La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

El objetivo general de este procedimiento es expandir células epiteliales esofágicas derivadas de pacientes a partir de biopsias endoscópicas para estudiar enfermedades esofágicas, o para crear un andamio esofágico tridimensional para modelado posterior o reemplazo del tejido esofágico. Este método puede utilizarse para comprender mejor el papel de las células epiteliales esofágicas en las enfermedades esofágicas. También pueden emplearse para obtener andamios tridimensionales destinados a modelado o implantación.

La ventaja de esta técnica es que nos permite generar células epiteliales específicas del paciente a partir de un fragmento muy pequeño de tejido, sin necesidad de modificaciones genéticas ni permanentes. Las implicaciones de este método abarcan la comprensión de la patogénesis de la esofagitis eosinofílica, así como el desarrollo de tratamientos para la atresia esofágica y la esofagitis eosinofílica. En general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades para eliminar completamente las células alimentadoras antes de recolectar las células epiteliales esofágicas humanas, con el fin de mantener la pureza.

Este técnica será demostrada por Christopher Foster, un técnico de nuestro laboratorio. Al menos tres días antes de obtener las muestras del paciente, siembre las células 3T3 en medio de cultivo 3T3 en matraces T75 tratados para tejidos. El día del experimento, justo antes de obtener las muestras, desprenda las células 3T3 con 5 mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 % por matraz durante aproximadamente cinco minutos a 37 grados Celsius.

Cuando la mayoría de las células estén flotando, agregue 5 mililitros de medio 3T3 para detener la reacción y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación. Re-suspenda el precipitado en medio para contar las células. Luego, transfiera el número adecuado de células para siembra a un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, agregue 25 mililitros de medio fresco 3T3 a las células para irradiar a 3000 rads. Luego, recoja las células por centrifugación y re-suspenda el sedimento en medio de programación condicional a cinco mililitros por placa de 100 milímetros. Después de obtener aproximadamente seis biopsias esofágicas durante la endoscopia, coloque seis biopsias en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medio de queratinocitos completo sin suero, suplementado con Primocin, sobre hielo húmedo.

Coloque una biopsia en cinco mililitros de formalina tamponada sobre hielo húmedo, y coloque otra biopsia en un criomolde pequeño que contenga medio de inclusión. Sumerja inmediatamente el molde en un vaso de hielo o pentano dentro de un recipiente con nitrógeno líquido. Una vez que el tejido esté congelado, coloque el criomolde en una bolsa para muestras sobre hielo seco, dentro de un recipiente de espuma de poliestireno.

Luego, coloque los tubos de biopsias dentro de una bolsa hermética dentro de una caja de envío con la etiqueta de biohazard que contenga hielo húmedo, y selle y etiquete ambos recipientes con una pegatina de biohazard para su transporte al laboratorio. Al ingresar al laboratorio, transfiera inmediatamente la biopsia congelada a un almacenamiento a menos 80 grados Celsius para su posterior seccionado o extracción de ARN. Coloque la muestra en formalina en un refrigerador a cuatro grados Celsius para su fijación nocturna y coloque las biopsias restantes en la centrífuga.

Sustituya el medio en cada tubo por 10 mililitros de solución de dispasa y selle los tubos para una incubación de 15 minutos a 37 grados Celsius en un baño de agua. Al finalizar la incubación, centrifugue nuevamente las biopsias y re-suspenda las muestras en cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 %. Transfiera las biopsias a una sola placa estéril de 100 mililitros y utilice dos cuchillas esterilizadas para picar los tejidos lo más finamente posible.

Una vez que todo el tejido haya sido cortado, transfiera los fragmentos de tejido a un nuevo tubo de 15 mililitros y enjuague la placa dos veces con cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 %. Combine los lavados en el tubo y devuelva las muestras a un baño de agua a 37 grados Celsius. Después de 10 minutos, centrifugue los fragmentos de tejido digeridos y las células alimentadoras, y re-suspenda los precipitados en cinco mililitros de medio de reprogramación condicional, cada uno.

Luego, combine las muestras de biopsia del alimentador y del esófago en un solo tubo, y agregue inhibidor de la quinasa rho, o inhibidor ROCK, a las células para su cultivo conjunto en una placa de cultivo de tejidos recubierta con gelatina. Después de aproximadamente cinco días, retire el medio y los fragmentos de biopsia picados mediante aspiración, y enjuague la placa dos o tres veces con cinco mililitros de PBS estéril. Después del último lavado, agregue 10 mililitros de medio fresco suplementado con inhibidor ROCK a la placa, y devuelva el cultivo conjunto al incubador hasta que las células alcancen una confluencia del 70 %.

Para expandir las células, retire las células alimentadoras con cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 % a 37 grados Celsius durante no más de dos minutos y medio. Enjuague la placa con cinco mililitros de PBS fresco para eliminar las células alimentadoras en suspensión y agregue cinco mililitros de tripsina-EDTA al 0,25 % durante una incubación de cinco a 10 minutos hasta que las células de la muestra de biopsia se suelten del fondo de la placa. Luego, detenga la reacción con 10 mililitros de medio fresco y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros para centrifugación.

Re-suspenda el precipitado en medio fresco de reprogramación condicional para el conteo y, ahora, transfiera un millón de células esofágicas humanas a un nuevo tubo cónico. Añada 1,2 millones de células 3T3 irradiadas a las células esofágicas y complete el volumen total en el tubo hasta 15 mililitros con medio fresco de reprogramación condicional. A continuación, añada inhibidor fresco de ROCK a las células y siembre el cultivo co-cultivo en una placa de 150 milímetros recubierta con gelatina.

Para congelar las células esofágicas y almacenarlas a menos 80 grados Celsius, retire las células alimentadoras y desprenda las células esofágicas tal como se acaba de demostrar. A continuación, transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para centrifugación, y re-suspenda el precipitado a una concentración de uno por diez a la sexta células por dos mililitros de medio de congelación. Luego, transfiera dos mililitros de células a cada criotubo previamente etiquetado, y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius durante al menos 24 horas antes de trasladarlas al almacenamiento prolongado en nitrógeno líquido.

Las colonias de células epiteliales se formarán en aproximadamente cuatro a cinco días y estarán rodeadas por células alimentadoras fibroblásticas. A medida que estas colonias se expandan, se fusionarán con otras colonias para formar colonias más grandes. Una vez que el cultivo alcance una confluencia del 70 %, será necesario expandirlo.

Después de que se han eliminado las células alimentadoras, las células epiteliales adherentes pueden ser tratadas con tripsina y replantadas sobre nuevas células alimentadoras irradiadas. La caracterización fenotípica de estas células mediante qRT-PCR revela una sobreexpresión de P63, un marcador de células progenitoras, al final del primer pase, en comparación con la muestra inicial de biopsia, lo que indica que las células han sido reprogramadas a un estado más similar al de células madre progenitoras. Cuando estas células se transfieren a placas de cultivo celular normales, la expresión de P63 disminuye y aumentan las expresiones de la proteína de unión estrecha uno, o TJP1, y de la E-cadherina, demostrando un cambio fenotípico desde una célula progenitora hacia una célula epitelial más diferenciada.

El análisis citométrico de flujo de las células tras el primer pase indica que más del 90 % de las células también son positivas para EpCAM. La tinción de inmunofluorescencia demuestra que las células conservan la expresión de su marcador epitelial, marcador de progenitor, marcador de proliferación y proteína de unión estrecha epitelial. Se ha calculado que el tiempo de duplicación de las células esofágicas de un paciente sin enfermedad es de aproximadamente 36 a 40 horas, aunque es probable que el tiempo de duplicación de las células enfermas sea más lento.

Una vez dominada, esta técnica debería completarse en aproximadamente una hora. Al intentar este procedimiento, asegúrese de utilizar una técnica estéril para prevenir la contaminación y trabaje con rapidez para mantener la viabilidad celular. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como el cultivo en transwell, con el fin de evaluar qué antígenos están causando la inflamación esofágica o la patogénesis.

Después del desarrollo, este ensayo allanará el camino para que los investigadores identifiquen los antígenos desencadenantes que causan la esofagitis eosinofílica, así como nuevas opciones de tratamiento para estos pacientes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y expandir células epiteliales esofágicas a partir de biopsias endoscópicas para su uso en el estudio de enfermedades esofágicas o en la generación de modelos tridimensionales. No olvide que trabajar con instrumentos afilados y tejidos biológicos puede ser peligroso.

Asegúrese de desechar adecuadamente los instrumentos cortantes y siga buenas prácticas de bioseguridad.