La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

El objetivo general de este procedimiento es expandir las células epiteliales esofágicas derivadas del paciente a partir de biopsias endoscópicas para estudiar las enfermedades esofágicas, o crear un andamio esofágico en 3D para el modelado posterior o el reemplazo de tejido esofágico. Este método se puede utilizar para comprender mejor el papel de las células epiteliales del esófago en la enfermedad esofágica. También se pueden utilizar para ver andamios 3D para modelado o implantación.

La ventaja de esta técnica es que nos permite generar células epiteliales específicas del paciente a partir de una pieza muy pequeña de tejido sin necesidad de modificaciones genéticas o permanentes. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la comprensión de la patogénesis de la esofagitis eosinofílica, así como hacia el desarrollo de tratamientos para la atresia esofágica y la esofagitis eosinofílica. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades con la capacidad de eliminar por completo las células alimentadoras antes de recolectar las células epiteliales del esófago humano para mantener la pureza.

La demostración de esta técnica correrá a cargo de Christopher Foster, técnico de nuestro laboratorio. Al menos tres días antes de obtener las muestras del paciente, coloque las células 3T3 en un medio de cultivo 3T3 en matraces T75 tratados con tejido. El día del experimento, justo antes de obtener las muestras, separar las células 3T3 con 5 mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA por matraz durante unos cinco minutos a 37 grados centígrados.

Cuando la mayoría de las células estén flotando, agregue 5 mililitros de medio 3T3 para detener la reacción y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en medio para contar. Luego, transfiera el número apropiado de celdas para sembrar a un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, agregue 25 mililitros de medio 3T3 fresco a las celdas para irradiar a 3000 rads. Luego, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un medio de programación condicional a cinco mililitros por placa de 100 milímetros. Después de obtener aproximadamente seis biopsias esofágicas en el momento de la endoscopia, colocar seis biopsias en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medio queratinocitario completo libre de suero, suplementado con Primocin en hielo húmedo.

Coloque una biopsia en cinco mililitros de formalina tamponada sobre hielo húmedo y coloque una biopsia en un crimolde de biopsia pequeño que contenga medio de inclusión. Sumerja inmediatamente el molde en un vaso de precipitados de hielo o pentano dentro de un recipiente de nitrógeno líquido. Una vez que el tejido esté congelado, coloque el criommoldo en una bolsa de muestras sobre hielo seco, en un recipiente de espuma de poliestireno.

Luego, coloque los tubos de biopsias dentro de una bolsa hermética dentro de una caja de envío con la etiqueta de riesgo biológico que contiene hielo húmedo, y selle y etiquete ambos recipientes con una etiqueta de riesgo biológico para transportarlos al laboratorio. Al ingresar al laboratorio, transfiera inmediatamente la biopsia congelada a un almacenamiento de menos 80 grados Celsius para el corte posterior o la extracción de ARN. Coloque la muestra en formol en un refrigerador de cuatro grados centígrados para su fijación durante la noche y coloque las biopsias restantes en la centrífuga.

Reemplace el medio en cada tubo con 10 mililitros de solución de dispasa y selle los tubos para una incubación de 15 minutos a 37 grados Celsius en un baño de agua. Al final de la incubación, vuelva a centrifugar las biopsias y vuelva a suspender las muestras en cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,25%. Transfiera las biopsias a una sola placa estéril de 100 mililitros y use dos navajas esterilizadas para picar los tejidos lo más finamente posible.

Cuando se haya cortado todo el tejido, transfiera los fragmentos de tejido a un nuevo tubo de 15 mililitros y enjuague la placa dos veces con cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05%. Agrupe los lavados en el tubo y devuelva las muestras a un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos, centrifugue las piezas de muestra digeridas y las celdas de alimentación, y vuelva a suspender los gránulos en cinco mililitros de medio de reprogramación condicional, cada uno.

A continuación, combine las muestras del alimentador y de la biopsia esofágica en un solo tubo, y añada la rho quinasa, o inhibidor de ROCK, a las células para su cocultivo en una placa de cultivo de tejidos recubierta de gelatina. Después de aproximadamente cinco días, retire el medio y los trozos de biopsia picados por aspiración, y enjuague el plato dos o tres veces con cinco mililitros de PBS estéril. Después del último lavado, agregue 10 mililitros de medio fresco suplementado con inhibidor de ROCK, a la placa, y devuelva el cocultivo a la incubadora hasta que las células alcancen el 70% de confluencia.

Para expandir las celdas, retire los alimentadores con cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados durante no más de dos minutos y medio. Enjuague la placa con cinco mililitros de PBS fresco para eliminar las células alimentadoras flotantes y agregue cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% para una incubación de cinco a 10 minutos hasta que las células de la muestra de biopsia se aflojen del fondo de la placa. Luego, detenga la reacción con 10 mililitros de medio fresco y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet en un medio de reprogramación condicional fresco para contar y, ahora, cuente una vez 10 a la sexta célula esofágica humana en un nuevo tubo cónico. Agregue 1,2 por 10 a las sextas células 3T3 irradiadas a las células esofágicas y lleve el volumen total en el tubo a 15 mililitros con medio de reprogramación condicional fresco. A continuación, añada un inhibidor de ROCK fresco a las células y coloque el cocultivo en una placa de 150 milímetros recubierta de gelatina.

Para congelar las células esofágicas para almacenarlas a menos 80 grados Celsius, retire los alimentadores y separe las células esofágicas como se acaba de demostrar. A continuación, transfiera las celdas a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación y vuelva a suspender el pellet a una concentración de una vez 10 a la sexta celda por cada dos mililitros de concentración de medio de congelación. Luego, transfiera dos mililitros de células a cada criovial premarcado y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius durante al menos 24 horas antes de moverlas al almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo.

Las colonias de células epiteliales se formarán en aproximadamente cuatro o cinco días y estarán rodeadas de células alimentadoras de fibroblastos. A medida que estas colonias se expanden, se fusionarán con otras colonias para formar colonias más grandes. Una vez que la cultura se ha vuelto 70% confluente, es necesario expandirlos.

Una vez que se han eliminado las células alimentadoras, las células epiteliales adherentes se pueden tripsonizar y volver a colocar en nuevas células alimentadoras irradiadas. La caracterización fenotípica de estas células a través de qRT-PCR revela una regulación positiva de P63, un marcador de células progenitoras al final del primer paso, en comparación con la muestra inicial de bioespía, lo que indica que las células han sido reprogramadas a un estado más parecido al de un tallo progenitor. Cuando estas células se transfieren a placas de cultivo de tejidos normales, la expresión de P63 disminuye y las expresiones de la proteína de unión estrecha uno, o TJP1, y E-cadherina aumentan, lo que demuestra un cambio de fenotipo de célula progenitora a una célula epitelial más diferenciada.

El análisis de citometría de flujo de las células después del paso uno indica que más del 90% de las células también son positivas para EpCAM. La tinción con inmunofluorescencia demuestra que las células conservan su marcador epitelial, marcador progenitor, marcador de proliferación y expresión de proteínas epiteliales de unión estrecha. Se ha calculado que el tiempo de duplicación de las células esofágicas de un paciente no enfermo es de aproximadamente 36 a 40 horas, aunque es probable que el tiempo de duplicación de las células enfermas sea más lento.

Una vez dominada, esta técnica debe completarse en aproximadamente una hora. Al intentar este procedimiento, asegúrese de utilizar una técnica estéril para evitar la contaminación y asegúrese de trabajar rápidamente para mantener la viabilidad de la célula. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como el cultivo de transpocillos, para evaluar qué antígenos están causando inflamación o patogenia esofágica.

Después del desarrollo, este ensayo allanará el camino para que los investigadores identifiquen los antígenos desencadenantes que causan la esofagitis eosinofílica, así como nuevas opciones de tratamiento para tratar a estos pacientes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar y expandir las células epiteliales del esófago de las biopsias endoscópicas para su uso en el estudio de enfermedades del esófago o en la generación de modelos 3D. No olvide que trabajar con instrumentos afilados y tejidos biológicos puede ser peligroso.

Asegúrese de desechar adecuadamente los instrumentos punzantes y utilice buenas prácticas de bioseguridad.