Name: La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende a expandir células epiteliales esofágicas pediátricas mediante reprogramación condicional sin modificación genética. Este método permite generar cultivos para modelado de enfermedades e ingeniería de tejidos.

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Nos gustaría agradecer a los Fondos de Investigación Estratégica del Centro Médico Infantil de Connecticut por apoyar este trabajo.

Se obtuvieron biopsias esofágicas tras el consentimiento informado se obtuvo de los padres / tutores de los pacientes pediátricos y de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional (IRB # 13-094). 1. Esterilización Instrumentos y gelatina Solución <ol><li> fórceps autoclave, cuchillas de afeitar y tijeras antes de manipular el tejido para evitar la contaminación. </li><li> Para hacer 200 ml de solución de gelatina al 0,1%, se combinan 200 ml de agua destilada con 0,2 g de gelatina. Autoclave y enfriar antes de su uso. </li></ol> 2. Revestimiento de cultivo de tejidos placas <ol><li> Aproximadamente 2 h antes del aislamiento de células, añadir una cantidad suficiente 0,1% de gelatina para cubrir una placa de cultivo tisular (100 mm) y se incuba a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular. NOTA: Estas placas también se pueden hacer antes de tiempo y se mantienen en la incubadora antes de su uso. </li></ol> 3. Hacer Solución de Enzima para la disociación <ol><li> Aproximadamente 30 minutos antes de aislamiento de células, pésese10 unidades de dispasa en un equilibrio basado en las unidades por miligramo de concentración en el vial. Coloque el polvo en un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y se coloca en un baño de agua a 37 °. </li></ol> 4. Toma de célula medio de cultivo <ol><li> Para hacer 50 ml de medio de reprogramación condicional, mezclar los siguientes ingredientes en un tubo estéril cónico: 35 ml de F12 (de Ham Medium), 11,5 ml de DMEM, 0,5 ml de L-glutamina, 0,5 ml de 100x penicilina / estreptomicina, 2,5 ml de suero bovino fetal (FBS), 250 mg de insulina humana, 500 ng del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF). </li><li> Para hacer 500 ml de medio 3T3, mezclar 50 ml de FBS, 5 ml de 100x penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-glutamina con 500 ml de DMEM. </li><li> Para hacer 500 ml de medio libre de suero de queratinocitos, descongelar los suplementos de extracto de pituitaria bovina (BPE) (provistos con los medios de comunicación) y EGF. Añadir los complementos de la botella ml de medio base 500 y añadir 5 ml de 100x penicilina / estreptomicina </li></ol> 5. El cultivo y la irradiación de las células 3T3 como fuente alimentador <ol><li> Preparar medio 3T3, que comprende DMEM, 10% FBS, 1x penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina. </li><li> Cultura 3T3 células tratadas en los tejidos T-75 frascos de al menos 3 días antes de la llegada de las muestras de pacientes. <ol><li> Justo antes de la llegada de las muestras de pacientes, trypsinize células 3T3 utilizando 5 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco y se incuba a 37 ° C durante 5 min o hasta que la mayoría de las células están flotando </li></ol></li><li> Añadir 5 ml de 3T3 medio para detener la reacción. Aspirar la suspensión de células y la transferencia a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugado durante 5 min a 300 x g. </li><li> Aspirar el medio y volver a suspender las células en un volumen definido de Trypan azul para el recuento de células. Combinar 10 l de células con 10 l de azul de tripano para excluir las células muertas. Cargar 10 l de esta solución en un hemocitómetro para el recuento celular. NOTA: Para este protocol, densidad de siembra para células 3T3 irradiados es 10.900 células por cm 2, que es igual a 600.000 células por placa de 100 mm. </li><li> Alícuota el número de células necesarias para la placa una placa de 100 mm por muestra del paciente y volver a suspender en 25 ml de medio 3T3 en un tubo cónico de 50 ml e irradiar con 3000 rads. </li><li> Después de la irradiación, las células Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg y resuspender en medio reprogramación condicional en 5 ml por placa de 100 mm. </li><li> Ajuste el tubo a un lado hasta que el recubrimiento de las células del paciente se lleva a cabo más adelante en el protocolo (véase el paso 7.6). </li></ol> 6. La obtención, preservación y transporte de biopsias esofágicas pediátricos <ol><li> Añadir 5 ml de medio libre de suero de queratinocitos completo con 100 mg / ml primocin a tubos cónicos de 15 ml y llevarlo al centro médico en el hielo. NOTA: Estos tubos de medio pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 2 meses. </li><li> Obtener aproximadamente 8 biopsias esofágicas en el time de la endoscopia y separada de la siguiente manera: <ol><li> Coloque seis biopsias en los 15 ml cónica que contiene un medio libre de suero de queratinocitos completa con 100 g / ml primocin y colocar en hielo húmedo. </li><li> Coloque una biopsia en 5 ml de formalina tamponada y el lugar en hielo húmedo. </li><li> Coloque una biopsia de una pequeña biopsia criomolde con el compuesto de temperatura óptima de corte. <ol><li> Inmediatamente deje caer este molde en un vaso de precipitados de isopentano colocado en nitrógeno líquido. Una vez congelado, colocar el criomolde en una bolsa de muestra y almacenar en hielo seco en un recipiente de espuma de poliestireno. </li></ol></li></ol></li><li> Colocar los tubos que contenían biopsias en medio o formalina dentro de una bolsa de cierre hermético y luego en una caja de envío contiene hielo húmedo. Sellar y etiquetar la caja con una etiqueta de riesgo biológico y lo transportan al laboratorio. NOTA: El recipiente que contiene el hielo seco y la biopsia congelado también se sella y se marca con un marcador de riesgo biológico. </li></ol> 7. TratamientoEl tejido del paciente para la Cultura y Análisis de Downstream <ol><li> A su llegada al laboratorio, la transferencia de la biopsia por congelación en hielo seco a -80 ° C congelador para la sección aguas abajo o la extracción de RNA. Colocar la muestra en formalina. Almacenar en un refrigerador de 4 ° C y poder fijar una noche a la mañana. </li><li> Girar las biopsias restantes hacia abajo a 300 xg, y aspirar el medio. Añadir 10 ml de dispasa solución al tubo cónico, sello y permitir que se incuba a 37 ° C en un baño de agua durante 15 minutos. </li><li> Después de la incubación, girar las biopsias hacia abajo a 300 x g. Aspirar las biopsias medio y volver a suspender en 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Transferir el 5 ml de tripsina-EDTA que contiene las biopsias a una placa estéril de 100 mm y picar las biopsias por medio de 2 hojas de afeitar esterilizadas lo más fina posible. </li><li> Transferir el 5 ml de tripsina-EDTA que contiene biopsias picada a un nuevo 15 ml cónico. Enjuagar la placa dos veces con un 5 ml más de 0,05% de tripsina-EDTA y añadir a la cónicatubo. Incubar el tubo durante 10 min en un baño de agua C 37 °. </li><li> Después de la incubación, girar las biopsias hacia abajo a 300 xg (1,4 rpm) durante 5 min y aspirar el medio. Añadir 5 ml de medio de reprogramación condicional al tubo cónico, así como el 5 mL de medio de reprogramación condicional que contiene las células de alimentación irradiadas (véase el paso 5.7). </li><li> Añadir inhibidor de roca (1 l / ml) a los 10 ml de suspensión de células y la placa después de aspirar la gelatina de la cápsula de cultivo de tejidos. Se incuba a 37 ° C. </li></ol> 8. El cultivo y las células en expansión <ol><li> Después de aproximadamente 5 días de cultivo, aspirar el medio inicial que contiene las piezas picada-biopsia y aclarar el plato 2-3 veces con 5 ml de PBS estéril. Añadir nuevo medio a la placa que incluye inhibidor de roca en 10 mM. </li><li> Al llegar a 70% de confluencia, expandir las células. Añadir 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a la placa y se incuban en una incubadora a 37ºC no más de 2,5 min para eliminar THcélulas de alimentación e. Después de que la incubación, aspirar el tripsina-EDTA y enjuagar la placa con 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar el PBS y añadir 5 ml de 0,25% tripsina-EDTA a la placa y se incuba durante 5-10 minutos o hasta que las células están sueltos de la placa. Añadir cantidades iguales de medio a la placa para detener la reacción y la transferencia de todo el fluido a un tubo de 50 ml cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender las células en un volumen definido de medio de reprogramación condicional y mezclar 10 l de la suspensión con 10 l de azul de tripano. Contar con un hemocitómetro para determinar el número total de células. </li><li> Para expandir las células, añadir 1 millón de células esofágicas humanos a una placa de 150 mm junto con 1,2 millones de células 3T3 irradiadas en un volumen total de 15 mL. Añadir inhibidor de roca fresca en 10μM y añadir la suspensión de células a una placa recubierta con gelatina 150 mm. </li></ol> 9. Las células congelación y la conservación de esófago humano epiteliales <ol><li> Para hacer un medio de congelación, añadir un 10%DMSO al medio de reprogramación condicional. Después de tripsinización y contando, alícuota de las células a congelar en un nuevo tubo de 50 ml cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el medio y añadir medio de congelación en un volumen de 2 ml por criovial. Una vez que la suspensión de células es homogénea, alícuota de 10 6 células en cyrovials pre-etiquetados. Colocar en un recipiente de congelación a -80 ° C durante al menos 24 h antes de mover los viales de almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los pasos más importantes con el fin de aislar y expandir las células epiteliales del esófago de biopsias de pacientes son: 1) disociar adecuadamente tejido de biopsia con la muerte celular mínima; 2) garantizar inhibidor de la roca es añadido al medio de cultivo celular en cada cambio de medio; 3) No use más células alimentadoras que los recomendados; 4) mantener un cultivo aséptico limpio; y 5) las células de paso justo antes de llegar a la confluencia. Debido a las diferencias relacionada...

la ingeniería de tejidos del esófago y la esofagitis eosinofílica (EOE) han sido el foco de la investigación en muchos laboratorios en la última década. Los defectos congénitos, tales como la atresia esofágica, se observan en aproximadamente 1 de cada 4.000 nacidos vivos, lo que resulta en el desarrollo incompleto del esófago que lleva a la incapacidad para comer 1. La incidencia y prevalencia de la EE han ido en aumento desde que la identificación de la entidad de la enfermedad en 1993. La incidencia de la EE varió de 0,7 como 10 / 100.000 por persona-año y la prevalencia varió de 0,2 a la 43 / 100.000 2. Un nuevo abordaje quirúrgico atractivo para el tratamiento de larga distancia atresia esofágica consiste en la generación de construcciones de tejido para su implantación utilizando las propias células del paciente. Estas células, en relación con el andamio sintético generarán una construcción autólogo que no requiere la supresión inmune. Algunos grupos ya han comenzado a investigar los EE.UU.e de las células madre como para ingeniería de tejido de esófago 3, así como el uso de células epiteliales del esófago nativos para repoblar la mucosa 4-7. Las enfermedades que están presentes en el esófago de los pacientes pediátricos son a menudo difíciles de diagnosticar o estudiar sin necesidad de intervención. Por otra parte, la utilización de modelos animales o in vitro de líneas celulares inmortalizadas modelos para enfermedades pediátricas como la EE no abarcan la patogénesis de la enfermedad exacta o diferencias específicas de cada paciente 8. Por lo tanto, la capacidad de estudiar proceso de la enfermedad de un paciente in vitro con el fin de identificar los antígenos específicos de la enfermedad de activación, evaluar los mecanismos subyacentes e investigar los tratamientos con fármacos sería novedoso y proporcionar a los médicos con información que puede ayudar en el tratamiento del paciente. Ha habido muchos tipos de células autólogas o específicos de los pacientes que se han propuesto para su uso en tissue ingeniería y el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana. Sin embargo, algunos de estos tipos de células están limitados en su capacidad de generar suficientes células de un fenotipo específico a las semillas de un gran andamio o llevar a cabo un alto rendimiento en los estudios in vitro. El uso de células madre pluripotentes o multipotentes ha sido el tema de mucha discusión investigación, sin embargo, limitaciones y deficiencias para el uso de estas células han sido bien descritos 9. El uso de células madre embrionarias humanas es muy debatido y presenta muchos problemas éticos. Más importante, estas células forman teratomas, que son similares a un tumor, si no se diferencian de su estado pluripotente antes de la entrega de ellos en un huésped vivo 10. Además, el uso de células madre embrionarias no sería específica del paciente y podría provocar una respuesta alogénica y la necesidad de inmunosupresión 10. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son células pluripotentes que puedense derivan de las propias células de un paciente. Las células somáticas, tales como células de la piel, pueden ser inducidos a un estado pluripotente usando una variedad de técnicas de integración y no de integración. Estas células sirven como fuentes de células específicos para cada paciente para ingeniería de tejidos o la investigación de la enfermedad. La integración de material genético no deseado en estas células es una preocupación muchos han descrito e incluso si las secuencias son completamente eliminados iPSCs parecen conservar una &quot;memoria&quot; epigenética hacia el tipo de célula de la que se derivaron 11. Estas células también formarán teratomas in vivo si no diferenciadas antes del trasplante 11. Muchos protocolos de diferenciación se han investigado centrándose en linajes epiteliales 12, 13, 14, sin embargo, es muy importante tener en cuenta que los tipos de células resultantes al final de la diferenciación no son homogéneos y oólo poseen una fracción del tipo celular de interés. Esto resulta en un rendimiento bajo y la necesidad de purificar el tipo celular deseado. Aunque iPSCs son una fuente celular específica del paciente potencial, el proceso para obtener un tipo de célula de interés, ya sea para la ingeniería de tejidos o la investigación de la enfermedad es muy ineficiente. Células epiteliales humanas se han aislado con éxito de una variedad de ambos tejidos enfermos y no enfermos en el cuerpo humano, incluyendo: pulmón 15, pecho 16, el intestino delgado 17, colon 18, la vejiga 19 y el esófago 20. Es importante tener en cuenta que las células primarias humanas tienen un número finito de pasos en los que el fenotipo se mantiene 21, 22. Desafortunadamente, esto significa que el número de células necesarias para la investigación de la enfermedad o para la siembra de un andamio de ingenieríapara la implantación no puede ser alcanzado. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas para expandir las células del paciente mientras que todavía mantiene un fenotipo epitelial. Reprogramación condicional de células epiteliales normales y cancerosas utilizan células alimentadoras y inhibidor de la roca fue descrito en 2012 por Liu et al. 2 3. Esta técnica se utilizó para expandir las células epiteliales cancerosas obtenidas de biopsias de cáncer de próstata y de mama utilizando células alimentadoras irradiadas, inhibidores de la ROCA y medianas reprogramación condicional. El objetivo era generar suficientes células para ensayos in vitro tales como la detección de drogas. Esta técnica es capaz de expandir las células epiteliales de forma indefinida por &quot;reprogramación&quot; estas células a un vástago o estado progenitor similar, que es altamente proliferativa. Se ha demostrado que estas células son no tumorigénicos y no poseen la capacidad de formar teratomas 23, 24. Además, no seanomalías cromosómicas o manipulaciones genéticas estaban presentes después de pases estas células en cultivo usando esta técnica 23, 24. Lo más importante, estas células sólo son capaces de diferenciarse en el tipo de célula nativa de interés. Por lo tanto, esta técnica ofrece una gran reserva de células epiteliales de pacientes específicos para la investigación de la enfermedad o la ingeniería de tejidos sin la necesidad de la inmortalización. La obtención de tejido epitelial de un órgano específico con el fin de estudiar los procesos de enfermedad es a menudo limitado y no siempre es posible debido a riesgo del paciente. Para aquellos pacientes que sufren de enfermedad esofágica o defectos, la recuperación de biopsia endoscópica es un método mínimamente invasivo para la obtención de tejido epitelial que puede ser disociado y condicionalmente reprogramado para proporcionar una fuente de células indefinido que es específico de la mucosa del esófago de ese paciente. Esto permite entonces para estudios in vitrode las células epiteliales para evaluar los procesos de enfermedad y la pantalla para terapéuticos potenciales. Un proceso de la enfermedad que podría beneficiarse en gran medida de este enfoque es esofagitis eosinofílica, que ha sido descrito como una enfermedad alérgica del esófago 8. Las pruebas de alergia, así como enfoques terapéuticos podrían ser evaluados in vitro usando las propias células epiteliales del paciente y estos datos pueden ser pasados al médico tratante para desarrollar planes de tratamiento individualizados. La técnica de reprogramación condicional en conjunción con la obtención de biopsias endoscópicas de pacientes pediátricos ofrece la posibilidad de expandir las células epiteliales del esófago normales indefinidamente de cualquier paciente. Por tanto, esta fuente de células podría ser asociado junto con el andamio natural o sintética para proporcionar una opción quirúrgica específica del paciente en busca de defectos, enfermedad o trauma. Tener un número indefinido de células podría ayudar a diseñar construcciones esofágicas que poseen un completo vuelven a sembrarlumen con las células epiteliales del esófago con el fin de ayudar a facilitar la regeneración de los tipos de células restantes.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>gelatina de piel porcina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>Tubos Cónicos de 15 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Queratinocitos Completo Medio Libre de Suero</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Thermofisher Scientific 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Platos</td><td>Denville Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Platos</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cónicos</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811</td><td></td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipetas Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Células NIH 3T3 ATCC</td><td></td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

la reprogramación condicional de células epiteliales del esófago pediátrico humano para el uso en ingeniería de tejidos e investigación de enfermedades

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identificar y expandir células específicas del paciente en cultivo para su uso en ingeniería de tejidos e investigación de enfermedades puede ser muy desafiante. La utilización de varios tipos de células madre para derivar tipos de células de interés suele ser costosa, lenta y muy ineficiente. Además, los tipos de células no deseados deben eliminarse antes de usar esta fuente de células, lo que requiere otro paso en el proceso. Con el fin de obtener suficientes células epiteliales esofágicas para diseñar la luz de una construcción esofágica o para evaluar enfoques terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad esofágica, las células epiteliales esofágicas nativas deben expandirse sin alterar su expresión génica o fenotipo. La reprogramación condicional del tejido epitelial esofágico ofrece un enfoque prometedor para la expansión de las células epiteliales esofágicas específicas del paciente. Además, estas células no necesitan ser clasificadas o purificadas y volverán a un estado epitelial maduro después de eliminarlas del cultivo de reprogramación condicional. Esta técnica se ha descrito en muchos estudios de detección del cáncer y permite la expansión indefinida de estas células en múltiples conductos. La capacidad de realizar pruebas de detección esofágica ayudaría a revolucionar el tratamiento de las enfermedades esofágicas pediátricas como la esofagitis eosinofílica al identificar el mecanismo desencadenante que causa los síntomas del paciente. Para aquellos pacientes que sufren de un defecto congénito, enfermedad o lesión del esófago, esta fuente de células podría usarse como un medio para sembrar una construcción sintética para su implantación para reparar o reemplazar la región afectada.

Un resumen de los pasos clave en el aislamiento de células epiteliales del esófago de biopsias de pacientes se resume en la figura 1. Las colonias de células epiteliales se forman en aproximadamente 4-5 días y estará rodeado de células alimentadoras de fibroblastos (Figura 2A). A medida que estas colonias se expanden van a fusionarse con otras colonias para formar colonias grandes (Figura 2B). Una vez que las culturas se han convertido e...

Expansión de las células epiteliales del esófago pediátricos humanos que utilizan reprogramación condicional proporciona a los investigadores con una población específica del paciente de las células que puede ser utilizada para la ingeniería de las construcciones de esófago para la implantación autóloga para tratar defectos o lesiones y servir como depósito para ensayos de cribado de terapéuticas.

La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

El objetivo general de este procedimiento es expandir células epiteliales esofágicas derivadas de pacientes a partir de biopsias endoscópicas para estudiar enfermedades esofágicas, o para crear un andamio esofágico tridimensional para modelado posterior o reemplazo del tejido esofágico. Este método puede utilizarse para comprender mejor el papel de las células epiteliales esofágicas en las enfermedades esofágicas. También pueden emplearse para obtener andamios tridimensionales destinados a modelado o implantación.La ventaja de esta técnica es que nos permite generar células epiteliales específicas del paciente a partir de un fragmento muy pequeño de tejido, sin necesidad de modificaciones genéticas ni permanentes. Las implicaciones de este método abarcan la comprensión de la patogénesis de la esofagitis eosinofílica, así como el desarrollo de tratamientos para la atresia esofágica y la esofagitis eosinofílica. En general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades para eliminar completamente las células alimentadoras antes de recolectar las células epiteliales esofágicas humanas, con el fin de mantener la pureza.Este técnica será demostrada por Christopher Foster, un

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Describimos un método para establecer enteroides humanos a partir de criptas del intestino delgado y colonoides a partir de criptas de colon recogidas tanto de tejido quirúrgico como de biopsias. En este artículo metodológico, presentamos las modalidades de cultivo que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento exitoso de enteroides y colonoides humanos.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Esta publicación demuestra métodos para el muestreo y cultivo exitosos de mucosa epitelial nasal de niños, y la reprogramación de estas células a Células Madre Pluripotentes (iPSCs) inducidas.

Cultivar las células primarias epiteliales nasales de niños y reprogramar en células madre pluripotentes inducidas

La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.

Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.

Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto

Los cocultivos organoide-fibroblastos proporcionan un modelo para estudiar el nicho de células madre in vivo . Aquí, se describe un protocolo para los cocultivos organoide-fibroblastos esofágicos. Además, se utilizan imágenes de montaje completo para visualizar la interacción fibroblasto-organoide.

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Aquí, se proporciona un protocolo para el cultivo de organoides esofágicos humanos y el cultivo de interfaz aire-líquido. El cultivo de la interfaz aire-líquido de los organoides esofágicos se puede utilizar para estudiar el impacto de las citocinas en la barrera epitelial esofágica.

Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica 

El presente protocolo describe el establecimiento y análisis histológico de modelos de organoides esofágicos que representan diferentes etapas de la progresión tumoral. Este método permite a los investigadores estudiar los cambios en la morfología celular, la organización espacial y los patrones de expresión de marcadores moleculares durante la transición de tejidos normales a cancerosos.

Establecimiento y análisis histológico de organoides esofágicos que modelan la progresión de tejidos normales a cancerosos

Aprende a expandir células epiteliales esofágicas pediátricas mediante reprogramación condicional sin modificación genética. Este método permite generar cultivos para modelado de enfermedades e ingeniería de tejidos.

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La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

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