Name: Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda el protocolo de sublimación de matriz DAN para detectar gangliósidos en tejido cerebral de rata mediante espectrometría de masas MALDI Imaging. Este método permite visualizar la distribución lipídica con alta calidad.

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Nos gustaría agradecer la asistencia técnica de Kristina Jurcic en las instalaciones de MS MALDI de la Universidad de Western Ontario, así como al Consejo Nacional de Ciencias e Ingeniería (NSERC) por financiar este trabajo. Los autores también desean agradecer al grupo Caprioli (Universidad de Vanderbilt, Tennessee) y al grupo Chaurand (Universidad de Montreal, QC) por su asesoramiento en la optimización de la técnica de sublimación presentada en este manuscrito.

Todos los procedimientos de manejo de animales describen a continuación se adhieren a la Universidad de Cuidado de Animales de Ontario Occidental (2016-014). 1. Preparación del tejido y Seccionamiento <ol><li> Extraer el tejido cerebral de la rata a través de un proceso conocido como &quot;fresco congelado Extraction&quot; (FFE). <ol><li> La eutanasia a las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico y controlar los reflejos en las extremidades. Una vez que todos los reflejos han cesado, cortar la cabeza de la rata utilizando una guillotina. </li><li> Con cuidado, separar los músculos y otros tejidos del cráneo utilizando un bisturí. El uso de fórceps de corte de hueso para romper el cráneo para exponer el cerebro, a partir de la base del cráneo (foramen magnum) a la porción anterior. </li><li> Una vez que el cerebro está expuesto, saque con cuidado con una espátula quirúrgica y colocar inmediatamente en hielo seco triturado para la congelación de flash. NOTA: El cerebro va a ser muy maleable. Por lo tanto, tenga mucho cuidado al colocar en el cerebrohielo seco. Si el cerebro es aplastado o prensado contra una superficie, se va a alterar su forma y congelar en esa posición. </li></ol></li><li> Eliminar el tejido fresco congelado (no perfundidos con formaldehído o embebido en OCT) de - 80 ° C congelador y colocar en hielo seco. </li><li> Coloque varias gotas de agua sobre un soporte de criostato y el lugar en cualquiera de hielo seco o barra de inmovilidad criostato. Presione ligeramente sobre el tejido titular de criostato, ya que comienza a congelar y mantener hasta que el agua se congela alrededor de la base del tejido y lo ancla en su lugar. Añadir más agua para asegurar aún más el tejido en el soporte si es necesario. NOTA: El agua se utiliza en lugar de los medios de octubre para el tejido de montaje con el fin de evitar la contaminación de los tejidos con compuestos que pueden afectar la detección de la señal deseada. </li><li> Posición en el tejido criostato. tejido sección hasta la localización anatómica deseada. Asegúrese de que el espesor de corte es de entre 8-12 micras. NOTA: Cuando el corte de tejidos en criostato comunitariadispositivos, es imperativo que los materiales separados tales como palas, cepillos, barras estabilizadoras, y los titulares pueden utilizar con el fin de evitar la contaminación con la incorporación de compuestos. El interior del criostato también debe limpiarse a fondo con etanol antes de su uso. </li><li> Uso de la barra estabilizadora criostato, lentamente sección aplanada secciones de tejido. Los agujeros o marcas en el tejido puede ocurrir cuando la colocación barra antivuelco es incorrecta o lámina es opaca. Mueva el tejido para el centro de corte de plataforma usando brochas limpias. </li><li> Montaje <ol><li> Congelar diapositivas conductoras o placas de metal, colocándolos en el criostato mientras rebanar. Cuando la tapa está completamente congelado, mueva con cuidado el tejido seccionado sobre la superficie conductora de la diapositiva utilizando pinceles limpios. Una vez que todas las secciones de tejido están colocadas correctamente en la diapositiva, coloque un dedo debajo de la diapositiva, frente al tejido, y presione hasta que la sección se descongela. NOTA: Las secciones pueden plegarse o enrollarse durante el proceso de descongelación cuandoel uso de este método de montaje. Esto se puede reducir manteniendo la diapositiva en el criostato al descongelar el tejido. Si estos problemas se vuelven problemáticos, una alternativa, calentamiento montaje método se enumeran a continuación. </li><li> Otra opción es tomar una temperatura ambiente de óxido de indio y estaño (ITO) de deslizamiento (o placa de metal) y presione ligeramente hacia abajo en la sección de tejido congelado en la superficie de la plataforma de corte, lado conductor hacia abajo. Esto conducirá a la sección de tejido descongelación de manera uniforme sobre la superficie de la corredera con poco rizado o plegado del tejido. NOTA: La condensación puede aparecer debajo de la sección de montaje cuando se utiliza este método que puede conducir a la pérdida de ciertas proteínas y lípidos. </li></ol></li><li> Colocar los portaobjetos con el tejido en un desecador durante 5 - 10 minutos a. </li></ol> 2. Aparato Sublimador Set-up NOTA: Realice estos pasos en una campana de humos. <ol><li> Coloque un baño de arena en un recipiente de aluminio sobre una placa caliente, con la placa caliente en un elevador de tijera de metalde un área superficial apropiada (es decir, más grande que el plato caliente). Encienda la placa caliente y ajustar la temperatura a 140 ° C. NOTA: El punto de fusión de la matriz DAN está entre 187 - 190 ° C. No exceda esta temperatura en la placa calefactora. <ol><li> Si la placa caliente está equipado con una sonda de realimentación de temperatura, lo utilizan para controlar la temperatura de arena durante todo el experimento y garantizar la consistencia de la temperatura. Esta característica puede ayudar con la reproducibilidad experimento a través de diversos experimentos de sublimación. NOTA: El baño de arena debe estar contenido dentro de un recipiente de aluminio como un recipiente de vidrio pueden romperse a alta temperaturas. </li></ol></li><li> Colocar 300 mg de matriz de DAN sobre la superficie inferior del aparato de sublimación. Coloque la matriz en el centro del aparato y se extendió en una capa uniforme en la anchura aproximada y la longitud de la corredera está sublimado. PRECAUCIÓN: matriz de DAN es tóxico. Por lo tanto, es importante llevar guantes, máscaras, y la seguridadgafas en todo momento al manipular la matriz de polvo. DAN se debe almacenar en la oscuridad, ya que es sensible a la luz. </li><li> Cinta de una placa de metal sobre la superficie interior del aparato con la placa de toma de contacto directo con el fondo del condensador con el fin de asegurar una distribución uniforme de la temperatura de refrigeración a través de toda la superficie de la corredera durante la sublimación. Alternativamente, la arena del fondo del condensador para asegurar una superficie plana. <ol><li> Coloque la cinta a lo largo de los bordes exteriores de la placa y adherirse a los lados de los artículos de vidrio interior. Si la cinta se coloca debajo de la placa y se adhiere a la parte inferior de la superficie de vidrio interior, la distribución de temperatura no puede ser aún y podría resultar en la distribución desigual de la matriz a través de la superficie del portaobjetos. </li><li> Cinta de un espacio en blanco (test) deslice diagonalmente a través de la superficie de la placa de metal con la cinta de nuevo colocado en los bordes exteriores de la diapositiva. </li></ol></li><li> Conectar las porciones superior e inferior del aparato, won una junta tórica de caucho en el medio para asegurar un sellado completo. </li><li> Coloque un metal junta en U alrededor del centro del aparato y apriete vicios hasta la mitad superior e inferior del aparato están sellados herméticamente juntos. Colocar en la junta tórica de metal por encima del baño de arena. </li><li> Tome un puñado de hielo picado y colocarlo en el condensador. Llenar condensador de ¼ a ½ llena con agua fría para crear granizado de hielo. El granizado de hielo se enfría la placa de metal en el interior del aparato y, posteriormente, la corredera adherido a ella. Espere al menos 5 minutos para que la temperatura alcance un estado de equilibrio. </li><li> Verter 300 ml de etanol en el recipiente de trampa fría y colocar el material de vidrio en el recipiente. Caída de 2 - 3 pequeños trozos de hielo seco en el etanol en la parte inferior del recipiente de absorción en frío. La entrada de absorción en frío tiene un tubo de vidrio corriendo a la parte inferior del cilindro, mientras que la salida no lo hace. </li><li> Conectar la bomba de vacío a la salida de la trampa fría usando un tubo de goma. Utilice otro trozo de gomatubos para conectar la entrada de absorción en frío al aparato de sublimación. Asegúrese de que el tubo esté fijado firmemente mediante abrazaderas metálicas si está disponible. </li><li> Utilice la bomba de vacío para proporcionar un vacío de 30 - 50 mT. Deje que la bomba funcione durante al menos 5 minutos para equilibrar la presión. Vicios en U-anillo de aparato de sublimación pueden tener que ser apretados de nuevo una vez que la bomba de vacío se activa debido a la disminución de la presión en el aparato. NOTA: Se recomienda que un indicador de vacío puede unir a la bomba para controlar la presión de vacío durante el experimento y para detectar si existen fugas en la presión con el fin de lograr la más alta capacidad de reproducción posible entre los experimentos. Sin embargo, la mayoría de las bombas están diseñados para mantener una presión constante, por lo tanto, el indicador puede no ser esencial para los usuarios experimentados. Además, la grasa sello de vacío se puede utilizar para ayudar a mantener la presión de vacío. </li></ol> 3. La sublimación <ol><li> Asegúrese de que la temperatura del baño de arena tiene Stabilzado a 140 ° C y que el aparato se fija en la junta tórica de metal por encima del baño de arena con todos los tubos conectados y el vacío encendido. </li><li> Ajuste del temporizador durante 7 minutos, pero no arranque el temporizador. Lentamente levante la plataforma elevadora de tijera y la arena del baño hasta el aparato de sublimación hasta que la junta universal del sublimador está muy por encima de la junta tórica de metal. Este espacio adicional permite el ajuste del aparato en la arena. <ol><li> pulse rápidamente el sublimador suavemente sobre la superficie de la arena para asegurar que el aparato está sentado de manera uniforme sobre la arena, y luego comenzar inmediatamente el temporizador. </li></ol></li><li> Cuando suene el temporizador, apague la bomba de vacío y cuidadosamente baje la plataforma elevadora de tijera hasta que el sublimador ya no está en contacto con el baño de arena y se encuentra segura en la junta tórica de metal. <ol><li> Soltar lentamente la válvula de micro-ventilación para liberar la presión en el aparato. Aflojar la abrazadera de metal alrededor del tubo de goma del aparato de sublimación y poco a poco comienzan a aflojar el tubo. Una vez que el rutubo bber se ha aflojado ligeramente, doblar el tubo a un lado para permitir que la presión residual. </li><li> Cuando vuelve la presión ambiente, retirar con cuidado el tubo de goma del aparato de sublimación. </li></ol></li><li> Aflojar los vicios en la junta universal del aparato y quitar. separe con cuidado las dos mitades del aparato de sublimación y salga de la diapositiva de la parte superior del material de vidrio interior. Examine el portaobjetos para confirmar la distribución uniforme de la matriz. NOTA: Si la matriz no es uniforme, la matriz en polvo en la parte inferior del sublimador puede cambiar de posición o el aparato sublimador puede colocar de nuevo en la arena para la siguiente diapositiva. El proceso de sublimación se puede repetir varias veces utilizando la misma matriz, sin embargo, la matriz con el tiempo se vuelven más oscuras de la exposición al calor repetida y la cantidad de polvo se reducirá de tal manera que el tiempo de sublimación tendrá que ser ajustada ligeramente para compensar. Por esta razón, es importante controlar la cantidad de bei matrizng sublima después de cada experimento para asegurar la consistencia en la deposición de matriz entre diapositivas </li><li> Si la distribución y cantidad de matriz sublimado es suficiente, la cinta de una nueva diapositiva con el tejido en el interior de la sublimador y repita la Sección 3. NOTA: Para fines de control de calidad (QC), la cantidad de matriz sublimado se puede medir después de cada experimento mediante el pesaje de la diapositiva antes y después de la sublimación y dividiendo el peso de la matriz sublimado con el área de la superficie de la corredera 2, hay que señalar que debido a la falta de precisión de la mayoría de las escalas más allá de 4 puntos decimales y la variabilidad entre las escalas, estas mediciones deben sólo se pueden utilizar una guía para la deposición de matriz óptima en oposición a un medio totalmente cuantificables de QC menos que se utilice un equilibrio de alta precisión (véase la figura 3). </li></ol> 4. El tejido de almacenamiento / rehidratación <ol><li> Después de la sublimación, la tienda se desliza en un recipiente sellado o pequeño Cassette en una bolsa de plástico sellada. </li><li> Incubar los portaobjetos en -20 ° C congelador durante 2 h o durante la noche. NOTA: El objetivo del proceso de congelación es la de actuar como una etapa de rehidratación para la desorción de los materiales de tejido en la matriz. El proceso de congelación también se ha demostrado para prevenir la degradación de las señales de lípidos para un máximo de 1 semana cuando se almacenan a -80 ° C 12. Por esta razón, la cantidad de tiempo las muestras se almacenan en el congelador se puede variar a un cierto grado para adaptarse a las necesidades del experimentador sin alterar significativamente la detección de señales (como se observa en nuestro laboratorio). Sin embargo, hemos notado cierta decoloración de la matriz cuando las muestras se congelan durante más de 24 horas a -20 ° C. Por lo tanto, se recomienda obtener imágenes del tejido sublimado antes de ese momento o almacenamiento de tejidos a -80 ° C durante períodos de incubación más largos. </li><li> Retire los portaobjetos del congelador (y contenedor) y colocar en un desecador durante 5 - 10 minutos a. </li></ol> 5. Imaging y Análisis <ol><li> Retirar los portaobjetos de desecador y aplicar las normas de instrumentos para asegurar la exactitud de la masa MALDI instrumento durante la exploración. El tipo de normas puede variar dependiendo de la instrumentación. Las normas se aplican generalmente de forma homogénea en toda la diapositiva, el tejido circundante en ser fotografiado (Figura 3D). </li><li> Insertar diapositiva en el instrumento MALDI y siga las instrucciones del fabricante para los experimentos de imagen (métodos de instrumentos deben ser optimizados para un 1,000 - 2,000 rango de masas). Resultado representativo (Figura 4) fue adquirido en el modo negativo reflectrón con una trama de 70 micras y 20 disparos / espectro (adquisición en tiempo ~ 2 h). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo detalla un protocolo estandarizado de la sublimación de la matriz en el tejido para la detección de lípidos cargados negativamente, tales como gangliósidos, en los experimentos de MALDI IMS. Preparación de muestras para MALDI IMS es muy variable y debe ser personalizado para adaptarse a las propiedades únicas de analito de interés. La aplicación de la matriz sobre la superficie de la muestra de tejido es un aspecto crucial del proceso de preparación de la muestra con respecto a la calidad de los resultados ...

Asistida por matriz de desorción láser / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) se está convirtiendo en un codiciado técnica para la visualización de la distribución espacial de los lípidos, péptidos y proteínas a través de superficies de muestras intactas. MALDI IMS era conocido previamente como una técnica analítica para analitos pre-purificado, pero en los últimos años, se ha llamado la atención en muchas otras disciplinas debido a la capacidad de combinar la exactitud de la espectrometría de masas con puntos de referencia de alta resolución visuales / anatómicas sin la necesitará para cualquier etiquetado externo. Como la piscina científica de los investigadores que utilizan esta técnica sigue creciendo, hay una mayor necesidad de protocolos estandarizados y fáciles de seguir para ayudar en el desarrollo y optimización de experimentos IMS. Los gangliósidos, un grupo de lípidos de membrana muy abundantes en el sistema nervioso central, son ideales para experimentos de MALDI IMS como su ubicación, incrustado dentro de la membrana, hace cierta especificidadit imposible detectar el uso de Inmuno-etiquetado convencional. Además, hemos demostrado, usando MALDI IMS, que estos lípidos, que funcionan como moduladores de la señalización celular, entre otras cosas, tienen patrones de distribución anatómica únicas en el cerebro de roedores sanos que son alterados después de la lesión cerebral 3, 4, 5. Los gangliósidos se encuentran en un intervalo de masa superior en comparación con la mayoría de las especies de lípidos, y son por lo tanto más adaptado a la plataforma de imágenes MALDI. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo de MALDI IMS experimento. Diagrama del flujo de trabajo general de un experimento de MALDI IMS usando sublimación. El tejido congelado a -80 ° C se secciona en un criostato y 10 micras secciones son deshielo montado en portaobjetos de ITO conductores. El portaobjetos se coloca entonces en un desecador hasta la sublimación. SLIdes se inserta en el aparato de sublimación y se aplica una capa uniforme de la matriz a la superficie de la muestra de tejido. Las muestras se congelaron durante la noche en un congelador C -20 ° después se colocaron en un desecador durante 10 min. Una vez que se han aplicado las normas, las muestras se insertan en el instrumento MALDI donde un láser se dirige a través del tejido causando moléculas desorbidos en la matriz para ionizar. Los iones viajan por un tubo de vuelo y por separado en función de su masa (/ TOF tiempo-de-vuelo) hasta que alcanzan el detector. La información sobre la abundancia iónica de analitos dentro de un rango predeterminado de masa a carga (m / z) se muestra como tanto una imagen molecular y espectro de masas. Estos datos se pueden usar tanto para visualizar y cuantificar la abundancia iónica del analito de interés en el tejido de imágenes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> preparación de la muestrapor MALDI IMS es muy variable, ya que cada paso del proceso debe ser personalizado para los analitos de interés. La característica definitoria de experimentos basados ​​en MALDI es el uso de un revestimiento de matriz depositada sobre la superficie de la muestra antes del análisis. Además de la función de absorber y transferir energía de radiación del láser durante el proceso de ablación, la matriz también sirve para aislar diversos analitos de la muestra, lo que facilita el análisis de los compuestos de interés 6, 7. una aplicación homogénea de la matriz a la superficie de la muestra es el paso más importante en el proceso de preparación de la muestra. La deposición de matriz incorrecta puede dar lugar a grandes formaciones heterogéneas cristal matriz y el desarrollo de artefactos, bajo la señal de iones, y la mala reproducibilidad 7. Debido a la afinidad de ciertas matrices para aislar analitos específicos, el tipo de matriz seleccionado para un experimento puedealterar de manera significativa el resultado. Las matrices utilizadas para la obtención de imágenes de proteínas y péptidos a menudo difieren de las utilizadas para los lípidos de formación de imágenes y el proceso se complica aún más por la necesidad de procedimientos adicionales, tales como lavado y rehidratación pasos con el fin de detectar con éxito las señales a partir de tejido. Aunque existen etapas de lavado para la mejora de las señales de lípidos 8, no son un requisito previo para la detección de la mayoría de especies de lípidos. Al seleccionar una matriz para un experimento de formación de imágenes de lípidos, es importante tener en cuenta la polaridad de los lípidos de interés, ya que esto reducir la gama de matrices adecuadas. Por ejemplo, los gangliósidos contienen residuos de ácido siálico que les dan una polaridad negativa global. Hay una serie de matrices que pueden desorber e ionizar gangliósidos a partir de tejido de manera efectiva; Sin embargo, factores tales como picos derivadas de la matriz en el espectro y la estabilidad de la matriz al vacío deben ser tomados en consideración. 1,5-diaminonaftaleno (DAN) de la matriz es lo suficientemente estable en condiciones de vacío instrumento para la mayoría de aplicaciones de imágenes y ha demostrado un alto grado de sensibilidad para la desorción de los lípidos y se puede utilizar para el análisis de lípidos en ambos modos de iones positivos y negativos 2. matriz DAN, en comparación con otras matrices de afinidad de lípidos negativos tales como el ácido dihidroxibenzoico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), y 5-cloro-2-mercaptobenzotiazol (CMBT), fue capaz de desorber más eficiente gangliósidos de cerebro de rata tejido en el modo de ion negativo (manuscrito en preparación). Al seleccionar el método adecuado para la deposición de matriz es de igual importancia para la selección de la propia matriz. métodos de deposición de matriz húmeda en el que la matriz sólida se disuelve en un disolvente orgánico, y se depositan por neumático o pulverizadores o observadores automatizado, son particularmente eficaces para la desorción de proteínas y péptidos como el líquido impregna la muestra para permitir adicionalcción de compuestos y co-cristalización con la matriz. Aunque estas técnicas también se pueden utilizar para aplicaciones de lípidos, la deslocalización analito y formaciones de cristal de matriz desigual son sucesos comunes, debido a la gran abundancia y la solubilidad de los lípidos en disolventes, en particular en el tejido 2, 9. Debido a que los lípidos se ionizan fácilmente a partir de tejidos, técnicas de deposición de matriz secos, como sublimación, ofrecen una alternativa sencilla y rentable para pulverizadores eludiendo las disposiciones que muchos de los inconvenientes de estas técnicas. El éxito de la sublimación en experimentos MALDI IMS se atribuye a características tales como la morfología de la matriz microcristalina lo que aumenta el área superficial para la matriz de unión a analito, el aumento de la pureza de la matriz, y la deposición de matriz homogénea que conducen a una mayor reproducibilidad en comparación con las técnicas de matriz húmeda 1, 10. invo sublimaciónLves calentamiento de una matriz de polvo bajo vacío inmediatamente por debajo de una superficie de la muestra enfriada resultante en forma sólida a la transición de fase gaseosa de la matriz en polvo seguido de la deposición sobre la superficie de la muestra de tejido. Durante la sublimación, deposición de la matriz puede ser controlado por factores variables tales como el tiempo, la temperatura y la presión para proporcionar resultados altamente reproducibles. Un experimento de la sublimación solo puede tomar de 5 a 20 minutos, dependiendo del tipo de matriz seleccionada, que puede ser reutilizado varias veces antes de su eliminación. El aparato puede ser comprado comercialmente a una fracción del precio de los pulverizadores automáticos y es fácilmente desmontado para su limpieza y mantenimiento. El bajo costo y la simplicidad relativa de esta técnica de deposición de la matriz, lo hacen ideal para los investigadores que comienzan o en expansión en aplicaciones de imágenes de lípidos en MALDI IMS. Aunque la información que detalla los protocolos para la sublimación de los tejidos para IMS se han reportado 11, unos protocolos estandarizados existen which centrarse en el flujo de trabajo básico involucrado en la realización de un experimento de la sublimación para obtener imágenes de los lípidos de alto peso en el modo de iones negativos, por lo que es difícil establecer la técnica sin un amplio ensayo y error. El siguiente es un protocolo experimental con el objetivo de llenar ese hueco para la sublimación de la matriz de DAN en secciones de cerebro de rata para la formación de imágenes de alta resolución y detección de los gangliósidos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Figura 2: Aparato de sublimación. La fotografía (A) y el diagrama esquemático (B) del aparato de sublimación. La bomba de vacío está conectada por un tubo de goma a una trampa fría llena con 300 ml de etanol. La trampa está entonces conectada por un tubo de goma al aparato de sublimación. El aparato se compone de dos piezas separadas de material de vidrio que están sellados juntos con un metal U-articulación. La mitad superior de la sublimadorcontiene el condensador que está lleno de aguanieve hielo. La placa de muestra se pega sobre la parte inferior del condensador, en el interior del aparato de vidrio sellado. La mitad inferior del aparato de sublimación contiene la matriz DAN, que se extiende de manera uniforme hacia la placa de muestra. Durante la sublimación, el aparato de vidrio se coloca en un baño de arena se calienta a 140 ° C por una placa caliente directamente debajo de ella. La sonda de temperatura ayuda a mantener una temperatura estable durante todo el experimento sublimación través de la retroalimentación de la temperatura del baño de arena en comparación con la temperatura predeterminada para el experimento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sublimador</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>matriz de 1,5-diaminonafthalene (DAN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&nbsp;</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td> Placa calefactora <td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>con retroalimentación</td><td>de temperatura Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>Gato de acero inoxidable</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>2216479 10x10</td></tr><tr><td>Trampa</td><td></td><td></td> fría <td>Hecho a medida en el sitio</td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>Franklin Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100</td></tr><tr><td>Correderas de óxido de indio y estaño (ITO)</td> de dos etapas <td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI 1111000</td><td>tipo II, 1,1 mm/25 cada una</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>de sobremesa</td></tr></tbody></table>

sublimación de dan matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por maldi imaging espectrometría de masas

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Preparación de la muestra es la clave para la detección y visualización de analitos en experimentos de láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) óptima. Determinar el protocolo apropiado para seguir todo el proceso de preparación de la muestra puede ser difícil, ya que cada paso debe ser optimizada para cumplir con las características únicas de los analitos de interés. Este proceso no sólo consiste en encontrar una matriz compatible que puede desorber e ionizar las moléculas de interés de manera eficiente, sino también la selección de la técnica de deposición de matriz apropiada. Por ejemplo, una técnica de deposición de matriz húmeda, lo que implica la disolución de una matriz en un disolvente, es superior para la desorción de la mayoría de proteínas y péptidos, mientras que las técnicas de deposición de matriz seca son particularmente eficaces para la ionización de los lípidos. Sublimación ha sido reportado como un método altamente eficaz de la deposición de matriz seca para la detección de lípidos en el tejido por MALDI IMS debido a la homogeneity de la deposición de cristales de la matriz y la deslocalización mínimo analito en comparación con muchos métodos de deposición húmeda 1, 2. En términos generales, se trata de la colocación de una muestra y de la matriz en polvo en una cámara sellada al vacío con las muestras prensadas contra una superficie fría. El aparato es bajado a continuación en un baño calentado (arena o aceite), lo que resulta en la sublimación de la matriz en polvo sobre la superficie de muestra de tejido enfriado. Aquí se describe un protocolo de sublimación usando 1,5-diamino-naftaleno matriz (DAN) para la detección y visualización de los gangliósidos en el cerebro de rata utilizando MALDI IMS.

Al finalizar el experimento sublimación, las dos mitades del aparato de vidrio se separan en la campana de humos y la corredera, pegado en el condensador, se pueden eliminar (Figura 3A). En este punto, la corredera debe ser examinado para la distribución desigual de la matriz y el tiempo, la temperatura o la colocación del aparato en el baño de arena puede tener que ser ajustado para la siguiente diapositiva. Un exitoso experimento sublimación DAN resultará en una capa u...

Se presenta un protocolo para la sublimación de la matriz DAN en tejido cerebral de rata para la detección de gangliósidos utilizando la espectrometría de masas de imágenes MALDI.

Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

El objetivo general de este protocolo de sublimación es proporcionar un proceso detallado y fácil de seguir para la preparación de muestras, destinado a la detección de gangliósidos en experimentos de espectrometría de masas con imagen MALDI. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, incluyendo la distribución anatómica y la función de los gangliósidos, tanto en el cerebro sano como en las patologías cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que puede adaptarse para obtener imágenes de alta calidad de muchas especies lipídicas con pocas alteraciones del protocolo.Para comenzar este procedimiento, extraiga el tejido cerebral de la rata y prepárelo para el criostato según se describe en el protocolo escrito. Luego, coloque el tejido en el criostato. Corte el tejido hasta la ubicación anatómica deseada.Asegúrese de que el grosor de corte esté entre ocho y 12 micrómetros. Utilizando la barra antirrolado del criostato, corte lentamente la sección de tejido aplanada. Pueden aparecer agujeros o marcas en el tejido si la colocación de la barra de rodamiento es incorrecta o si la cuchilla está desafilada.Mueva el tejido al centro de la plataforma de corte utilizando pinceles limpios. Para mapear el tejido, congele portaobjetos conductores o placas metálicas colocándolos en el criostato durante el corte. Cuando el portaobjetos esté completamente congelado, mueva cuidadosamente el tejido seccionado sobre la superficie conductora del portaobjetos utilizando pinceles limpios.Una vez que todas las secciones de tejido estén colocadas correctamente sobre el portaobjetos, coloque un dedo debajo del portaobjetos, en el lado opuesto al tejido, y presione hasta que la sección se descongele. Luego, coloque los portaobjetos con el tejido en un desecador durante cinco a diez minutos. Alternativamente, utilice un portaobjetos caliente y presiónelo ligeramente, con el lado conductor hacia abajo, contra las secciones de tejido aplanadas.Trabajando en la campana extractora, coloque un baño de arena en un recipiente de aluminio sobre una placa calefactora. La placa calefactora debe estar sobre un elevador metálico de tijera con una superficie adecuada. Encienda la placa calefactora y ajuste la temperatura a 140 grados Celsius.Utilice la sonda de retroalimentación de temperatura para monitorear la temperatura de la arena durante todo el experimento y asegurar la consistencia térmica. A continuación, coloque 300 miligramos de la matriz DAN sobre la superficie inferior del aparato de sublimación. Extienda la matriz en una capa uniforme en el centro del aparato, hasta alcanzar aproximadamente el ancho y la longitud del portaobjetos que se va a sublimar.Coloque una placa de metal sobre la superficie interna del aparato, de modo que la placa haga contacto directo con la base del condensador. Fije un portaobjetos en blanco diagonalmente sobre la superficie de la placa metálica, colocando cinta adhesiva en los bordes externos del portaobjetos. Conecte las partes superior e inferior del aparato con una junta tórica de goma en el centro para asegurar un sellado completo.Coloque una unión metálica en forma de U alrededor del centro del aparato y apriete las mordazas hasta que la mitad superior e inferior del aparato queden herméticamente selladas. Luego, coloque el aparato dentro del anillo metálico de la bañera de arena. A continuación, coloque un puñado de hielo picado en el condensador.Llene el condensador hasta un cuarto o la mitad con agua fría para crear una mezcla de hielo. La mezcla de hielo enfriará la placa metálica en el interior del aparato y, consecuentemente, la laminilla adherida a ella. Espere al menos cinco minutos para que la temperatura alcance un estado estable.Luego, vierta 300 mL de metanol en el recipiente del trampa fría y coloque el material de vidrio dentro del recipiente. Conecte la bomba de vacío a la salida de la trampa fría utilizando un tubo de goma. Utilice otra pieza de tubo de goma para conectar la entrada de la trampa fría al aparato de sublimación.Asegúrese de que el tubo esté firmemente sujeto utilizando abrazaderas metálicas. Utilice la bomba de vacío para aplicar un vacío de 30 a 50 militorr. Deje funcionar las bombas durante al menos cinco minutos para lograr la equilibración de presión.Coloque de dos a tres trozos peque&ntilde;os de hielo seco en el etanol, en el fondo del recipiente del trampa de fr&iacute;o. La trampa de fr&iacute;o ayuda a evitar que las part&iacute;culas de matriz se acumulen en la bomba de vac&iacute;o. Es posible que sea necesario apretar las abrazaderas del anillo en U del aparato de sublimaci&oacute;n una vez que se encienda la bomba de vac&iacute;o debido a la disminuci&oacute;n de la presi&oacute;n en el aparato.Asegúrese de que la temperatura del baño de arena se haya estabilizado a 140 grados Celsius. Verifique también que el vacío esté encendido y que el aparato esté sujeto al anillo metálico por encima del baño de arena, con todos los tubos conectados. Configure el temporizador para siete minutos, pero no inicie el temporizador.Eleve lentamente el elevador de tijera y el baño de arena hacia el aparato de sublimación hasta que la unión en U del sublimador esté bien por encima del anillo metálico en forma de O. Este espacio adicional permite ajustar el aparato sobre la arena. Presione rápidamente el sublimador suavemente sobre la superficie de la arena para asegurarse de que el aparato esté bien asentado y en posición uniforme sobre la arena.Luego, inicie inmediatamente el cronómetro. Cuando suene el temporizador, apague la bomba de vacío y baje cuidadosamente el elevador de tijera hasta que el sublimador ya no toque el baño de arena y esté firmemente colocado en el anillo metálico en forma de O. Afloje lentamente la válvula de microventilación para liberar la presión en el aparato.Suelte la abrazadera metálica alrededor del tubo de goma del aparato de sublimación y comience lentamente a aflojar el tubo. Una vez que el tubo de goma se haya aflojado ligeramente, dóblelo hacia un lado para permitir que la presión residual escape. Cuando se restablezca la presión ambiente, retire cuidadosamente el tubo de goma del aparato de sublimación.A continuación, afloje las mordazas en la junta universal del aparato y retírelas. Separe cuidadosamente las dos mitades del aparato de sublimación y retire el portaobjetos de la parte superior del material de vidrio interno. Examine el portaobjetos para confirmar una distribución uniforme de la matriz.Si la distribución y la cantidad de matriz sublimada son suficientes, sujete con cinta un nuevo portaobjetos con el tejido en el interior del sublimador y repita el proceso de sublimación. Continúe con la obtención de imágenes y el análisis según se describe en el protocolo escrito. El espectro de masas muestra la abundancia iónica de anolitos dentro de un rango de masa de 1000 a 2000.Los principales gangliósidos de la serie A están etiquetados a lo largo del espectro. Aquí se muestra la imagen molecular correspondiente de los gangliósidos en el cerebro de rata. La imagen molecular muestra la distribución anatómica de varias especies de gangliósidos mediante un código de colores, que han sido superpuestas y coloreadas artificialmente utilizando el software ImageJ.Generalmente, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, ya que existen muchas variables en el proceso de preparación de la muestra que pueden influir en la calidad de los resultados de IMS y que a menudo se omiten en los protocolos descritos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar monitorear la cantidad de matriz que se sublima después de cada experimento y modificar el tiempo de sublimación en consecuencia para cada portaobjetos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran el papel de los lípidos de membrana, como los gangliósidos, tras lesiones cerebrales, la enfermedad de Ner-jone y el proceso natural de envejecimiento.Aunque este método puede proporcionar información sobre la abundancia y distribución anatómica de lípidos en el cerebro, también puede aplicarse a otros sistemas, incluyendo tejidos fuera del cerebro e incluso modelos de plantas e insectos. Trabajar con raíces dañadas puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, mascarillas y protección ocular al realizar este procedimiento.

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Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas

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