Cuantificación de la Drosophila Grooming Comportamiento

El objetivo general de este método es medir el comportamiento de aseo de Drosophila cuantificando y comparando el residuo de colorante amarillo brillante en el cuerpo de los animales en condiciones de aseo y sin aseo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología y la genética del comportamiento, como la coordinación de habilidades locomotoras finas y los reguladores moleculares y circuitos asociados. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida, robusta y fácil de realizar por muchos investigadores y estudiantes con diversos niveles de experiencia.

Este procedimiento será demostrado por Frankie Barradale, un estudiante en mi laboratorio. Para comenzar el experimento, prepare un aspirador para trasladar Drosophila vivos desde un vial de cultivo hasta la cámara de aseo. Con tijeras, corte 1.5 pies de tubo de Tygon.

Corte al menos un centímetro del extremo de una punta desechable de micropipeta de un mililitro y sostenga el trozo cuadrado de malla de un centímetro sobre la abertura de 196 pulgadas de la punta cortada. Coloque firmemente una punta nueva de micropipeta de un mililitro sobre la malla y la punta cortada para crear una cámara de contención para las moscas. Corte el extremo más fino de la nueva punta de micropipeta para ensanchar la abertura lo suficiente como para permitir el paso de una sola mosca.

El orificio tendrá aproximadamente el tamaño de la abertura de la cámara de aseo. Ajuste firmemente las puntas anidadas en el extremo del tubo de Tygon. Introduzca las puntas en el tubo para asegurar un ajuste hermético que permita la presión de vacío.

En el otro extremo del tubo, corte la punta de una punta de micropipeta de 200 mililitros y ajuste el extremo cortado más estrecho dentro del tubo para formar el lado bucal del aspirador. Para preparar los tubos con alícuotas de polvo, pese cinco miligramos de colorante amarillo brillante sobre papel de pesaje. Vierta el polvo en un tubo de microcentrifugado de 8 mililitros y cierre firmemente la tapa.

A continuación, para preparar los tubos de etanol, pipetee un mililitro de etanol al 100 % en tubos microcentrífugos de 15 mililitros. Rotule los tubos, tápelos y guarde los tubos de etanol para completar el ensayo de aseo. Incluya también al menos una muestra en blanco con solo un mililitro de etanol sin mosca, para controles negativos.

Arme cada cámara de aseo atornillando la placa superior deslizante con los orificios más pequeños, pero dejando la placa inferior con los orificios más grandes retirada para la adición del polvo. Coloque cada cámara de aseo necesaria plana sobre una mesa con la cara superior hacia abajo. Cargue cinco miligramos de alícuota de colorante amarillo brillante en cada cámara, golpeando el tubo contra la superficie de la cámara sobre el pozo deseado.

Toque la cámara contra la mesa para asegurarse de que todo el polvo caiga a través de la malla hasta la parte superior de la placa. Luego atornille la placa inferior a cada cámara, de modo que los extremos más anchos de las aberturas cónicas queden orientados hacia afuera y los orificios no queden sobre los pozos. Asegure firmemente la placa inferior para que no se deslice ni libere el colorante.

Dé la vuelta a la cámara y golpéela suavemente contra la mesa varias veces para que el polvo atraviese la malla y caiga sobre la placa inferior. Deslice la placa superior de la cámara hasta la posición abierta, de modo que los orificios pequeños se alineen con los 15 pozos, permitiendo así la introducción de moscas en los pozos individuales. Introduzca una mosca en el aspirador de boca succionando suavemente por uno de los extremos del aspirador, como si se usara una pajilla.

Deposite las moscas soplando suavemente y dirigiendo la abertura hacia el objetivo. Después de cargar un pozo, deslice la placa superior de modo que la mosca quede atrapada en la cámara y coloque cinta adhesiva sobre la abertura del pozo durante la carga de la cámara de pozos, para evitar la huida de la mosca mientras se cargan los otros pozos. Si se aspiran varias moscas a un solo pozo, deje esa abertura descubierta hasta que solo quede una mosca.

Después de llenar todos los pozos necesarios con moscas, gire la cámara de modo que la placa inferior quede hacia arriba y el polvo pueda recubrir las moscas al caer a través de la malla. Asegure firmemente las placas superior e inferior apretando los tornillos y vortexee la cámara durante cuatro segundos para espolvorear las moscas. Golpee la cámara, con la placa superior hacia abajo, contra la mesa dos veces, de forma que el colorante caiga al otro lado.

Luego, invierta la cámara con la placa superior hacia arriba y golpee la cámara dos veces para asegurar que el colorante se asiente en el fondo de la cámara inferior, lejos de la mosca, que se mantiene en la cámara superior. Para las moscas de control, a las que no se les permite asearse, proceda inmediatamente a la preparación de la muestra. Coloque la cámara horizontalmente sobre la mesa o encimera, con la placa superior hacia arriba, durante 30 minutos para permitir que las moscas se aseen.

Coloque la cámara en un lugar libre de ruido y vibraciones, para mantener constante el entorno en todos los experimentos de aseo. Manteniendo la cámara nivelada con la placa superior hacia arriba, desatornille suavemente la placa inferior y retírela de la cámara, teniendo cuidado de no perder ningún colorante. Coloque la cámara sobre una almohadilla de CO₂ con flujo de aire bajo hasta que las moscas queden anestesiadas.

Desatornille la placa superior de la cámara, use cuidadosamente pinzas para agarrar una pata y retirar una mosca polvoreada de cada cámara, depositándola en un tubo microcentrífuga de 1.5 mililitros que contenga etanol. Una vez que cada tubo microcentrífuga contenga una mosca, cierre la tapa e invierta los tubos tres veces para agitar y mezclar la solución de colorante y etanol. Incube los tubos que contienen etanol y moscas durante cinco horas a temperatura ambiente para asegurar la eliminación completa del colorante de la mosca hacia la solución.

Después de cinco horas, agite brevemente cada tubo mediante vórtex durante dos segundos para asegurar la eliminación de los colorantes de las moscas. Aliquote 50 microlitros del tubo experimental de 1,5 mililitros en un pocillo de una placa de 96 pocillos, anotando la ubicación de cada muestra en la placa. Añada 200 microlitros de etanol para diluir la muestra cinco veces y así evitar efectos de sellado debidos a moscas excesivamente espolvoreadas o defectos grandes de aseo.

Utilice un lector de placas para analizar cada muestra a 397 nanómetros. Registre la muestra mediante el lector de placas y guarde la hoja de cálculo con las muestras registradas en la placa. Utilizamos este método para estudiar DopR comparando el desempeño en el aseo de un hipomorfo fuerte y de mutantes nulos de DopR con una cepa silvestre.

Los mutantes de DopR retuvieron significativamente más colorante que sus contrapartes silvestres o rescatadas, lo que indica que los mutantes de DopR fueron menos eficientes en el comportamiento de aseo. En un experimento paralelo con moscas Rutabaga, los mutantes mostraron niveles más altos de acumulación de colorante que los mutantes de DopR, lo que sugiere un papel importante de DopR en el comportamiento de aseo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular moscas para ensayos conductuales y también de cómo medir el comportamiento de aseo.