MitoCeption: Transferencia hermoso humano MSC mitocondrias de las células madre de glioblastoma
22 de febrero de 2017
Aquí, un protocolo (MitoCeption) se presenta para transferir las mitocondrias, aislado a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC), a las células madre glioblastoma (GSC), con el objetivo de estudiar sus efectos biológicos sobre el metabolismo y funciones GSC. Un protocolo similar se puede adaptar para transferir mitocondrias entre otros tipos de células.
El objetivo general de este procedimiento es transferir mitocondrias previamente aisladas de células donantes, como las células madre mesenquimales, a células diana, como las células madre del glioblastoma. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo, como los efectos metabólicos y biológicos de las mitocondrias que se transfieren espontáneamente entre células mediante procesos como el túnel de nanotubos o microvesículas. La principal ventaja de esta técnica es que los efectos de las mitocondrias se pueden evaluar independientemente de otros factores presentes en el microambiente como citoquinas o metabolitos y también de otros compuestos que también pueden estar traficando en los nanotubos tunel.
Para fines de imagen, las mitocondrias MSC y GSC se pueden marcar con colorantes vitales antes de la transferencia de mitocondrias por MitoCeption. Para comenzar, después de preetiquetar las GSC con colorantes vitales de acuerdo con el protocolo de texto, recoja las neuroesferas de GSC en un tubo de 50 mililitros por centrifugación a 270 veces g a 20 grados Celsius durante cinco minutos. Use cinco mililitros de HBSS para lavar las células y vuelva a centrifugar el tubo.
Aspirar el sobrenadante y con 100 microlitros de 0,25%Trypsin-EDTA volver a suspender suavemente el pellet GSC. A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, agregue 10 microlitros de cloruro de calcio de 20 milimolares en dos microlitros a 10 miligramos por mililitro de DNasa I al tubo.
Disocie las neuroesferas utilizando una pipeta P200 para pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo de 30 a 50 veces, evitando la formación de burbujas. Añadir 10 microlitros de inhibidor de tripsina al 5% en 10 mililitros de HBSS a las células y centrifugar las GSC durante siete minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y 10 mililitros de medio basal GSC a la muestra.
Ahora, usando una cámara de conteo Thoma, cuente las celdas antes de volver a girar. Agregue el volumen apropiado de medio de proliferación GSC para alcanzar un concentrado celular de 10 a la sexta GSC por mililitro. A continuación, siembre de 10 a la quinta GSC por pocillo de una placa de 96 pocillos.
Centrifugar la placa para que los GSC se depositen en el fondo de los pozos. Revise las células bajo el microscopio. A continuación, incubar la placa a 37 grados centígrados.
Para llevar a cabo el aislamiento de las mitocondrias MSC, comience ajustando la temperatura de la microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Prepare dos tubos de 1,5 mililitros etiquetados como A y C que contengan reactivos para la extracción de mitocondrias. Prepare dos tubos adicionales etiquetados como MSC y MiTo.
Mantenga los tubos en hielo. También prepare tubos para las diluciones en serie de mitocondrias que se configurarán con la preparación de mitocondrias. Use 10 mililitros de PBS precalentado a 37 grados centígrados para lavar los MSC.
Luego, con dos mililitros de tripsina sin EDTA, lave las células durante 10 segundos y agregue un mililitro adicional de tripsina antes de incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. El uso de EDTA debe evitarse según el protocolo, en particular para la tripsinización de MSC y para el inhibidor de la proteasa utilizado en la preparación de las mitocondrias. Recupera los MSCs añadiendo 10 mililitros de Alpha MEM 10%FBS y transfiere la suspensión a un tubo de 50 mililitros.
A continuación, centrifuga las células. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de Alpha MEM 10%FBS al pellet de la celda. A continuación, utilice una cámara de recuento de Malassez para contar las MSC antes de girar hacia abajo cuatro o cinco veces 10 hasta la quinta celda.
Deseche el sobrenadante, agregue un mililitro de Alpha MEM 10%FBS helado al pellet de la celda y transfiera las células al tubo marcado con MSC previamente preparado mientras continúa manteniéndolo en hielo. A continuación, centrifugar el tubo MSC a 900 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y eliminar todo el medio residual del tubo. A continuación, agregue 200 microlitros de reactivo de aislamiento de mitocondrias A con inhibidores de proteasa libres de EDTA a las MSC y al vórtice a velocidad media durante cinco segundos.
A continuación, deje los tubos en hielo durante exactamente dos minutos. Agregue 2,5 microlitros de reactivo B de aislamiento de mitocondrias y agite las células a máxima velocidad durante 10 segundos antes de volver a colocar los tubos en hielo. Repita el vórtice cada 30 segundos durante cinco minutos.
Ahora, agregue 200 microlitros de reactivo de aislamiento de mitocondrias C con inhibidores de proteasa libres de EDTA al tubo y mezcle el contenido inclinando el tubo aproximadamente 30 veces. Centrifugar los tubos a 700 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante que contiene las mitocondrias MSC al tubo MiTo previamente preparado.
Centrifugar la muestra a 3.000 veces g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Después de desechar el sobrenadante, use 200 microlitros de reactivo C para enjuagar el gránulo mitocondrial. A continuación, gire la suspensión a 12.000 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos para pellet los orgánulos.
Para transferir mitocondrias MSC aisladas a GSC, agregue 200 microlitros de medio de proliferación GSC preenfriado al pellet mitocondrial. Diluir la preparación mitocondrial en el medio de proliferación de GSC para permitir consistentemente la adición de 20 microlitros de suspensión mitocondrial a las GSC. A continuación, agregue lentamente las mitocondrias cerca del fondo del pozo.
Para controlar la fuga de colorante vital de las mitocondrias MSC, agregue la misma cantidad de preparación de mitocondrias a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenga solo medio de proliferación de GSC. Centrifugar las placas a 1.500 veces g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. A continuación, coloque inmediatamente los cultivos a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, para analizar los pozos de control en busca de fugas de colorante vital, siembra las células GSC como se describió anteriormente, centrifuga la placa y luego incuba los cultivos a 37 grados Celsius durante una hora. Centrifugar la placa de 96 pocillos que contiene solo mitocondrias. A continuación, aspire el medio de la placa de pocillos GSC 96 y sustitúyalo por el sobrenadante mitocondrial.
Incubar las GSC con el sobrenadante mitocondrial a 37 grados centígrados durante dos horas. Por último, realizar análisis de transferencia de mitocondrias, análisis FACS e imágenes confocales según el protocolo de texto. Las GSC son células madre cancerosas que se cultivan como neuroesferas para preservar sus propiedades de células madre.
Justo antes de la transferencia mitocondrial, se siembran como células individuales para permitir una alta eficiencia de transferencia de mitocondrias y al día siguiente, como se muestra aquí, se observa que las células vuelven a formar neurosferas. En esta figura, se pueden ver mitocondrias MSC marcadas con fluorescencia localizadas dentro de las GSC Gb4. Las mitocondrias MSC aparecen en todas las GSC de manera similar a las mitocondrias GSC.
La transferencia de mitocondrias MSC se pudo observar en la mayoría de las GSC en la reconstrucción 3D a partir de imágenes confocales de GSC que confirman la localización intercelular de las mitocondrias MSC transferidas. El pre-marcaje de las GSC con colorantes vitales celulares azules y rojos permitió visualizar la localización de las mitocondrias MSC transferidas que se ven en verde en relación con las mitocondrias GSC endógenas. Como se muestra aquí, MitoCeption con cantidades crecientes de mitocondrias fluorescentes MSC condujo a un aumento de las señales FACS y con varios órdenes de magnitud más alto que la señal de control.
El protocolo de transferencia de mitocondrias presentado aquí, realizado en GSC de una sola célula, mostró una respuesta dependiente de la dosis y una intensidad de fluorescencia media relativa. Finalmente, aunque la transferencia de mitocondrias MSC también se logró en las neuroesferas de GSC, la eficacia de la transferencia a GSC en estas condiciones fue menor en comparación con las mitocondriales transferidas a GSC sembradas por primera vez como células individuales. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en tres horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la preparación de las mitocondrias en hielo en todo momento. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como FACS, microscopía confocal y QPCR en el ADN mitocondrial para visualizar y cuantificar la transferencia mitocondrial de MSC a las células objetivo. También se pueden realizar estudios funcionales para determinar los efectos biológicos de las mitocondrias transferidas.
Tenga en cuenta que estos estudios generalmente se realizarán con cantidades más bajas de mitocondrias que las que se usan para visualizar la transferencia de mitocondrias. Esta técnica permitirá explorar el resultado y los efectos biológicos de las mitocondrias que se transfieren espontáneamente entre las células, ya sea en condiciones fisiológicas o patológicas normales, y contribuirá así al desarrollo de nuevos tratamientos terapéuticos.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo denominado MitoCepción para transferir mitocondrias de células madre mesenquimales humanas (MSC) a células madre de glioblastoma (GSC). El objetivo es investigar los efectos biológicos de estas mitocondrias sobre el metabolismo y las funciones de las GSC.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Metabolismo
Antecedentes
- Las mitocondrias pueden transferirse entre células mediante mecanismos como los nanotúbulos de túnel.
- Esta transferencia puede influir en el metabolismo y la función celular.
- Comprender estos efectos puede proporcionar información sobre la biología del cáncer.
- La técnica permite la evaluación independiente de los efectos mitocondriales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la transferencia mitocondrial utilizando MSC y GSC.
- Explorar los impactos metabólicos y biológicos de las mitocondrias transferidas.
- Evaluar los efectos mitocondriales sin interferencia del microambiente.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de mitocondrias de MSC.
- Etiquetado de MSC y GSC con colorantes vitales.
- Centrifugación para recolectar neuroesferas de GSC.
- Transferencia de mitocondrias mediante el protocolo MitoCeption.
Resultados principales
- El protocolo transfiere con éxito mitocondrias entre tipos celulares.
- Se pueden monitorear los efectos biológicos de las mitocondrias transferidas.
- Es posible realizar una evaluación independiente de la función mitocondrial.
- Aplicaciones potenciales en el estudio del metabolismo del cáncer.
Conclusiones
- MitoCeption proporciona una herramienta valiosa para la investigación mitocondrial.
- Este método puede mejorar la comprensión del metabolismo celular en el cáncer.
- Estudios futuros pueden adaptar el protocolo para otros tipos celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transferencia mitocondrial entre células madre y células cancerosas representa un eje mecanicista en el metabolismo tumoral y la resistencia terapéutica. El protocolo MitoCeption permite la evaluación aislada de los efectos mitocondriales exógenos sobre células madre de glioblastoma, apoyando la reducción de riesgos en objetivos durante el descubrimiento de fármacos en oncología. Este enfoque proporciona un sistema controlado para evaluar la reprogramación metabólica y la plasticidad fenotípica inducidas por el intercambio mitocondrial.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la transferencia mitocondrial como hipótesis terapéutica en el metabolismo de las células madre del glioblastoma.
- Valor operativo: Aísla los efectos mitocondriales de factores de confusión del microentorno, como citocinas y metabolitos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante la cuantificación de la transferencia de ADN mitocondrial y mediciones funcionales mediante citometría de flujo y microscopía confocal.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera métricas de transferencia mitocondrial dependientes de la dosis mediante etiquetado fluorescente y citometría de flujo.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones de aislamiento y transferencia mitocondrial para un rendimiento reproducible del ensayo.
- Escalabilidad: Adaptable a formatos de placas de 96 pocillos para cribado de medio rendimiento de moduladores mitocondriales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la transferencia mitocondrial con alteraciones en la proliferación celular, plasticidad y respuesta a la terapia en las CSG.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de las mitocondrias transferidas mediante la cuantificación de ADNmt específico de haplotipo.
- Continuidad traslacional: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad para modelar el intercambio mitocondrial espontáneo en microentornos tumorales.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El protocolo MitoCeption se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, al permitir la investigación mecanicista de la transferencia mitocondrial antes de las etapas de validación del objetivo y optimización del fármaco candidato.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el intercambio mitocondrial como modulador de los fenotipos de células madre cancerosas.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas de fluorescencia y de imágenes para la estandarización de ensayos y la confirmación de resultados positivos.
- Análisis: Ofrece cuantificación del traslado mitocondrial basada en FACS y datos de localización confocal para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Relaciona las métricas de transferencia mitocondrial con resultados funcionales en modelos de proliferación y resistencia a la terapia.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de transferencia mitocondrial aplicable a múltiples combinaciones de células donantes y diana.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en hipótesis dirigidas a mitocondrias al aislar efectos específicos del orgánulo.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de aislamiento, marcado y transferencia mitocondrial.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al reducir los riesgos asociados a mecanismos mitocondriales en modelos de glioblastoma.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la eficacia de la transferencia mitocondrial y sus consecuencias funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, aislamiento de mitocondrias y métodos de detección basados en fluorescencia.
- Depende del acceso a centrífugas, citómetros de flujo, microscopios confocales e infraestructura para etiquetado con colorantes vitales.
- Necesita la estandarización de la calidad de la preparación mitocondrial y del momento de transferencia entre lotes experimentales.
- La adaptación a células diana en neuroesferas frente a monocapas requiere la optimización de las condiciones de disociación y siembra.
- Las limitaciones prácticas incluyen una eficiencia de transferencia menor en cultivos de neuroesferas en comparación con preparaciones de células individuales disociadas.
