Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

El objetivo general de este procedimiento es aislar las mitocondrias del músculo esquelético mediante centrifugación diferencial y determinar las tasas respiratorias de los complejos de cadena respiratoria mitocondrial I, II y IV. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo bioenergético mitocondrial, como enfermedades y síndromes asociados con la disfunción mitocondrial, como diversas enfermedades neurológicas, sepsis y trastornos relacionados con la edad. La principal ventaja de esta técnica es la ausencia de la mayoría de los factores citológicos en la preparación mitocondrial aislada, lo que puede interferir con el análisis de las funciones mitocondriales. La comprobante del procedimiento estará a cargo de Sandra Nansoz, la técnica de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, obtenga un vaso de precipitados con muestras de músculo esquelético como se describe en el protocolo de texto. Coloque el vaso de precipitados en una cubeta de hielo. Con unas tijeras finas, pica el músculo en pedazos de uno a dos milímetros de tamaño.

A continuación, enjuague el tejido picado dos veces con tampón de aislamiento helado usando 20 mililitros para cada lavado. Suspenda el tejido lavado en 10 mililitros de tampón de aislamiento por gramo de tejido y luego agregue cinco miligramos de tejido proteasa-G. A continuación, coloque el vaso de precipitados en un baño de hielo con un agitador magnético y remueva durante 10 minutos.

Después de esto, diluya la suspensión con 10 mililitros adicionales de tampón de aislamiento suplementado con BSA desgrasado al 0,2% por gramo de tejido. A continuación, decantar todo el búfer de aislamiento del vaso de precipitados. Lave el pañuelo dos veces con tampón de aislamiento helado complementado con 0,2% de BSA utilizando 20 mililitros para cada lavado.

A continuación, vuelva a suspender el tejido en 10 mililitros de tampón de aislamiento suplementado con BSA por gramo de tejido. Utilice un homogeneizador de vidrio semiautomático con un mortero suelto para homogeneizar el tejido. A continuación, transfiera el homogeneizado a un tubo de centrifugación y centrifugue a 10.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Con una pipeta serológica, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con 10 mililitros de medio de aislamiento helado suplementado con BSA por gramo de tejido. Centrifugar la suspensión a 350 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de esto, use una pipeta serológica para reservar el sobrenadante, desechando el pellet. Filtre el sobrenadante en un vaso de precipitados mantenido en hielo a través de dos capas de gasa. Transfiera la suspensión filtrada a un tubo de centrífuga y centrifuga 7.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet mitocondrial crudo en cinco mililitros de tampón de aislamiento suplementado con BSA por gramo de tejido. Centrifugar esta suspensión 7.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de tampón de lavado. Centrifugar a 7.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Repita este proceso de resuspensión y centrifugación una vez más.

Después de esto, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado. Determine la concentración de proteínas utilizando cualquier método estándar. Luego, mantenga la suspensión mitocondrial concentrada en hielo hasta que esté lista para realizar los ensayos de respirometría.

Para empezar, vuelva a suspender el concentrado mitocondrial en el tampón de respiración hasta una concentración final de 0,4 miligramos por mililitro de proteína mitocondrial. A continuación, aspire el medio de respiración de la cámara de oxígrafo calibrada con aire. Añadir 2,1 mililitros de suspensión mitocondrial aislada.

Inserte un tapón para cerrar la cámara del oxígrafo. Luego, agite la suspensión mitocondrial continuamente a 700 RPM a 37 grados centígrados. Registre la respiración celular al inicio del estudio durante tres a cinco minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.

Para comenzar la respiración compleja dependiente del I, inyecte 12,5 microlitros de malato 0,8 molar en una cámara de oxígrafo preparada con la suspensión mitocondrial aislada a través del puerto de inyección de titanio del tapón. Luego, inyecte 10 microlitros de glutamato de dos molares. Registre la respiración celular durante tres a cinco minutos hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.

Después de esto, inyecte 10 microlitros de ADP 0.05 molar en la cámara a través del puerto de inyección. Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente, luego disminuya y se estabilice. Para la respiración dependiente del complejo II, inyecte dos microlitros de rotenona 0,2 milimolar en una cámara de oxígrafo preparada con suspensión mitocondrial aislada.

Registre la respiración celular hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. Luego, inyecte 20 microlitros de un molar de succinato. Registre la respiración celular hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable.

Después de esto, inyecte 10 microlitros de ADP 0.05 molar en la cámara a través del puerto de inyección. Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente, luego disminuya y se estabilice. Para la respiración compleja dependiente de IV, inyecte 2,5 microlitros de ascorbato de 0,8 milimolar en una cámara de oxígrafo preparada con suspensión mitocondrial aislada.

A continuación, inyecte inmediatamente 2,5 microlitros de TMPD 0,2 molar y 10 microlitros de ADP 0,05 molar. Registre la respiración celular hasta que se logre una señal de flujo de oxígeno estable. Luego, inyecte 10 microlitros de azida de sodio molar.

Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y luego se estabilice. En este estudio, las mitocondrias intactas se aíslan del músculo esquelético. A continuación, se miden las frecuencias respiratorias dependientes del complejo I mediante respirometría de alta resolución.

Como se puede observar, la tasa de respiración mitocondrial aumenta inmediatamente después de la adición de ADP. La tasa respiratoria disminuye después de la depleción de ADP a niveles similares a los observados antes de la adición de ADP. Esto indica que la relación entre el estado 3 y el estado 4, conocida como relación de control respiratorio, o RCR, es alta y que la integridad mitocondrial se conserva bien durante el procedimiento de aislamiento.

A continuación, se observan las frecuencias respiratorias dependientes del complejo II mediante la inhibición de la respiración del complejo I con rotenona y la inyección del sustrato del complejo II, el succinato. A continuación, se añade ADP, lo que da lugar a un aumento inmediato de la respiración. Una vez que se agota el ADP, la respiración disminuye a niveles similares a los observados antes de la adición de ADP, lo que indica un RCR alto, en el sentido de que la integridad mitocondrial se conserva bien durante el aislamiento.

Las tasas respiratorias complejas dependientes de IV se observan mediante la adición de ascorbato, TMPD y ADP. A continuación, se añade azida de sodio para inhibir el complejo IV. La diferencia en el consumo de oxígeno antes y después de la adición de azida de sodio se interpreta como la respiración IV compleja real. La alta tasa de respiración dependiente del complejo IV observada en el estado 3 indica que la integridad mitocondrial se conserva bien durante el procedimiento de aislamiento.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora y media si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar una calibración de los sensores de oxígeno con anticipación antes de la homogeneización. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones del contenido celular de ADP, el potencial de membrana mitocondrial, la actividad enzimática de la ATP sintasa como niveles de sustrato, para responder a preguntas adicionales como si los cambios en la frecuencia respiratoria se deben a la falta de sustrato mitocondrial, al potencial de membrana o a la reducción de la actividad enzimática de la ATP sintasa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar mitocondrias de un músculo esquelético mediante centrifugación diferencial y cómo medir las tasas respiratorias de los complejos mitocondriales I, II y IV utilizando respirometría de alta resolución. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo energético mitocondrial exploraran la función energética de las mitocondrias en campos como las enfermedades mitocondriales genéticas, las miopatías, la lesión por isquemia y reperfusión en mitocondrias aisladas. No olvide que trabajar con antimicina A, rotenona, azida sódica y FCCP puede ser extremadamente peligroso.

Y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y batas de laboratorio, al realizar este procedimiento.