Name: Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende a aislar mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial y medir las tasas respiratorias de los complejos I, II y IV mediante respirometría de alta resolución. Este método permite estudiar la bioenergética mitocondrial.

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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Grant 32003B_127619).

La biopsia del músculo cuádriceps se ha tomado de un cerdo anestesiado, a partir del cual las mitocondrias se aíslan mediante centrifugación diferencial. El cerdo se utiliza después para otro experimento. El estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales de experimentación y con la aprobación del Comité de Cuidado de Animales del cantón de Berna, Suiza. 1. La homogeneización del músculo esquelético y aislamiento mitocondrial <ol><li> Impuestos Especiales 5-10 g de muestras de músculo cuadriceps de un cerdo anestesiado. En el presente ensayo, utilizar el músculo esquelético porcino. Este protocolo también se puede utilizar para aislar las mitocondrias a partir de otras especies (por ejemplo, rata, ratones, humanos, etc.). NOTA: Este paso se lleva a cabo por un médico especialista con experiencia en cirugía. <ol><li> cerdos Sedate con ketamina intramuscular (20 mg / kg) y xilazina (2 mg / kg), antes de la anestesia se induce con intramidazolam venosa (0,5 mg / kg, más atropina 0,02 mg / kg). Mantener la anestesia con infusiones continuas intravenosas de propofol (4-8 mg / kg por h) y fentanilo (30 g / kg por h) durante la cirugía. </li></ol></li><li> Inmediatamente sumergir la muestra de tejido en un vaso de precipitados que contiene 20 ml de tampón de aislamiento mitocondrial enfriado con hielo (Tabla 1). NOTA: Los tampones utilizados durante la homogeneización y centrifugaciones deben ser enfriado en hielo y tienen un pH pertinente fisiológico con una fuerza iónica y osmótica compatible con citosol. </li><li> Pesar la muestra de tejido en el vaso de precipitados en una balanza analítica tarado. Tarar la balanza con el vaso que contiene 20 ml de tampón de aislamiento. </li><li> Colocar el vaso en un cubo de hielo. NOTA: Realizar todos los pasos a seguir para el procedimiento de homogeneización a la temperatura cubo de hielo y mantener todos los buffers en el cubo de hielo. </li><li> Picar el músculo esquelético en el vaso (mantener en hielo) en 1-2 mm trozos pequeños de 3-4 min usando bien scissORS. </li><li> Enjuague el tejido picado en el vaso de precipitados dos veces con tampón de aislamiento frío hielo (20 ml cada etapa de lavado). </li><li> Suspender el tejido en 10 volúmenes del tampón de aislamiento por el peso del tejido (g) que contiene 5 mg de proteasa / g de tejido. </li><li> Colocar el vaso de precipitados en un baño de hielo en el agitador magnético y se agita durante 10 min. </li><li> Diluir la suspensión en el vaso de precipitados con 10 volúmenes adicionales de la memoria intermedia de aislamiento por el peso del tejido (g) suplementado con 0,2% (peso / volumen) de albúmina de suero bovino sin grasa (BSA). </li><li> Decantar todo el tampón de aislamiento suplementado con 0,2% de BSA y enjuagar el tejido en el vaso de precipitados dos veces con tampón de aislamiento frío hielo suplementado con 0,2% de BSA (20 ml cada etapa de lavado). </li><li> Resuspender el tejido en 10 volúmenes de tampón de aislamiento por el peso del tejido (g) suplementado con 0,2% con BSA desgrasada. </li><li> Homogeneizar el tejido con un homogeneizador de vidrio semi-automático (mantener en hielo) con una mano de mortero holgada (10 golpes). NOTA: Homogenize el tejido siempre de la misma manera (el mismo número de golpes, por ejemplo, 10 golpes). Un mayor número de golpes puede dañar y desacoplar las mitocondrias. Preferiblemente, homogeneizar el tejido usando un homogeneizador automatizado. Manualmente (y subjetivamente) muestras de tejido homogeneizadas en homogeneizadores de vidrio pueden producir diferentes calidades de mitocondrias aisladas. </li><li> Centrifugar el tejido homogeneizado a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g. NOTA: Todas las etapas de centrifugación se llevan a cabo en centrífugas con rotor de ángulo fijo. </li><li> Descartar el sobrenadante usando una pipeta serológica y volver a suspender el sedimento en medio de aislamiento enfriado con hielo suplementado con BSA (10 ml / g de tejido). </li><li> Centrifugar la suspensión a 4 ° C durante 10 minutos a 350 x g. </li><li> Reservar el sobrenadante con una pipeta serológica y desechar el sedimento (restos celulares). </li><li> Filtrar el sobrenadante a un vaso de precipitados (mantener en hielo) a través de dos capas de gasa (17 hilos / cm 2) para eliminar Debr célulaes. </li><li> Centrifugar la suspensión se filtró a 4 ° C durante 10 minutos a 7000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet mitocondrial crudo en el tampón de aislamiento (5 ml / g de tejido) suplementado con 0,2% (peso / volumen) de BSA y centrifugar la suspensión a 4 ° C durante 10 minutos a 7000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet mitocondrial crudo en tampón de lavado (Tabla 1). Centrifugar la suspensión de nuevo a 4 ° C durante 10 minutos a 7000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet mitocondrial crudo en tampón de lavado y se centrifuga de nuevo la suspensión a 4 ° C durante 10 minutos a 7000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet mitocondrial crudo en 1,0 ml de tampón de lavado. </li><li> Determinar la concentración de proteína de la suspensión mitocondrial y mantener la suspensión mitocondrial concentrado en hielo. NOTA: La concentración de proteína se puede medir usando cualquier método estándar. </li><li> Justo antesa respirometría ensayos, resuspender la suspensión mitocondrial en el tampón de respiración a una concentración final de 0,4 mg de proteína mitocondrial / ml. </li></ol> 2. alta resolución Respirometría <ol><li> Pipetear 2,1 ml de tampón de respiración (Tabla 1) 16 en una cámara de oxygraph de alta resolución y se agita la memoria intermedia continuamente utilizando una barra de agitación magnética presente en la cámara (700 rpm) a 37 ° C durante 1 h hasta que una señal de flujo de oxígeno estable de se obtiene el sensor de oxígeno polarográfico. NOTA: electrodos de oxígeno polarográficos dentro de cada cámara de oxygraph miden la concentración de oxígeno y calcular el consumo de oxígeno (flujo) dentro de cada cámara. La concentración de oxígeno y las tasas de consumo de oxígeno (flujo) se visualizan en tiempo real en línea en un ordenador utilizando el software de adquisición y análisis de datos. Además, con el fin de asegurar resultados precisos y fiables, oxígeno instrumentales corrección de fondo debe serrealizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: con precisión 2,1 ml de tampón de la respiración se añade en la cámara para la calibración de un volumen de la cámara final de 2,0 ml después de cerrar los tapones. </li><li> Realizar una calibración de aire del sensor de oxígeno polarográfico de acuerdo con los protocolos del fabricante 17. NOTA: Durante la calibración de aire, con una fase gaseosa presente, la concentración de oxígeno se equilibrará los medios de comunicación del orden de 15-20 min. Dependiendo de la temperatura, la presión barométrica, y la solubilidad de la concentración de medios -oxygen se puede calcular. </li><li> Después de la calibración de aire, aspirar el medio de la respiración de la cámara oxygraph y añadir 2,1 ml de la suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml de proteína mitocondrial) de la etapa 1.24 a una cámara de la oxygraph. NOTA: El volumen de tampón de la respiración depende de la configuración del instrumento y del fabricante. Para alta resolución respirometría, los 2,1 ml de bu respiraciónffer se añade en la cámara para la calibración de un volumen de la cámara final de 2,0 ml después de cerrar los tapones. </li><li> Cierre de la cámara de oxygraph mediante la inserción del tapón. </li><li> Agitar la suspensión mitocondrial continuamente usando una barra magnética de agitación presente en la cámara (700 rpm) a 37 ° C y la respiración celular registro al inicio del estudio durante 3-5 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. NOTA: La concentración de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se visualizan en tiempo real en línea en un ordenador utilizando el software de adquisición y análisis de datos 17. </li><li> Después, inyectar sustratos e inhibidores de la respiración mitocondrial a través de los puertos de inyección de titanio de los tapones usando los siguientes protocolos estándar. </li></ol> 3. Respiración Complejo I-dependiente <ol><li> Preparar una cámara de oxygraph que contiene la suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 2.1-2.5 yesperar una señal estable. </li><li> Inyectar 12,5 l de 0,8 M malato de (5 mM de concentración final) y 10 l de glutamato 2 M (10 mM de concentración final) en la cámara de oxygraph que contiene suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml) a través del puerto de inyección de titanio del tapón de cámara y grabar la respiración celular durante 3-5 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable. NOTA: Todas las inyecciones en los siguientes pasos se realizan a través de los puertos de inyección de titanio de tapones utilizando jeringas. </li><li> Inyectar 10 l de 0,05 M ADP (0,25 mM) en la cámara de oxygraph a través del puerto de inyección de titanio del tapón de cámara y grabar hasta que la respiración mitocondrial se incrementa la señal de flujo de oxígeno, entonces disminuye y se estabiliza (3-5 min). NOTA: La meseta de la respiración después de la adición de ADP indica que la concentración de ADP era alto y de saturación. Dependiendo de la cantidad de las mitocondrias utilizados durante la respiración, la concentración de ADP debe ajustarsepara un consumo de oxígeno estable el estado 3 (respiración máxima). La adición de ADP a la suspensión mitocondrial inducirá un aumento del consumo de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se incrementará (estado 3 respiración). Después de que se consume el ADP, la señal de flujo de oxígeno disminuirá (respiración de estado 4). </li></ol> 4. La respiración II dependiente Complex <ol><li> Preparar una cámara que contiene oxygraph suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 2.1-2.5 y esperar a una señal estable. </li><li> Inyectar 2 l de rotenona 0,2 mM (0,2 mM) &#39;PRECAUCIÓN&#39; en la cámara de oxygraph a través del puerto de inyección de titanio del tapón cámara usando una jeringa y registrar la respiración celular durante 3-5 minutos hasta que se consigue una señal de flujo de oxígeno estable. NOTA: La rotenona es un veneno peligroso y puede tener un impacto significativo en la salud humana. </li><li> Inyectar 20 l de 1 M de succinato (10 mM) en el cap oxygraphse logra ámbar y la respiración mitocondrial récord de 3-5 minutos hasta que una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Inyectar 10 l de 0,05 M ADP (0,25 mM) en la cámara de oxygraph a través del puerto de inyección de titanio del tapón de cámara y grabar la respiración celular hasta que se incrementa la señal de flujo de oxígeno, estabiliza, entonces disminuye y se estabiliza (3-5 min). NOTA: La adición de ADP a la suspensión mitocondrial inducirá un aumento del consumo de oxígeno y la señal de flujo de oxígeno se incrementará (estado 3 respiración). Después de que se consume el ADP, la señal de flujo de oxígeno disminuirá (respiración de estado 4). </li></ol> 5. Complejo respiración IV-dependiente <ol><li> Preparar una cámara que contiene oxygraph suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los puntos 2.1 a 2.5 del protocolo y esperar una señal estable. </li><li> Entonces inyectar 2,5 l de ascorbato 0,8 mM (1 mM). Inmediatamente después inyectar 2,5 l de 0,2M TMPD (0,25 mM) y 10 l de 0,05 M ADP (0,25 mM) en la cámara de oxygraph y la respiración celular registro hasta que el oxígeno aumenta la señal de flujo y estabiliza (3-5 min). </li><li> Finalmente inyectar 10 l de azida de sodio 1 M (5 mM) &#39;PRECAUCIÓN&#39; en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular hasta que la señal disminuye el flujo de oxígeno y se estabiliza. NOTA: La azida sódica es un veneno peligroso y puede tener un impacto significativo en la salud humana. </li></ol> 6. El citocromo C de prueba <ol><li> Preparar una cámara que contiene oxygraph suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml) siguiendo el procedimiento descrito en los puntos 2.1 a 2.5 del protocolo y esperar una señal estable. </li><li> Inyectar 12,5 l de 0,8 M malato de (5 mM de concentración final) y 10 l de glutamato 2 M (10 mM de concentración final) en la cámara que contiene oxygraph suspensión mitocondrial aislado (0,4 mg / ml) a través del puerto de inyección de titanio del tapón de cámara dey registrar la respiración celular durante 3-5 minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. </li><li> Inyectar 10 l de 0,5 M ADP (2,5 mM) en la cámara de oxygraph a través del puerto de inyección de titanio del tapón de cámara y la respiración mitocondrial registro hasta la señal aumenta el flujo de oxígeno, entonces disminuye y se estabiliza (3-5 min). </li><li> Finalmente, inyectar 5 l de 4 mM citocromo c (10 mM) en la cámara de oxygraph y registrar la respiración celular de 5 min hasta que se alcanza una señal de flujo de oxígeno estable. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente estudio se describe un protocolo para aislar de alta calidad, intactos y bien acoplados mitocondrias de músculo esquelético por centrifugación diferencial que pueden ser utilizados para estudios funcionales tales como de alta resolución respirometría. Con el fin de aislar las mitocondrias intactas y bien acoplados, hay algunos puntos críticos que deben ser considerados en el presente protocolo. Después de cosechar el tejido esquelético, debe ser sumergido inmediatamente en tam...

bioenergética mitocondrial y capacidades respiratorias pueden ser estudiados no sólo en las células permeabilizadas o fibras, sino también en las mitocondrias aisladas. En el presente estudio, se describe un protocolo para aislar las mitocondrias del músculo esquelético intactas utilizando centrifugación diferencial para las mediciones de respirometría de alta resolución. Para aislar las mitocondrias intactas para respirometría, el tejido se homogeneiza y mitocondrias están aislados por un método de centrifugación diferencial convencional. El método de centrifugación diferencial se basa en centrifugaciones secuenciales (en una serie de aumentar la velocidad) del tejido homogeneizado fue introducido por primera vez por Pallade y compañeros de trabajo hace casi 70 años 1. El tejido se pica primero con unas tijeras y se homogeneiza mecánicamente en un homogeneizador de vidrio con una mano de mortero holgada. Después, el homogeneizado se centrifugó a baja velocidad y el sedimento resultante que contiene tejido ininterrumpida, celularescombros y los núcleos se desecha. Entonces, el sobrenadante se centrifugó varias veces a alta velocidad y se recoge la fracción enriquecida mitocondrial. Las ventajas del método de centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias son que: i) el método es rápido y mitocondrias se puede aislar dentro de 1-1,5 h (experimentos respiratorias deben realizarse lo más rápido posible); ii) que es barato; y iii) es muy eficiente y las mitocondrias obtenidos por centrifugación diferencial son lo suficientemente puro para los ensayos de respirometría. Las desventajas de método de centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias son que: i) las mitocondrias podrían dañarse y desacoplado durante la homogeneización; ii) la contaminación de las mitocondrias con otros componentes celulares (se podría solucionar por lavado adicional el sedimento mitocondrial con etapas de centrifugación adicionales); iii) la posibilidad de seleccionar diferentes subpoblaciones mitocondriales, por ejemplo, durante centrifugaciones diferenciales pasos, mitochondria con menor densidad se puede excluir 7; y iv) la mitocondrial circundante celular que falta y sólo la respiración máxima teórica se puede medir. Otro método para aislar las mitocondrias para los ensayos de respirometría es el gradiente de densidad de centrifugación 2. En esta técnica, el extracto de tejido se coloca en capas sobre una solución de sacarosa o un gradiente de Percoll (con una mayor densidad en la parte inferior del tubo de centrifugación) y se centrifugó a una velocidad determinada, haciendo que las mitocondrias que ser aislado de otros componentes celulares de acuerdo con su densidades. Este método se utiliza a menudo para aislar las mitocondrias del cerebro con muy baja contaminación de sinaptosomas. Sin embargo, las mitocondrias de hígado de rata aislados por centrifugación en gradiente de densidad están altamente contaminados con otros orgánulos celulares 3. Una de las limitaciones de este método es que el gradiente de sacarosa presente en el tubo de centrifugación podría romperse tanMe mitocondrias (choque osmótico). Dependiendo del tipo de tejido; hay algunos factores importantes a considerar para el aislamiento de las mitocondrias intactas por centrifugación diferencial. La primera necesidad es para homogeneizar los tejidos de una manera suave. Los tejidos blandos tales como riñón, hígado y cerebro requieren fuerzas mecánicas suaves aplicadas durante la homogeneización. Esto contrasta con los tejidos duros, tales como el músculo cardíaco y esquelético que requieren fuerzas mecánicas mucho más fuerte. El tejido picado se trata generalmente con proteinasa antes de la homogeneización para suavizar el tejido. Todos los tampones utilizados durante la homogeneización y centrifugación debe ser enfriado en hielo y tienen un pH pertinente fisiológico con una fuerza iónica y osmótica compatible con citosol 4, 5. Una de las ventajas de estudiar aislados bioenergética mitocondrial es que las membranas de plasma celular no necesitan ser permeabilized con detergentes tales como digitonina o saponina 4, 6, que podrían comprometer la integridad de la membrana externa mitocondrial. Otra ventaja de la mitocondrias aisladas es la ausencia de otros factores citosólicos, que pueden interferir con el análisis de las funciones mitocondriales tales como el consumo de oxígeno. Las desventajas de utilizar la mitocondria aisladas son la posible selección de ciertas poblaciones mitocondriales durante los pasos de centrifugación, el daño a la mitocondria durante la homogeneización, y el requisito de grandes cantidades de muestras biológicas con el fin de obtener un buen rendimiento de mitocondrias aisladas 7, 8. Después de que el procedimiento de aislamiento, las tasas respiratorias de los complejos mitocondriales I, II- y IV-dependientes (estados 2, 3 y 4) se determinan mediante respirometría de alta resolución. Por complejo impulsado I respiración, glutamatoy malato se añaden seguido por difosfato de adenosina (ADP). Para la respiración complejo II-conducido, succinato es seguido de la ADP. Para el complejo IV impulsada por la respiración, ascorbato y tetramethylphenylendiamine (DPMT) se añaden seguido por ADP 9, 10, 11, 12. Estado 2 se refiere a consumo de oxígeno en la presencia de sustratos solo. Estado 3 se refiere a consumo de oxígeno en la presencia de sustratos y ADP. Estado 4 se refiere al consumo de oxígeno después de la depleción de ADP. La relación del control respiratorio (RCR) es un índice de acoplamiento de la producción de ATP consumo de oxígeno y se calcula como la relación entre el estado 3 y el estado 4 13, 15. En resumen, se describe un protocolo para aislar las mitocondrias del músculo esquelético y funcionales intactas por centrifugación diferencial y utilizar estos mitochon aisladodría para los estudios funcionales y bioenergéticos como respirometría de alta resolución.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Químico, disuelto en etanol</td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Químico</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>Químico</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Químico</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma,G</td> <td>1626</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Químico</td></tr><tr><td>K-lactobionato</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Químico</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfónico de morfolinopropano químico (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td>Núcleo químico</td></tr><tr><td>de O2k: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrumento de respirometría de alta resolución</td></tr><tr><td>Proteinasa bacteriana</td><td></td><td>Sigma P 8038</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Químico, disuelto en etanol</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Schuett homogen-plus homogeneizador semiautomático&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>Homogeneizador de tejidos</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemical</td></tr></tbody></table>

aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para medidas respirometría de alta resolución

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Las mitocondrias están involucradas en el metabolismo energético celular y utilizan el oxígeno para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP). La centrifugación diferencial a baja y alta velocidad se usa comúnmente para aislar mitocondrias de tejidos y células cultivadas. Las fracciones mitocondriales brutas obtenidas por centrifugación diferencial se utilizan para las mediciones de la respirometría. La técnica de centrifugación diferencial se basa en la separación de orgánulos según su tamaño y velocidad de sedimentación. El aislamiento de las mitocondrias se realiza inmediatamente después de la recolección de tejidos. El tejido se sumerge en un medio de homogeneización helado, se pica con tijeras y se homogeneiza en un homogeneizador de vidrio con un mortero holgado. La técnica de centrifugación diferencial es eficiente, rápida y económica y las mitocondrias obtenidas por centrifugación diferencial son lo suficientemente puras para los ensayos de respirometría. Algunas de las limitaciones y desventajas de las mitocondrias aisladas, basadas en la centrifugación diferencial, son que las mitocondrias pueden dañarse durante el procedimiento de homogeneización y aislamiento y que se requieren grandes cantidades de biopsia de tejido o células cultivadas para el aislamiento mitocondrial.

Complejo I-dependiente de la respiración Aislado tasas mitocondriales complejos I dependiente de las vías respiratorias (estados 2, 3 y 4) se determinan usando respirometría de alta resolución (Figura 1, un diagrama representativo). sustratos complejo I mitocondrial, glutamato y malato, se añaden seguidos por la adición de ADP. Estado 2 se refiere a consumo de oxígeno en presencia de los sustr...

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar mitocondrias del músculo esquelético mediante centrifugación diferencial y determinar las tasas respiratorias de los complejos I, II y IV de la cadena respiratoria mitocondrial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioenergética mitocondrial, como las enfermedades y síndromes asociados con la disfunción mitocondrial, por ejemplo diversas enfermedades neurológicas, sepsis y trastornos relacionados con la edad. La principal ventaja de esta técnica es la ausencia de la mayoría de los factores citológicos en la preparación mitocondrial aislada, los cuales podrían interferir con el análisis de las funciones mitocondriales. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sandra Nansoz, la técnica de mi laboratorio.Para comenzar este procedimiento, obtenga un vaso con muestras de músculo esquelético según se describe en el protocolo escrito. Coloque el vaso sobre un recipiente con hielo. Utilizando tijeras finas, corte el músculo en trozos de uno a dos milímetros de tamaño.A continuación, lave el tejido picado dos veces con tampón de aislamiento frío con hielo, utilizando 20 mililitros para cada lavado. Suspenda el tejido lavado en 10 mililitros de tampón de aislamiento por gramo de tejido y luego agregue cinco miligramos de proteasa-G tisular. A continuación, coloque el vaso en un baño de hielo con un agitador magnético y agite durante 10 minutos.A continuación, diluya la suspensión con 10 mililitros adicionales de tampón de aislamiento suplementado con BSA desengrasada al 0,2% por gramo de tejido. Luego, vierta cuidadosamente todo el tampón de aislamiento del vaso de precipitados. Lave el tejido dos veces con tampón de aislamiento frío con hielo suplementado con BSA al 0,2%, utilizando 20 mililitros para cada lavado.Luego, re-suspenda el tejido en 10 mililitros de tampón de aislamiento suplementado con BSA por gramo de tejido. Utilice un homogenizador de vidrio semiautomático con un pistilo holgado para homogeneizar el tejido. A continuación, transfiera el homogenado a un tubo de centrifugación y centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Utilizando una pipeta serológica, deseche el sobrenadante. Re-suspenda el precipitado con 10 mililitros de medio de aislamiento suplementado con BSA frío con hielo por cada gramo de tejido. Centrifugue la suspensión a 350 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.A continuación, utilice una pipeta serológica para reservar el sobrenadante, descartando el precipitado. Filtre el sobrenadante en un vaso de precipitados colocado sobre hielo a través de dos capas de gasa. Transfiera la suspensión filtrada a un tubo de centrífuga y centrifugue a 7.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.Luego deseche el sobrenadante. Re-suspenda el sedimento mitocondrial crudo en cinco mililitros de tampón de aislamiento suplementado con BSA por gramo de tejido. Centrifugue esta suspensión a 7.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.A continuación, deseche el sobrenadante y re-suspenda el sedimento en 20 mililitros de tampón de lavado. Centrifugue a 7.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Repita este proceso de re-suspensión y centrifugación una vez más.Después de esto, deseche el sobrenadante y re-suspenda el precipitado en un mililitro de tampón de lavado. Determine la concentración de proteína utilizando cualquier método estándar. Luego, mantenga la suspensión mitocondrial concentrada en hielo hasta que esté listo para realizar los ensayos de respirometría.Para comenzar, re-suspenda el concentrado mitocondrial en el tampón de respiración hasta una concentración final de 0,4 miligramos por mililitro de proteína mitocondrial. A continuación, aspire el medio de respiración de la cámara del oxígrafo calibrada al aire. Añada 2,1 mililitros de la suspensión mitocondrial aislada.Inserte un tapón para cerrar la cámara del oxígrafo. Luego, agite continuamente la suspensión mitocondrial a 700 RPM a 37 grados Celsius. Registre la respiración celular en la línea base durante tres a cinco minutos hasta que se obtenga una señal estable de flujo de oxígeno.Para iniciar la respiración dependiente del complejo I, inyecte 12,5 microlitros de malato 0,8 molar en una cámara de oxigrafía preparada con la suspensión mitocondrial aislada a través del puerto de inyección de titanio del tapón. Luego, inyecte 10 microlitros de glutamato 2 molar. Registre la respiración celular durante tres a cinco minutos hasta que se logre una señal estable de flujo de oxígeno.A continuación, inyecte 10 microlitros de ADP 0,05 molar en la cámara a través del puerto de inyección. Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente, luego disminuya y se estabilice. Para la respiración dependiente del complejo II, inyecte dos microlitros de rotenona 0,2 milimolar en una cámara de oxigrafía preparada con una suspensión de mitocondrias aisladas.Registre la respiración celular hasta que se alcance una señal estable de flujo de oxígeno. Luego, inyecte 20 microlitros de succinato unimolar. Registre la respiración celular hasta que se alcance una señal estable de flujo de oxígeno.A continuación, inyecte 10 microlitros de ADP 0,05 molar en la cámara a través del puerto de inyección. Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente, luego disminuya y se estabilice. Para la respiración dependiente del complejo IV, inyecte 2,5 microlitros de ascórbato 0,8 milimolar en una cámara de oxigrafía preparada con una suspensión de mitocondrias aisladas.A continuación, inyecte inmediatamente 2,5 microlitros de TMPD 0,2 molar y 10 microlitros de ADP 0,05 molar. Registre la respiración celular hasta que se alcance una señal estable de flujo de oxígeno. Luego, inyecte 10 microlitros de azida sódica 1 molar.Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y luego se estabilice. En este estudio, se aíslan mitocondrias intactas del músculo esquelético. Luego, se miden las tasas respiratorias dependientes del complejo I mediante respirometría de alta resolución.Como puede observarse, la tasa de respiración mitocondrial aumenta inmediatamente tras la adición de ADP. La tasa de respiración disminuye después del agotamiento de ADP hasta niveles similares a los observados antes de la adición de ADP. Esto indica que la relación entre el estado 3 y el estado 4, conocida como relación de control respiratorio o RCR, es alta y que la integridad mitocondrial se conserva adecuadamente durante el procedimiento de aislamiento.Las tasas respiratorias dependientes del complejo II se observan entonces inhibiendo la respiración del complejo I con rotenona e inyectando el sustrato del complejo II, succinato. A continuación, se añade ADP, lo que provoca un aumento inmediato de la respiración. Una vez que el ADP se agota, la respiración disminuye hasta niveles similares a los observados antes de la adición de ADP, lo que indica un alto RCR, ya que la integridad mitocondrial se conserva adecuadamente durante el aislamiento.Las tasas de respiración dependientes del complejo IV se observan mediante la adición de ascorbato, TMPD y ADP. Luego se añade azida sódica para inhibir el complejo IV. La diferencia en el consumo de oxígeno antes y después de la adición de azida sódica se interpreta como la respiración real del complejo IV. La alta tasa de respiración dependiente del complejo IV observada en el estado 3 indica que la integridad mitocondrial está bien preservada durante el procedimiento de aislamiento.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora y media si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar una calibración de los sensores de oxígeno con anticipación antes de la homogenización. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como mediciones del contenido celular de ADP, del potencial de membrana mitocondrial o de la actividad enzimática de la ATP sintasa como niveles de sustrato, con el fin de responder preguntas adicionales, como si los cambios en las tasas respiratorias se deben a la falta de sustrato mitocondrial, al potencial de membrana o a una actividad enzimática reducida de la ATP sintasa.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar mitocondrias de un músculo esquelético mediante centrifugación diferencial y cómo medir las tasas respiratorias de los complejos mitocondriales I, II y IV utilizando respirometría de alta resolución. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo energético mitocondrial exploraran la función energética de las mitocondrias en áreas como enfermedades mitocondriales genéticas, miopatías y lesión por isquemia-reperfusión en mitocondrias aisladas. No olvide que trabajar con antimicina A, rotenona, azida de sodio y FCCP puede ser extremadamente peligroso.Y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y batas de laboratorio, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Biología

Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de...

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es &lt;30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Las mitocondrias son orgánulos metabólicos clave que exhiben un alto nivel de plasticidad fenotípica en el músculo esquelético. La importación de proteínas del citosol es una vía crítica para la biogénesis de orgánulos, esencial para la expansión del retículo y el mantenimiento de la función mitocondrial.  Por lo tanto, la importación de proteínas sirve como un barómetro de la salud celular.

Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Los caballos tienen una capacidad excepcional de ejercicio aeróbico, lo que hace que el músculo esquelético equino sea un tejido importante tanto para el estudio de la fisiología del ejercicio equino como para la fisiología mitocondrial de los mamíferos. Este artículo describe técnicas para la evaluación integral de la función mitocondrial en el músculo esquelético equino.

Fluoro-respirometría de alta resolución del músculo esquelético equino

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores 

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Se describe aquí un método para medir directamente las chispas de calcio, las unidades elementales de la liberación de Ca2 + desde el retículo sarcoplásmico en las fibras musculares esqueléticas intactas. Este método utiliza osmótica estrés mediada por activación de Ca 2 + liberación del receptor de rianodina en fibras musculares aisladas. La dinámica y la capacidad homeostática del Ca2 + intracelular de señalización pueden emplearse para evaluar la función muscular en la salud y la enfermedad.

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Aprende a aislar mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial y medir las tasas respiratorias de los complejos I, II y IV mediante respirometría de alta resolución. Este método permite estudiar la bioenergética mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución (Video) | JoVE Journal

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