmente intactos, la identificación anatómica segmentaria, una guía intuitiva para usuarios principiantes y la reducción de lesiones tejidulares procedimentales.

Disección y aislamiento de los ganglios dorsales de la raíz del ratón

Aprende a aislar la médula espinal por extrusión hidráulica e identificar ganglios de la raíz dorsal en roedores. Este método rápido minimiza el daño tisular y facilita análisis neurobiológicos posteriores.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

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