Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

El objetivo general de este procedimiento es aislar mitocondrias del músculo esquelético mediante centrifugación diferencial y determinar las tasas respiratorias de los complejos I, II y IV de la cadena respiratoria mitocondrial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioenergética mitocondrial, como las enfermedades y síndromes asociados con la disfunción mitocondrial, por ejemplo diversas enfermedades neurológicas, sepsis y trastornos relacionados con la edad. La principal ventaja de esta técnica es la ausencia de la mayoría de los factores citológicos en la preparación mitocondrial aislada, los cuales podrían interferir con el análisis de las funciones mitocondriales. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sandra Nansoz, la técnica de mi laboratorio.

Para comenzar este procedimiento, obtenga un vaso con muestras de músculo esquelético según se describe en el protocolo escrito. Coloque el vaso sobre un recipiente con hielo. Utilizando tijeras finas, corte el músculo en trozos de uno a dos milímetros de tamaño.

A continuación, lave el tejido picado dos veces con tampón de aislamiento frío con hielo, utilizando 20 mililitros para cada lavado. Suspenda el tejido lavado en 10 mililitros de tampón de aislamiento por gramo de tejido y luego agregue cinco miligramos de proteasa-G tisular. A continuación, coloque el vaso en un baño de hielo con un agitador magnético y agite durante 10 minutos.

A continuación, diluya la suspensión con 10 mililitros adicionales de tampón de aislamiento suplementado con BSA desengrasada al 0,2% por gramo de tejido. Luego, vierta cuidadosamente todo el tampón de aislamiento del vaso de precipitados. Lave el tejido dos veces con tampón de aislamiento frío con hielo suplementado con BSA al 0,2%, utilizando 20 mililitros para cada lavado.

Luego, re-suspenda el tejido en 10 mililitros de tampón de aislamiento suplementado con BSA por gramo de tejido. Utilice un homogenizador de vidrio semiautomático con un pistilo holgado para homogeneizar el tejido. A continuación, transfiera el homogenado a un tubo de centrifugación y centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Utilizando una pipeta serológica, deseche el sobrenadante. Re-suspenda el precipitado con 10 mililitros de medio de aislamiento suplementado con BSA frío con hielo por cada gramo de tejido. Centrifugue la suspensión a 350 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, utilice una pipeta serológica para reservar el sobrenadante, descartando el precipitado. Filtre el sobrenadante en un vaso de precipitados colocado sobre hielo a través de dos capas de gasa. Transfiera la suspensión filtrada a un tubo de centrífuga y centrifugue a 7.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

Luego deseche el sobrenadante. Re-suspenda el sedimento mitocondrial crudo en cinco mililitros de tampón de aislamiento suplementado con BSA por gramo de tejido. Centrifugue esta suspensión a 7.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, deseche el sobrenadante y re-suspenda el sedimento en 20 mililitros de tampón de lavado. Centrifugue a 7.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Repita este proceso de re-suspensión y centrifugación una vez más.

Después de esto, deseche el sobrenadante y re-suspenda el precipitado en un mililitro de tampón de lavado. Determine la concentración de proteína utilizando cualquier método estándar. Luego, mantenga la suspensión mitocondrial concentrada en hielo hasta que esté listo para realizar los ensayos de respirometría.

Para comenzar, re-suspenda el concentrado mitocondrial en el tampón de respiración hasta una concentración final de 0,4 miligramos por mililitro de proteína mitocondrial. A continuación, aspire el medio de respiración de la cámara del oxígrafo calibrada al aire. Añada 2,1 mililitros de la suspensión mitocondrial aislada.

Inserte un tapón para cerrar la cámara del oxígrafo. Luego, agite continuamente la suspensión mitocondrial a 700 RPM a 37 grados Celsius. Registre la respiración celular en la línea base durante tres a cinco minutos hasta que se obtenga una señal estable de flujo de oxígeno.

Para iniciar la respiración dependiente del complejo I, inyecte 12,5 microlitros de malato 0,8 molar en una cámara de oxigrafía preparada con la suspensión mitocondrial aislada a través del puerto de inyección de titanio del tapón. Luego, inyecte 10 microlitros de glutamato 2 molar. Registre la respiración celular durante tres a cinco minutos hasta que se logre una señal estable de flujo de oxígeno.

A continuación, inyecte 10 microlitros de ADP 0,05 molar en la cámara a través del puerto de inyección. Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente, luego disminuya y se estabilice. Para la respiración dependiente del complejo II, inyecte dos microlitros de rotenona 0,2 milimolar en una cámara de oxigrafía preparada con una suspensión de mitocondrias aisladas.

Registre la respiración celular hasta que se alcance una señal estable de flujo de oxígeno. Luego, inyecte 20 microlitros de succinato unimolar. Registre la respiración celular hasta que se alcance una señal estable de flujo de oxígeno.

A continuación, inyecte 10 microlitros de ADP 0,05 molar en la cámara a través del puerto de inyección. Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno aumente, luego disminuya y se estabilice. Para la respiración dependiente del complejo IV, inyecte 2,5 microlitros de ascórbato 0,8 milimolar en una cámara de oxigrafía preparada con una suspensión de mitocondrias aisladas.

A continuación, inyecte inmediatamente 2,5 microlitros de TMPD 0,2 molar y 10 microlitros de ADP 0,05 molar. Registre la respiración celular hasta que se alcance una señal estable de flujo de oxígeno. Luego, inyecte 10 microlitros de azida sódica 1 molar.

Registre la respiración celular hasta que la señal de flujo de oxígeno disminuya y luego se estabilice. En este estudio, se aíslan mitocondrias intactas del músculo esquelético. Luego, se miden las tasas respiratorias dependientes del complejo I mediante respirometría de alta resolución.

Como puede observarse, la tasa de respiración mitocondrial aumenta inmediatamente tras la adición de ADP. La tasa de respiración disminuye después del agotamiento de ADP hasta niveles similares a los observados antes de la adición de ADP. Esto indica que la relación entre el estado 3 y el estado 4, conocida como relación de control respiratorio o RCR, es alta y que la integridad mitocondrial se conserva adecuadamente durante el procedimiento de aislamiento.

Las tasas respiratorias dependientes del complejo II se observan entonces inhibiendo la respiración del complejo I con rotenona e inyectando el sustrato del complejo II, succinato. A continuación, se añade ADP, lo que provoca un aumento inmediato de la respiración. Una vez que el ADP se agota, la respiración disminuye hasta niveles similares a los observados antes de la adición de ADP, lo que indica un alto RCR, ya que la integridad mitocondrial se conserva adecuadamente durante el aislamiento.

Las tasas de respiración dependientes del complejo IV se observan mediante la adición de ascorbato, TMPD y ADP. Luego se añade azida sódica para inhibir el complejo IV. La diferencia en el consumo de oxígeno antes y después de la adición de azida sódica se interpreta como la respiración real del complejo IV. La alta tasa de respiración dependiente del complejo IV observada en el estado 3 indica que la integridad mitocondrial está bien preservada durante el procedimiento de aislamiento.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora y media si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar una calibración de los sensores de oxígeno con anticipación antes de la homogenización. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como mediciones del contenido celular de ADP, del potencial de membrana mitocondrial o de la actividad enzimática de la ATP sintasa como niveles de sustrato, con el fin de responder preguntas adicionales, como si los cambios en las tasas respiratorias se deben a la falta de sustrato mitocondrial, al potencial de membrana o a una actividad enzimática reducida de la ATP sintasa.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar mitocondrias de un músculo esquelético mediante centrifugación diferencial y cómo medir las tasas respiratorias de los complejos mitocondriales I, II y IV utilizando respirometría de alta resolución. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo energético mitocondrial exploraran la función energética de las mitocondrias en áreas como enfermedades mitocondriales genéticas, miopatías y lesión por isquemia-reperfusión en mitocondrias aisladas. No olvide que trabajar con antimicina A, rotenona, azida de sodio y FCCP puede ser extremadamente peligroso.

Y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y batas de laboratorio, al realizar este procedimiento.