Name: Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprende a rastrear en tiempo real la rotación de microesferas unidas a motores flagelares en células bacterianas vivas. Esta técnica de seguimiento fotomultiplicador permite estudiar la mecánica molecular con alta precisión en E. coli.

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Los autores agradecen a Howard Berg por el regalo del microscopio/fotomultiplicador de seguimiento de perlas y a la Estación Experimental de Ingeniería de Texas A&M por los fondos.

1. Preparación de la célula <ol><li> Crecer cultivos de una noche de la cepa deseada que lleva el alelo pegajosa fliC 15,22 en triptona Broth (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguido de la inoculación a 1: 100 dilución en 10 ml de TB fresco. Mantener el cultivo a 33 ° C en un incubador con agitación hasta una DO600 = 0,5. </li><li> Sedimentar las células a 1500 x g durante 5-7 min y re-dispersar el sedimento vigorosamente en 10 ml de tampón de motilidad filtro esterilizado (MB; tampón fosfato 10 mM: NaCl 0,05 a 0,06 M, 10 -4 M EDTA, 1 mM de metionina, pH 7,0). </li><li> Repita el paso 1.2 dos veces más y volver a dispersar el sedimento final en 1 ml MB. </li><li> Cizallar la suspensión mediante el paso de ida y vuelta ~ 75 veces entre dos jeringas con 21 a 23 adaptadores de calibre conectados por un tubo de polietileno (7 - 12 cm de largo, 0,58 mm de diámetro interno). Limitar el tiempo total para cizallar a 30 - 45 s. </li><li> Centrifugar las células cortadas a 1.500 xg durante 5-7 minutos y volver a dispersar elprecipitado en 100 - 500 l de MB. </li></ol> 2. Preparación de los portaobjetos <ol><li> Preparar una cámara de imágenes intercalando dos cintas adhesivas de doble cara entre un cubre y un portaobjetos de microscopio. Para los ensayos de quimiotaxis, emplear cualquier cámara de microfluidos que permite el intercambio de MB y estimulantes químicos. </li><li> Añadir 0,01% de solución de poli-L-lisina en la cámara y después de 5 min enjuagar suavemente las superficies con MB (80 - 100 L). </li><li> Añadir 40 l de la suspensión celular en la cámara y permitir el tiempo suficiente para la unión a la superficie de vidrio (7-8 min). Flujo de salida células unstuck mediante la adición de 100 l MB en un lado de la cámara, mientras que absorbe la solución con un papel de filtro desde el otro lado. </li><li> Añadir 10 - 15 l de perlas de látex en la cámara y permitir que las perlas de tiempo adecuado para asentarse y unirse a las células (7 - 8 min). Enjuague suavemente con 100 l de MB, tal como se describe en el paso 2.3, para eliminar los granos despegarse. Use una variedad de grano-sizes para los experimentos tan largos como un buen contraste está disponible. </li></ol> 3. Seguimiento del grano <ol><li> Coloque la muestra en una platina del microscopio y escanear la superficie de los granos unidos a motores. Utilice un objetivo de 40X fase para hacer observaciones a pesar de la microscopía de fase no es necesario. Alternativamente, emplear imágenes de campo brillante, siempre que suficiente contraste se mantiene distinguir claramente un cordón brillante sobre un fondo oscuro. </li><li> Una vez que una perla ha sido seleccionado, mover la etapa de posicionar lateralmente el cordón en una esquina predeterminado como se muestra en la Figura 1B. perlas de posición en la misma esquina para asegurar que la dirección de rotación de la perla se conoce correctamente. La trayectoria del grano ideal es aproximadamente circular, pero las trayectorias elípticas son admisibles. </li><li> Mantener la frecuencia de muestreo superior al doble de la frecuencia de rotación del motor para evitar los errores asociados con aliasing. En este trabajo, utilizar un motor que estaba girando a50 Hz y la muestra en las frecuencias que eran 10 veces más alta (500 Hz), para obtener una señal lisa. </li></ol> Análisis 4. Datos <ol><li> Centro y escalar las tensiones de salida del PMT y elipticidad correcta en las trayectorias con transformaciones afines si es necesario 23. Use un análisis de espectro de potencia para determinar las tasas de rotación 17. </li><li> Determinar ángulos polares, θ (t) = atan (Y (t) / x (t)). Determinar las variaciones en las velocidades del motor y el cambio en el tiempo mediante el cálculo de ω <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Emplear un filtro de mediana para suavizar los datos de velocidad del motor. Una ventana de filtro más de dos rotaciones completas se recomienda 23,24. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
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<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con el fin de facilitar el atado de talones de seguimiento y correcta estimación de los pares de motor, la siguiente información debe ser revisada. Al realizar estas mediciones con células flageladas, esquila es un paso crítico. Shearing reduce el filamento flagelar a un simple trozo, garantizando de este modo que la carga viscosa en el motor se debe principalmente a la perla y se puede estimar dentro del 10% de error 16. Shearing también mejora las posibilidades de encontrar trayectorias circulares con excen...

motores flagelares permiten a las células a nadar girando filamentos helicoidales extracelulares. La cantidad de par de torsión que el motor puede generar para una longitud dada del flagelo (es decir, la carga viscosa) determina las velocidades de natación. Por otro lado, su capacidad para cambiar el sentido de giro controla la migración de células en respuesta a productos químicos, un proceso conocido como la quimiotaxis. La quimiotaxis y la motilidad ser factores de virulencia 1-3, motores flagelares han sido bien caracterizado en los años 4. La evidencia creciente sugiere ahora que el motor actúa como un MechanoSensor - detecta mecánicamente la presencia de sustratos sólidos 5,6. Esta capacidad ayuda a probable en el desencadenamiento de la colonización de la superficie y las infecciones de 5,7. Como resultado, los mecanismos por los que el motor sentidos superficies e iniciados de señalización son de importancia 8,9. El motor flagelar se puede estudiar fácilmente por la inmovilización del flagellum a un sustrato y la observación de la rotación de la célula. Dicha inmovilización se logró por primera vez por Silverman y Simon, que trabajó con un mutante polyhook en E. coli y ganchos conectados correctamente a sustratos de vidrio con anticuerpos anti-gancho 10. El ensayo de células tethered permitió a los investigadores estudiar las respuestas del motor-switch a una variedad de estímulos químicos. Por ejemplo, Segall y compañeros de trabajo estimularon células químicamente atados con la ayuda de pipetas iontoforéticos. Los cambios correspondientes en el sesgo de CW (la fracción de los motores giran las manecillas del reloj de tiempo, CW) les permitió medir la cinética de la adaptación en la red quimiotaxis 11,12. Si bien el ensayo de células tethered fue eficaz en el estudio de las respuestas de conmutación, sólo fue capaz de ofrecer una visión de la mecánica de motor en un intervalo limitado de cargas viscosos 13. Para superar este problema, Ryu y compañeros de trabajo conectado al ordenador, perlas de látex esféricas al filamento talones en las células pegadas a las superficies. Las perlas sea continuación, seguido utilizando interferometría de back-focal con trampas ópticas débiles 14. Al trabajar con los granos de diferentes tamaños, los investigadores pudieron estudiar el motor a través de una gama mucho más amplia de cargas. Este ensayo fue mejorada por Yuan y Berg, quien desarrolló una técnica de talones de seguimiento basado en fotomultiplicador combinado con iluminación láser de campo oscuro. Su método de seguimiento habilitado de nanobeads atados de oro que eran tan pequeña (~ 60 nm) que las resistencias externas viscosos eran más bajos en comparación con las resistencias internas viscosos a la rotación 15,16. Esto dio lugar a las mediciones de las velocidades máximas alcanzables en E. coli (~ 300 Hz). En V. Alginolyticus, ensayos de cuentas habilitadas similares mediciones de las velocidades de giro en cargas intermedias viscosos (~ 700 Hz) 17. Al permitir que las mediciones de las respuestas motoras sobre toda la gama posible de cargas viscosas (de carga cero a casi parada), el cordón-ensayos proporcionados en una importante herramienta de biofísico para entender la torque proceso de generación 18,19. Recientemente, hemos modificado el ensayo de Yuan-Berg incluir pinzas ópticas que nos permitieron aplicar estímulos mecánicos precisos para motores individuales 6. Usando esta técnica, hemos demostrado que la fuerza de los generadores que giran el motor son mechanosensors dinámicos - se remodelan en respuesta a los cambios en las cargas viscosas. Es posible que tal de detección de carga provoca la diferenciación celular en bacterias que pululan, aunque los mecanismos no están claros. También es probable que los motores flagelares en otras especies también son mechanosensitive 20, aunque se carece de evidencia directa. A continuación, se discute el enfoque basado en el fotomultiplicador (PMT) para el seguimiento de la rotación de cuentas de látex atados a los filamentos flagelares 15. En comparación con el seguimiento con cámaras ultrarrápidos, el fotomultiplicador-configuración es ventajosa debido a que es relativamente sencillo para realizar el seguimiento perlas individuales en tiempo real y más largo duraciones. Es particularmente útil en el estudio de la remodelación a largo tiempo en los complejos de motor flagelar debido a los estímulos del medio ambiente 21. A pesar de que los protocolos de detalle específicamente para E. coli, que pueden adaptarse fácilmente para el estudio de motores flagelares en otras especies.

<table><tbody><tr><td>Solución de poli-L-lisina (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Microesferas de perlas de polietileno</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 mL Jeringa Luer Slip Tip</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Adaptador Luer-Stub Intramedic calibre 23</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Fotomultiplicador Tubos</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Rango de respuesta espectral de 300 a 920 nm, longitud de onda máxima de 630 nm, tiempo de respuesta de 0,78 ns; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 ranuras de precisión de 1 mm</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 ranuras montadas en ángulo recto entre sí en tubos fotomultiplicadores</td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Se aceptan marcas alternativas. Osciloscopio Digital, Serie TBS 1000B, 2 Analógicos, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>Filtro LP/HP de 8 polos</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Se aceptan marcas alternativas. Se recomienda un rango de frecuencia de 0,1 Hz a 200 kHz. &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Microscopio Optiphot</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Se puede utilizar cualquier microscopio de fase vertical o invertida. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Divisor de haz cúbico</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

El papel de los motores flagelares en la motilidad y la quimiotaxis bacteriana es bien conocido. Descubrimientos recientes sugieren que los motores flagelares son capaces de remodelarse en respuesta a una variedad de estímulos ambientales y se encuentran entre los desencadenantes de la colonización de la superficie y las infecciones. Los mecanismos precisos por los cuales los motores se remodelan y promueven la adaptación celular probablemente dependan de los atributos motores clave. La técnica de seguimiento de cuentas basada en fotomultiplicadores que se presenta aquí permite una caracterización biofísica precisa de las funciones motoras, incluidas las adaptaciones en las velocidades del motor y la dinámica de los interruptores. Este enfoque ofrece la ventaja del seguimiento en tiempo real y la capacidad de sondear el comportamiento motor durante períodos prolongados. Los protocolos discutidos pueden extenderse fácilmente para estudiar los motores flagelares en una variedad de especies bacterianas.

La configuración fotomultiplicador se muestra en la Figura 1A. Es importante que los PMT tienen altas sensibilidades más de la gama de longitudes de onda dispersas por las perlas de interés. Los EGP empleadas aquí operan en los rangos visible e infrarrojo cercano, y fueron capaces de detectar la luz dispersada por bolas iluminadas por una fuente de luz halógena. Las condiciones de iluminación óptimas y tensiones de alimentación varían de una configuración a otra. Para la...

Hallazgos recientes sugieren que los motores flagelares bacterianos detectan una variedad de señales ambientales y se remodelan en respuesta. Se espera que los ensayos de perlas discutidos aquí ayuden a explicar el papel de la remodelación en la adaptación celular a los factores estresantes ambientales.

Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es medir la rotación de microesferas de sonda unidas a motores flagelares individuales en células bacterianas vivas. La técnica que describiremos ofrece la ventaja de realizar un seguimiento en tiempo real de las respuestas del motor y la capacidad de discriminar entre datos admisibles y no admisibles en tiempo real. Este enfoque nos está ayudando a responder preguntas clave en el campo de la mecanobiología y a descubrir la física subyacente al comportamiento de los motores moleculares.Aunque empleamos predominantemente estas técnicas para estudiar los motores flagelares en E.coli, estos protocolos pueden adaptarse fácilmente para estudiar motores en otras especies de bacterias flageladas. Incube cultivos nocturnos de la cepa deseada que lleve el alelo sticky fliC en TB. Al día siguiente, inocule 10 mililitros de TB fresco con una dilución 1:100. Incube el cultivo a 33 grados Celsius en un incubador con agitación hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros sea igual a 0,5.Centrifugar las células a 1500 × g durante cinco a siete minutos. Luego, redispersar vigorosamente el sedimento en 10 mililitros de tampón de movilidad esterilizado por filtración. Repetir la centrifugación y la resuspensión dos veces más.Redispersar el pellet final en un mililitro de MB. Homogeneizar la suspensión pasándola aproximadamente 75 veces de ida y vuelta entre dos jeringas con adaptadores de calibre 21 a 23 conectados mediante tubo de polietileno. Limitar el tiempo total de homogeneización a entre 30 y 45 segundos. Después de centrifugar las células homogeneizadas, redisolver el pellet en 100 a 500 microlitros de MB. Preparar una cámara de imagen colocando dos tiras de cinta adhesiva doble cara entre un cubreobjetos y una portaobjetos.Añada la solución de poli-L-lisina al 0,01 % en la cámara y, tras cinco minutos, enjuague suavemente las superficies con MB. Añada 40 microlitros de la suspensión celular en la cámara y deje suficiente tiempo para que se produzca la adhesión a la superficie de vidrio. Lave las células no adheridas añadiendo 100 microlitros de MB en un lado de la cámara, mientras absorbe la solución con papel de filtro desde el otro lado. A continuación, añada de 10 a 15 microlitros de microesferas de látex en la cámara.Utilice una variedad de tamaños de perlas para los experimentos que resulten en un buen contraste. Permita tiempo suficiente para que las perlas se asienten y se adhieran a las células. Enjuague suavemente las perlas con 100 microlitros de MB para eliminar las perlas sueltas.Coloque la muestra sobre la platina del microscopio y examine la superficie en busca de microesferas unidas a motores. Utilice imágenes de campo claro con un objetivo de 60X mientras se mantenga un contraste suficiente para distinguir claramente una microesfera brillante sobre un fondo oscuro. Una vez seleccionada una microesfera, mueva la platina lateralmente para posicionar la microesfera en una esquina predeterminada.Coloque las perlas en la misma esquina para asegurar que se conozca correctamente la dirección de rotación de la perla. Mantenga la frecuencia de muestreo superior a dos veces la frecuencia rotacional del motor para evitar errores asociados con el submuestreo. En este trabajo, se utilizaron frecuencias de muestreo 10 veces más altas para observar un motor que giraba a 50 hercios.Si, tras la inmovilización, las perlas parecen oscilar con una excentricidad mayor de una a dos veces el radio de la perla, se recomienda someter las células a un mayor número de cizallamientos. Aquí se muestra una comparación visual entre una perla adecuadamente inmovilizada y una perla que no está inmovilizada. Las señales provenientes de los dos fotomultiplicadores, muestreadas a 500 hercios, se representan durante un breve período de la medición.Las salidas filtradas de los PMT, después de centrarlas y escalarlas, se utilizaron para reconstruir las trayectorias circulares de la perla en rotación, como se muestra aquí. La trayectoria ideal de la perla es aproximadamente circular, pero se admiten trayectorias elípticas. Las velocidades angulares calculadas a partir de las trayectorias de la perla para un solo motor se representan durante una ventana de tres segundos.Las transiciones repetidas del motor entre las direcciones de rotación antihoraria y horaria se indican mediante cambios entre valores positivos y negativos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo rastrear perlas unidas a motores flagelares individuales con alta precisión, utilizando las técnicas basadas en fotomultiplicadores presentadas aquí. El motor flagelar bacteriano presenta un conjunto único de desafíos porque es capaz de rotar a velocidades de varios cientos de hercios.El seguimiento de alta precisión de microesferas de sonda unidas a motores moleculares facilitó la caracterización de varios tipos de motores, incluidas las quinesinas, miosinas y la F1-ATPasa. La extensión de la técnica de unión mediante microesferas a los motores flagelares permitió a los investigadores estudiar la mecánica del motor con una precisión sin precedentes. La demostración visual de este método ayudará a los investigadores que deseen utilizar esta técnica a superar desafíos como la localización adecuada de microesferas unidas a motores individuales.Se espera que los métodos demostrados aquí permitan el desarrollo de nuevas perspectivas sobre la adaptabilidad de estas nanomáquinas en una variedad de especies bacterianas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El transporte intracelular de cargas, como vesículas u orgánulos, se lleva a cabo mediante proteínas motoras moleculares que se desplazan por microtúbulos polarizados. Este protocolo describe la correlación de la direccionalidad del transporte de las partículas de carga individuales que se mueven dentro de las neuronas, con la cantidad relativa y el tipo de proteínas motoras asociadas.

La caracterización de la composición de los motores moleculares sobre el logro axonal Cargo Uso del análisis &quot;Mapeo de carga&quot;

El objetivo de este protocolo es formar conjuntos de motores moleculares en nanoestructuras de origami de ADN y observar la motilidad del conjunto utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Muchas bacterias utilizan la motilidad provocada por flagelos para navegar por su entorno y colonizar entornos favorables tanto individualmente como colectivamente. Aquí se demuestra el uso de tres métodos establecidos que explotan la motilidad como una herramienta de selección para identificar componentes / vías que contribuyen a la natación y la motilidad de enjambre.

Investigación De La Motilidad Impulsada Por Flagelos En Escherichia coli mediante la Aplicación De Tres Técnicas Establecidas En Una Serie

Aquí se presenta un procedimiento para expresar y purificar la miosina 5a seguido de una discusión de su caracterización, utilizando ensayos basados en microscopía de fluorescencia in vitro de conjunto y molécula única, y cómo estos métodos pueden modificarse para la caracterización de la miosina 2b no muscular.

Adaptaciones específicas de miosina de ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

Este protocolo detalla los procedimientos para la producción recombinante de la holoenzima miosina-7a humana utilizando el sistema MultiBac Baculovirus y para el estudio de su motilidad mediante un ensayo de deslizamiento de filamento in vitro personalizado.

Purificación y caracterización biofísica de miosina-7a humana basada en el sistema MultiBac

Aprende a rastrear en tiempo real la rotación de microesferas unidas a motores flagelares en células bacterianas vivas. Esta técnica de seguimiento fotomultiplicador permite estudiar la mecánica molecular con alta precisión en E. coli.

Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar

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