Name: Producción de eliminación rápida en hongos vía Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprende a generar mutantes de deleción génica precisos en hongos mediante el método OSCAR y transformación mediada por Agrobacterium. Esta técnica acelera la construcción de plásmidos para estudios de genética funcional.

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Los autores agradecen a los siguientes estudiantes de pregrado y secundaria su trabajo para generar mutantes OSCAR en Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie y Manny Hernández Ashly Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, María Belding, Christy Burre, Daniel O&#39;Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre&#39;Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le y Angel Pham.

1. Diseño del cebador para la amplificación por PCR de los flancos génicos <ol><li> Descargar a un archivo de procesamiento de texto la región genómica del gen de interés (GOI) incluyendo el marco de lectura abierto (ORF) y al menos 2 kb que flanquean el gen en cada lado de FungiDB u otro recurso de datos genómicos. </li><li> Resalte el ORF destinado a la deleción y los codones de inicio y fin de la etiqueta. </li><li> Identificar y resaltar ORFs adyacentes dentro de la secuencia descargada. </li><li> Utilice el extremo 5 &#39;de 2 kb del ORF de GOI y la herramienta de diseño de cebadores (ver Lista de Materiales) para diseñar el par de cebadores de PCR O1 y O2 para generar un producto de tamaño mínimo de 1 kb. Tenga cuidado de no impactar los ORF adyacentes. <ol><li> Pegue el flanco de 2 kb 5 &#39;en la ventana &quot;Sequence Entry&quot;. Haga clic en &quot;Mostrar parámetros personalizados&quot; cuadro. Introduzca los siguientes parámetros de diseño personalizados: primer TM 58 (min), 60 (opt) y 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) y 60 (máximo); Tamaño del cebador 22 (min), 24 (opt) y 26(Máx.); Amplicón Tamaño 1250 (min), 1500 (opt) y 2000 (máximo). </li><li> Elija el resultado que coloca el cebador inverso (O2) más cercano al ORF. Capture una captura de pantalla de los ensayos y copie y pegue las secuencias de primer en el documento de procesamiento de texto. </li><li> Repita el proceso para el flanco 3 &#39;para generar los cebadores O3 y O4, esta vez elija el resultado colocando el cebador directo (O3) más cercano al ORF objetivo. </li></ol></li><li> Añadir sitios de unión apropiados a los extremos 5 &#39;de los cebadores 1 a 4 (véase la Tabla 1 ). </li><li> También diseñe y ordene cebadores específicos de ORF que se utilizarán para confirmar la eliminación en la sección 4 a continuación. Los parámetros deben ser los mismos que en el paso 1.4.1, excepto el uso de Amplicon tamaño 500 (min), 750 (opt) y 1000 (máximo) de ajuste de la longitud de ORF si es necesario. Finalmente, para la confirmación de recombinantes homólogos, genere cebadores 5 &#39;hacia fuera y 3&#39; hacia fuera descubiertos fuera de los flancos dentro del cromosoma. Estos cebadores &quot;fuera&quot; se utilizarán conHigR (210) e hygF (850), respectivamente ( Fig. 2 ). </li><li> Primeros de pedido. </li></ol> 2. Producción de OSCAR Constructs <ol><li> Utilizando una Taq de alta fidelidad, se realizan dos reacciones, una para los flancos 5 &#39;y 3&#39;, usando cebadores (100 μM) O1 y O2 en una reacción y los cebadores O3 y O4 en la segunda. La mezcla de reacción contiene lo siguiente: 29,5 mu l de agua destilada estéril (SDW), 5 mu l de tampón de PCR 10x LA, 8 mu l de mezcla de dNTP 2,5 mM, 5 mu L de MgCl _ { 2 } 25 mM, 1 mu l de plantilla (50 ng / (0,5 μl de Primer O3 y 0,5 μL de Primer O4 para el flanco 3 &#39;). Las condiciones de reacción de uso son las siguientes: 94ºC durante 1 min, luego 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 min, luego pasos finales de 72 ° C durante 5 min y luego se mantienen indefinidamente a 10 ° C. </li><li> Ejecutar 0,8%Agarosa 1x electroforesis en gel TAE (40 mM Tris acetato pH 8,3, EDTA 1 mM) durante aproximadamente 125 Vh en un aparato de minigel estándar para determinar el tamaño del producto y la concentración relativa. Post mancha el gel con mancha de non-ethidium de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Visualice en un iluminador UV. </li><li> Si los productos de los flancos 5 &#39;y 3&#39; están en una concentración aproximadamente igual, combinarlos y utilizar un kit de columna de afinidad (o precipitación con PEG 90 μL de productos de PCR combinados, 240 μl de tampón TE pH 7,5, 160 μL de 30% de polietilenglicol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) para co-purificar los productos de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante. Si no son de igual concentración, combinar todo el producto de baja concentración con una cantidad estimada igual de producto de la reacción de rendimiento más alto. </li><li> Utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de ADN purificado. </li><li> Realizar la reacción de BP mezclando lo siguiente: 1 μl de 60 ng / μL de pOSCAR, 2 μl de 60 ng /ΜL de pA-Hyg-OSCAR, 1 μl de flancos combinados de 60 ng / μl, 1 μl de clonasa. Incubar durante 16 h a 25 ° C. Terminar la reacción añadiendo 0,5 μL de proteinasa K e incubar durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Transformar alta competencia E. Coli . Tanto las células competentes comercialmente disponibles como las células competentes de DH5α CaCl2 hechas en casa se usaron satisfactoriamente como receptores como se describe en las instrucciones del fabricante. Placa de bajo contenido de sodio (0,5 g / L de NaCl) LB que contiene 100 μg / ml de espectinomicina (Spec). </li><li> Identificar la construcción correcta mediante la realización de minipreps de ADN 10 de las colonias generadas anteriormente. Realizar una doble digestión con Hin dIII y Kpn I de la siguiente manera: pipetear 5 μL de ADN, 2 U de cada enzima, 2 μl de tampón 10x apropiado con SDW hasta un volumen total de 20 μL. Esto libera el inserto (aproximadamente 4,5 kb con los flancos del gen de 1,5 kb) del vector (aproximadamente 7 kb) y corta cualquier sitio enFlancos que pueden dar tamaños de banda predecibles. </li><li> Secuencia 11 seleccionan clones que muestran un patrón de bandas apropiado. </li></ol> 3. Agrobacterium tumefaciens Transformación mediada (ATMT) de los hongos <ol><li> Transformar Agrobacterium tumefaciens cepa AGL1 con OSCAR deleción construir 12 . </li><li> Transformar el hongo con AGL1 que contiene el plásmido de deleción GOI OSCAR. Para ello, realice los siguientes pasos: <ol><li> Preparar una suspensión de esporas fúngicas con agua estéril a 2 x 10 6 esporas / mL. Cuantificar las esporas en un hemocitómetro o en un contador automático de células. Coloque 500 μl de esto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta configuración es para 4 placas de transformación. </li><li> Utilizar un bucle desechable estéril azul para añadir una gota fácilmente visible (debe cubrir aproximadamente el 20% del diámetro del bucle) del plásmido de deleción que contiene AGL1 a partir del medio LB-Spec 100 de 2-3 días de edad (véase MPara la composición) que contienen las placas y mezclar en la suspensión de la espora. Vórtice hasta que las células bacterianas estén bien dispersas (aproximadamente 5 min de velocidad media). </li><li> Pipetear 100 μl de la suspensión de conidia-Agro sobre el centro de un filtro de membrana de celulosa colocado en cada una de las cuatro placas de Petri de 6 cm que contienen el medio de co-cultivo 12 . </li><li> Separe la suspensión con perlas de vidrio estériles (aproximadamente 4) para cubrir toda la superficie del filtro de membrana. Alternativamente, esparcir la suspensión con una herramienta de esparcido tradicional. Deje que el filtro de membrana se seque en una campana durante aproximadamente 10 min, envuelva con una película de parafina. Repita los pasos 3.2.2 y 3.2.3 para configurar múltiples transformaciones. </li><li> Incubar la placa durante 2 días a temperatura ambiente, invertida. </li><li> Transferir el filtro de membrana a un medio de selección de Aspergillus de 6 cm que contiene higromicina B (Hyg) 150 μg / ml, cefotaxima 200 mM y 100 μg / mlMoxalactama. Incubar a temperatura ambiente durante 5-7 días antes de aislar Hyg colonias resistentes. </li><li> Con palillos de dientes estériles, transfiera los transformantes putativos a placas de 6 cm de Agar de Dextrosa de Patata (PDA) que contienen 150 μg / mL de Hyg, 100 μg / mL de kanamicina. </li></ol></li></ol> 4. Identificación de mutantes por PCR <ol><li> Extraer el ADN para la PCR de transformantes por termólisis [ 13] . <ol><li> Una vez que los transformantes forman colonias en el PDA de la etapa 3.2.7, utilice un palillo estéril para transferir una pequeña cantidad (2 mm x 2 mm) de micelio o células de levadura de la colonia a 100 μl de solución de lisis (fosfato sódico 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 5%) en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Incubar la mezcla a 85-90 ° C durante 20-30 min. Almacenar el extracto crudo que contiene ADN genómico a -20 ° C hasta su uso en el paso 4.2. </li></ol></li><li> Llevar a cabo 4 reacciones de PCR por transformante, una cada dEtect recombinación homóloga de los flancos 5 &#39;y 3&#39;, respectivamente, uno para el marcador seleccionable (higromicina fosfotransferasa en este caso) y uno para el GOI ORF. NOTA: En general, utilizamos Taq de baja fidelidad de bajo costo para estas reacciones. Las condiciones de reacción son las descritas en el paso 2.1 anterior y contienen SDW 20 μl, tampón Taq 10x 2,5 μl, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, Taq 14 casero, 0,5 μL, Primer A (100 μM) ) 0,5 mu L, Plantilla 0,5 mu l. Pueden utilizarse igualmente cantidades de cebadores de concentración más baja (10 μM). </li><li> Ejecutar un gel de agarosa ( por ejemplo, 0,8%) de los productos de PCR. Los mutantes de eliminación producirán la banda Hyg pero no un producto ORF. Los integrantes ectópicos mostrarán ambas bandas. El tipo salvaje producirá solamente la banda ORF. </li><li> Almacenar permanentemente mutantes de deleción (y un transformante ectópico o dos para los controles) para uso futuro. NOTA: El 15% de glicerol se utiliza para sRasgó nuestras cepas a largo plazo a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+construction+of+Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids+%28OSCAR%29%2C+an+efficient+and+robust+tool+for+ATMT+based+gene+deletion+construction+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi.</a> Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Klosterman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+yields+insights+into+niche+adaptation+of+plant+vascular+wilt+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens.</a> PLoS Pathog. 7 (7), (2011).</li>
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<li>Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetic+Screen+for+Pathogenicity+Genes+in+the+Hemibiotrophic+Fungus+Colletotrichum+higginsianum+Identifies+the+Plasma+Membrane+Proton+Pump+Pma2+Required+for+Host+Penetration%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration.</a> PloS One. 10 (5), e0125960(2015).</li>
<li>Chettri, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Regulation+of+dothistromin+toxin+biosyn+by+the+pine+needle+pathogen+Dothistroma+septosporum%3A+a++presented+in+the+partial+fulfilment+of+the+requirements+for+the+degree+of+Doctor+of+Philosophy+%28%29+in+Genetics+at+Massey+University%2C+Manawatu%2C+New+Zealand%22">Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand </a>. , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).</li>
<li>Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-prep+in+ten+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mini-prep in ten minutes.</a> Biotechniques. 8 (2), 172(1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+SciUSA%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhang%2C+CH+%22Agrobacterium+Protocols%22">Agrobacterium Protocols</a>. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+genomic+DNA+extraction+suitable+for+analysis+of+bulk+fungal+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains.</a> Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).</li>
<li>Pluthero, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+high-activity+Taq+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).</li>
<li>McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCluskey%2C+K+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La construcción en un solo paso de los plásmidos preparados con recombinación de Agrobacterium (OSCAR) se ha empleado con éxito con un número cada vez mayor de hongos Ascomycota. El método también debe ser fácilmente aplicable a Basidiomycota y especies de otros phylas de hongos (con promotores apropiados que conducen genes marcadores seleccionables), suponiendo que la transformación mediada por Agrobacterium y la recombinación homóloga son posibles. Se han generado vectores marcadore...

La disección genética es una poderosa metodología para determinar la importancia funcional de individuos o combinaciones de genes. Un enfoque estándar para comprender el papel de genes específicos es la producción de mutantes de un solo gen inalterados en cualquier otro gen. El enfoque más potente y menos potencialmente confuso es la supresión completa y precisa del marco de lectura abierto de un gen de interés (GOI ORF) sin dañar ninguna otra función génica. Debido a que los enfoques de ligación estándar para la generación de plásmidos de deleción requieren múltiples etapas, el racional para OSCAR 1 era producir un enfoque in vitro más rápido. La figura 1 representa el proceso de montaje en el enfoque de OSCAR. El método descrito aquí tiene la ventaja de combinar la construcción rápida de vectores individuales de deleción de genes en una única reacción de múltiples partes en combinación con el posterior transfo mediado por Agrobacterium tumefaciensRencia (ATMT). OSCAR es muy rápido y se compara bien con otras estrategias como el uso del ensamblaje Gibson en levadura 2 . El método OSCAR se ha utilizado con éxito con varias especies de hongos Ascomycota. Estas especies incluyen: Fusarium verticillioides (inédito), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 y Dothistroma septosporum 9 y Sarocladium zeae (inédito) . Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el método que incluye diseño de cebador, amplificación por PCR de flanco, reacción de OSCAR BP, confirmación de estructura de construcción de deleción, transformaciónDe Agrobacterium con el constructo seguido de la transferencia basada en ATMT de la construcción de deleción en las células fúngicas y finalmente diferenciando mutantes de deleción de hongos de aquellos con construcciones de deleción ectopicamente integradas.

<table><tbody><tr>Base de datos <td>FungiDB</td><td></td><td></td><td>/ http://fungidb.org/fungidb/</td></tr> <tr><td>IDT PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer diseño de software en línea/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>Microsoft Word</td><td></td><td></td><td>Manipulación de archivos de secuencia</td></tr><tr><td>Low Na LB Spec 100 medio</td><td></td><td></td><td>E. coli selección de transformantes, composición: 1% triptona, 0,05% NaCl, 0,5% extracto de levadura, 1,5% agar si es para medio sólido</td></tr> Medio <tr><td>de cocultivo</td><td></td><td></td><td>Inducción de transformación ATMT (Referencia 12)</td></tr><tr><td>Aspergillus medio mínimo con higromicina</td><td></td><td></td><td>Selección de transformadores fúngicos</td></tr><tr><td>Medio PDA</td><td>Acumedia</td><td>7149A</td><td>Tubos inclinados de</td></tr> <tr><td>esporas simplesMedio PDA-Hyg-Kan</td><td></td><td></td><td>Aislamiento de ransformante fúngico, PDA que contiene 150 &mu; g/mL de higromicina B y 100 &mu; g/mL Kanamicina</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>Genlantis</td><td>C400100</td><td>Esparcimiento de placas</td></tr><tr><td>Filtros de nitrocelulosa (47 mm)</td><td>Fisher</td><td>09-719-555</td><td>Co-cultivo para ATMT</td></tr><tr><td>Varios tubos de centífugos</td><td></td><td></td><td>preparaciones múltiples</td></tr><tr><td>Placas de Petri (varios)</td><td></td><td></td><td>Cultivo de bacterias y hongos</td></tr><tr><td>pA-Hyg OSCAR</td><td>Addgene</td><td>29640</td><td>Vector marcador seleccionable</td></tr><tr><td>pOSCAR</td><td>Addgene</td><td>29639</td><td>Vector de ensamblaje</td></tr><tr><td>DH5&#945; Un disparo competente E. coli </células ></td><td>em Life Technologies&nbsp;</td><td>12297-016</td><td>Transformación de la reacción de BP</td></tr><tr><td>ccdB supervivencia Células de E. coli</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A10460</td><td>Mantenimiento de pOSCAR</td></tr><tr><td>Varillas de transferencia de madera</td><td>Rayado de colonias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palillos de dientes</td><td>Selección de colonias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td>Peletización Bacterias, etc.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> preparatoria <td>Recolección de esporas fúngicas</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de disección <td>Individual aislamiento de esporas</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Cálculo</td><td></td><td></td> de <td>suspensión de esporas</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> compuesto <td>Hemocitómetro Recuento de células</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR gen flanco purificación de productos</td></tr><tr><td>TaKaRa LA Taq&nbsp;</td><td>Takara Bio USA</td><td>RR002A</td><td>Hi Fidelity taq polimerasa para la generación de flanco OSCAR</td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg-5</td><td></td></tr><tr><td>Espectinomicina</td><td>Sigma</td><td>22189-32-8</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxima</td><td>TCI América</td><td>C2224</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td></td><td>11815032</td><td></td></tr><tr><td>Moxalactam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43963</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>&nbsp; Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>Geles de agarosa post-tinción</td></tr><tr><td>Qiagen QIAquick PCR Kit (Cat. Nº 28104)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OneShot_ Mach1TM T1R o One Shot_ OmniMAX&trade; 2 T1R de Invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific C862003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonasa II Mezcla de enzimas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11789020</td><td>Se utiliza para ensamblar la construcción de deleción en pOSAR</td></tr></tbody></table>

producción de eliminación rápida en hongos vía<em&gt; agrobacterium</em&gt; mediated transformation of oscar deletion constructs

Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

La deleción precisa de los genes de interés, dejando el resto del genoma sin cambios, proporciona el producto ideal para determinar la función de ese gen particular en el organismo vivo. En este protocolo se describe el método OSCAR de construcción de plásmidos de deleción precisa y rápida. OSCAR se basa en el sistema de clonación en el que se lleva a cabo una única reacción de recombinasa que contiene los flancos 5 &#39;y 3&#39; amplificados por PCR purificados del gen de interés y dos plásmidos, pA-Hyg OSCAR (el vector marcador) y pOSCAR vector). La confirmación del vector de deleción correctamente ensamblado se lleva a cabo por mapeo de digestión de restricción seguido por secuenciación. Agrobacterium tumefaciens se utiliza entonces para mediar la introducción de la construcción de deleción en esporas de hongos (denominado ATMT). Por último, se describe un ensayo de PCR para determinar si la construcción de deleción se integra mediante recombinación homóloga o no homóloga, indicando deleción de gen oEctópica, respectivamente. Este enfoque se ha utilizado con éxito para la deleción de numerosos genes en Verticillium dahliae y en Fusarium verticillioides entre otras especies.

El método OSCAR, en una única reacción, genera un plásmido que contiene los flancos del gen diana que se ha de deletar rodeando el casete marcador seleccionable. La producción de construcciones de deleción usando OSCAR es muy eficiente. Sin embargo, el sistema puede producir construcciones parciales que contienen algunos pero no todos los tres fragmentos (los dos flancos del gen y el marcador seleccionable). Generalmente, la mayoría de los transformantes de E. coli contienen la ...

Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.

Producción de eliminación rápida en hongos vía<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

Precise deletion of gene(s) of interest, while leaving the rest of the genome unchanged, provides the ideal product to determine that particular ...

El objetivo general de este procedimiento es generar mutantes con deleciones génicas precisas en hongos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en genética funcional de hongos, como qué papel juega un gen particular de interés en la capacidad de un hongo para causar enfermedad. La ventaja principal de esta técnica es que permite la construcción muy rápida de plásmidos para generar deleciones precisas.Este método puede proporcionar información sobre cualquier hongo que tenga un sistema eficaz de recombinación homóloga. También podría aplicarse potencialmente a otros sistemas, como células de protistas o de vermiculita. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando desarrollamos el sistema DelsGate, que está relacionado con Oscar, pero se utiliza para la transformación de protoplastos en lugar de mediante agrobacterium.La demostración visual de este método es fundamental, ya que existen varios pasos optimizados o no intuitivos. El procedimiento será demostrado por Nicole Crenshaw, una técnica de mi laboratorio. Esta estrategia para diseñar cebadores requiere la región genómica del gen de interés que incluye el marco de lectura abierto y al menos dos kilobases flanqueando el gen en cada lado, en un archivo de procesamiento de texto.Comience resaltando el marco de lectura abierto destinado a eliminarse y etiquete el codón de inicio y el codón de parada. Identifique y resalte los marcos de lectura abiertos adyacentes dentro de la secuencia descargada. A continuación, utilice una herramienta de diseño de cebadores para diseñar cebadores de PCR para los extremos cinco primas del marco de lectura abierta del gen de interés.Utilice los dos kilobases del extremo cinco prime del marco de lectura abierta del gen de interés para diseñar el par de cebadores de PCR O1 y O2, con el fin de generar un producto de tamaño mínimo de un kilobase. Elija el resultado que coloque el cebador inverso O2 más cercano al marco de lectura abierta. Asegúrese de que el marco de lectura abierta adyacente no se vea afectado.Capture una captura de pantalla de los ensayos y copie y pegue las secuencias de los cebadores en el documento de procesamiento de textos. Después de repetir el proceso para la región flanqueante 3' a fin de generar los cebadores O3 y O4, agregue sitios de unión apropiados a los extremos 5' de los cuatro cebadores. Por último, diseñe cebadores que se utilizarán para confirmar la eliminación y la recombinación homóloga, siguiendo las instrucciones del protocolo escrito.Comience este procedimiento preparando dos reacciones de PCR: una para el extremo cinco prima y otra para el extremo tres prima. Añada lo siguiente a ambas mezclas de reacción: 29,5 microlitros de agua destilada estéril, cinco microlitros de tampón 10x para PCR LA, ocho microlitros de mezcla de dNTP 2,5 milimolar, cinco microlitros de cloruro de magnesio 25 milimolar, un microlitro de molde y 0,5 microlitros de Taq de alta fidelidad. A la reacción para el extremo cinco prima, añada 0,5 microlitros del cebador O1 y 0,5 microlitros del cebador O2. A la reacción para el extremo tres prima, añada 0,5 microlitros del cebador O3 y 0,5 microlitros del cebador O4. Realice la PCR con las siguientes condiciones de reacción: 94 grados Celsius durante un minuto, seguido de 30 ciclos de 94 grados Celsius durante 30 segundos, 60 grados Celsius durante 30 segundos y 72 grados Celsius durante dos minutos, y un paso final de 72 grados Celsius durante cinco minutos antes de mantener indefinidamente a 10 grados Celsius.Para determinar el tamaño del producto y la concentración relativa, realice electroforesis sobre los productos de PCR en un gel de agarosa al 0,8 % de TLE 1x durante aproximadamente 125 voltios-hora en un equipo estándar para geles mini. Posteriormente, tiña el gel con un colorante no basado en bromuro de etidio según las instrucciones del fabricante y visualice en un iluminador de luz ultravioleta. Si los extremos cinco-prima y tres-prima se encuentran en concentraciones aproximadamente iguales, combínelos.Si no tienen la misma concentración, combine el producto de baja concentración con una cantidad estimada igual del producto proveniente de la reacción de mayor rendimiento. Utilice un kit de columna infinity para co-purificar los productos de PCR según el protocolo del fabricante. A continuación, lleve a cabo la reacción BP clonase mezclando lo siguiente: un microlitro del vector de ensamblaje, dos microlitros del vector marcador, un microlitro de los flancos combinados y un microlitro de clonase.Incubar a 25 grados Celsius durante 16 horas. Detener la reacción añadiendo 0,5 microlitros de proteinasa K e incubar a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Después de transformar células de E.coli con la reacción BP y aislar el ADN según se describe en el protocolo del texto, identificar el constructo correcto realizando una doble digestión con HindIII y KpnI.Tras la identificación del constructo de deleción de OSCAR mediante digestión doble y secuenciación, el constructo se transforma en la cepa de agrobacterium tumefaciens AGL1. El siguiente paso consiste en transformar los hongos con AGL1 que contenga el constructo de deleción de OSCAR. Comience preparando una suspensión de esporas fúngicas con agua estéril a una concentración de 2 × 10⁶ esporas por mililitro.Después de diluir las esporas, coloque 500 microlitros de la suspensión de esporas fúngicas en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Utilice un asa desechable estéril azul para agregar una gota fácilmente visible del plásmido de eliminación que contiene AGL1 a la suspensión de esporas. Vortexee hasta que las células bacterianas estén bien dispersas.Coloque un filtro de membrana de celulosa en cada una de cuatro placas de Petri de seis centímetros que contengan medio de co-cultivo y luego agregue aproximadamente cuatro perlas de vidrio estériles por placa. Pipetee 100 microlitros de la suspensión de conidios de agra en el centro de cada filtro de membrana y extienda la suspensión con las perlas para cubrir toda la superficie del filtro. Después de retirar las perlas, deje secar los filtros de membrana en la campana durante aproximadamente diez minutos y luego envuelva las placas de Petri con película de parafina.Invierta los recipientes y incube durante dos días a temperatura ambiente. Después de dos días, transfiera cada filtro de membrana a una placa de medio selectivo asper gel de seis centímetros que contenga higromicina B y kanamicina. Incube a temperatura ambiente durante cinco a ocho días.Para aislar colonias resistentes a la higromicina, utilice palillos estériles para transferir los transformantes putativos a placas de agar de papa dextrosa de seis centímetros que contengan higromicina y kanamicina. Incube las placas a temperatura ambiente. Una vez que los transformantes formen colonias en las placas, use un palillo estéril para transferir una pequeña cantidad de micelio o células de levadura de la colonia a 100 microlitros de solución de lisis en un tubo de microcentrífuga.Incube la mezcla a 85-90 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. Almacene el extracto crudo que contiene ADN genómico a menos 20 grados Celsius hasta que esté listo para realizar la PCR. Para identificar mutantes por deleción, primero realice una PCR para detectar el marco de lectura abierta del gen de interés y el marcador seleccionable para cada transformante.Utilice las mismas condiciones de reacción para la producción de los constructos OSCAR. Después del aislamiento de esporas individuales y de la lisis térmica, repita la PCR del marco de lectura abierto y de la higromicina, así como la PCR para detectar la recombinación homóloga de las regiones flanqueantes cinco prima y tres prima. Posteriormente, realice una electroforesis en gel de agarosa con los productos de la PCR.El método OSCAR genera un plásmido que contiene el gen del marcador seleccionable, rodeado por las secuencias flanqueantes del gen diana que se desea eliminar, que en este ejemplo es un gen de Verticillium dahliae. Cuando se digiere con dos enzimas, la liberación de un inserto de 4.247 pares de bases en este caso confirma la estructura correcta del plásmido en todas las bandas, excepto en las bandas cinco y 11. Se utiliza un enfoque de PCR para confirmar la eliminación.Este ejemplo muestra el análisis de cinco transformantes de *Fusarium verticillioides*. En el gel superior, las calles dos a seis corresponden a las amplificaciones del extremo cinco primos, y las calles siete a once corresponden a las amplificaciones de los marcos de lectura abiertos. En el gel inferior, las calles dos a seis corresponden a las amplificaciones del gen marcador seleccionable, y las calles siete a once corresponden a las amplificaciones del extremo tres primos.La presencia de bandas en las amplificaciones del extremo cinco prima, del extremo tres prima y del gen marcador seleccionable, y la ausencia de bandas en la amplificación del marco de lectura abierto, confirman que los clones 1131, 1132 y 1133 son transformantes de deleción. La presencia de bandas en las amplificaciones del marco de lectura abierto y del gen marcador seleccionable, y la ausencia de bandas en las amplificaciones del extremo cinco prima y del extremo tres prima, indican que los clones 1134 y 1135 son transformantes alérgicos. Las deleciones génicas también pueden confirmarse mediante hibridación Southern.Una vez dominada, esta técnica puede generar plásmidos de deleción Oscar listos para transformaciones fúngicas en dos días, sin incluir el tiempo de secuenciación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar el uso de polimerasas Taq de alta fidelidad y asegurarse de que los genes adyacentes no se verán afectados. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para analizar los fenotipos mutantes con el fin de responder preguntas adicionales, como si un gen es importante en procesos particulares, tales como la sensibilidad o resistencia a fármacos.No olvide que trabajar con organismos vivos, como la bacteria *Agrobacterium* y los hongos, puede ser peligroso, especialmente si una persona tiene el sistema inmunológico comprometido. Siempre se deben tomar precauciones, como lavarse las manos después de manipularlos, durante este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Genética

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