Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas
23 de marzo de 2017
Se presenta un protocolo para la sublimación de la matriz DAN en tejido cerebral de rata para la detección de gangliósidos utilizando la espectrometría de masas de imágenes MALDI.
El objetivo general de este protocolo de sublimación es proporcionar un proceso de preparación de muestras detallado y fácil de seguir para la detección de gangliósidos en experimentos de espectrometría de masas de imágenes MALDI. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, incluida la distribución anatómica y la función de los gangliósidos, tanto en el cerebro sano como en la patología cerebral. La principal ventaja de esta técnica es que se puede adaptar para obtener imágenes de alta calidad de muchas especies de lípidos, con pocas alteraciones en el protocolo.
Para comenzar este procedimiento, extraiga tejido cerebral de la rata y prepárese para el criostato como se describe en el protocolo de texto. A continuación, coloque el tejido en el criostato. Separe el tejido hasta la ubicación anatómica deseada.
Asegúrese de que el espesor de corte esté entre ocho y 12 micras. Con la barra estabilizadora de criostato, corte lentamente la sección de tejido aplanado. Pueden producirse agujeros o marcas en el tejido si la colocación de la barra antivuelco es incorrecta o si la hoja está desafilada.
Mueva el pañuelo al centro de la plataforma de corte con pinceles limpios. Para mapear el tejido, congele los portaobjetos conductores o las placas de metal colocándolos en el criostato mientras corta. Cuando el portaobjetos esté completamente congelado, mueva con cuidado el tejido de la sección sobre el servicio conductor del portaobjetos con pinceles limpios.
Una vez que todas las secciones de tejido estén colocadas correctamente en el portaobjetos, coloque un dedo debajo del portaobjetos opuesto al pañuelo y presione hasta que la sección se descongele. Luego coloque los portaobjetos con pañuelo en un desecador durante cinco a 10 minutos. Alternativamente, use un portaobjetos tibio y presiónelo ligeramente, con el lado conductor hacia abajo, contra las secciones de tejido aplanadas.
Trabajando en la campana extractora, coloque un baño de arena en un recipiente de aluminio sobre una placa calefactora. La placa calefactora debe estar en un elevador de tijera metálico de la superficie adecuada. Encienda la placa calefactora y ajuste la temperatura a 140 grados centígrados.
Utilice la sonda de retroalimentación de temperatura para controlar la temperatura de la arena durante todo el experimento y garantizar la consistencia de la temperatura. A continuación, coloque 300 miligramos de matriz DAN en la superficie inferior del aparato de sublimación. Extienda la matriz en una capa uniforme en el centro del aparato hasta el ancho y la longitud aproximados del portaobjetos que se está sublimando.
Coloque una placa de metal en la superficie interna del aparato con la placa haciendo contacto directo con la parte inferior del condensador. Tape un portaobjetos de prueba en blanco cruzando diagonalmente la superficie de la placa de metal, con una cinta colocada en los bordes exteriores del portaobjetos. Conecte las partes superior e inferior del aparato con una junta tórica de goma en el medio para asegurar un sellado completo.
Coloque una junta universal de metal alrededor del centro del aparato y apriete los tornillos de banco hasta que la mitad superior e inferior del aparato estén selladas herméticamente. A continuación, coloque el aparato en la junta tórica metálica que rodea el baño de arena. A continuación, coloque un puñado de hielo picado en el condensador.
Llene el condensador de un cuarto a la mitad de su capacidad con agua fría para crear aguanieve helada. El aguanieve de hielo enfriará la placa de metal en el interior del aparato y, posteriormente, el portaobjetos se adherirá a ella. Espere al menos cinco minutos para que la temperatura alcance un estado estable.
A continuación, vierta 300 ml de metanol en el recipiente de la trampa fría y coloque la cristalería en el recipiente. Conecte la bomba de vacío a la salida de la trampa de frío mediante un tubo de goma. Use otra pieza de tubo de goma para conectar la entrada de la trampa fría al aparato de sublimación.
Asegúrese de que el tubo esté bien asegurado con abrazaderas de metal. Utilice la bomba de vacío para suministrar un vacío de 30 a 50 militorr. Deje que las bombas funcionen durante al menos cinco minutos para equilibrar la presión.
Deje caer dos o tres trozos pequeños de hielo seco en el etanol, en el fondo del recipiente de la trampa fría. La trampa de frío ayuda a evitar que las partículas de la matriz se acumulen en la bomba de vacío. Es posible que sea necesario apretar las mordazas en el anillo en U del aparato de sublimación una vez que se enciende la bomba de vacío debido a la disminución de la presión en el aparato.
Asegúrese de que la temperatura del baño de arena se haya estabilizado a 140 grados centígrados. También verifique que la aspiradora esté encendida y que el aparato esté asegurado en la junta tórica de metal sobre el baño de arena con todos los tubos conectados. Configure el temporizador en siete minutos, pero no inicie el temporizador.
Levante lentamente el elevador de tijera y el baño de arena hasta el aparato de sublimación hasta que la junta universal del sublimador esté muy por encima de la junta tórica de metal. Este espacio adicional permite el ajuste del aparato en la arena. Presione rápidamente el sublimador suavemente sobre la superficie de la arena para asegurarse de que el aparato se asiente uniformemente sobre la arena.
Y luego, inicie inmediatamente el temporizador. Cuando suene el temporizador, apague la bomba de vacío y baje con cuidado el elevador de tijera hasta que el sublimador ya no toque el baño de arena y se asiente de forma segura en la junta tórica de metal. Afloje lentamente la válvula de microventilación para liberar la presión en el aparato.
Afloje la abrazadera de metal alrededor del tubo de goma del aparato de sublimación y comience a aflojar lentamente el tubo. Una vez que el tubo de goma se haya aflojado ligeramente, doble el tubo hacia un lado para permitir que escape la presión residual. Cuando regrese la presión ambiental, retire con cuidado el tubo de goma del aparato de sublimación.
A continuación, afloje las mordazas de la junta universal del aparato y retírelas. Separe con cuidado las dos mitades del aparato de sublimación y retire la corredera de la parte superior de la cristalería interior. Examine el portaobjetos para confirmar la distribución uniforme de la matriz.
Si la distribución y la cantidad de matriz sublimada son suficientes, pegue una nueva diapositiva con pañuelo en el interior del sublimador y repita el proceso de sublimación. Proceda a realizar imágenes y análisis como se describe en el protocolo de texto. El espectro de masas muestra la abundancia iónica de anolitos dentro de un rango de masas de 1000 a 2000
.Los principales gangliósidos de la serie A se etiquetan a lo largo del espectro. Aquí se muestra la imagen molecular correspondiente de los gangliósidos en el cerebro de la rata. La imagen molecular muestra la distribución anatómica de varias especies de gangliósidos a través de un código de colores, que se han superpuesto y pseudocoloreado utilizando el software ImageJ.
En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, ya que hay muchas variables en el proceso de preparación de la muestra que pueden influir en la calidad de los resultados de IMS que a menudo se dejan fuera de los protocolos informados. Al intentar este procedimiento, es importante recordar controlar la cantidad de matriz que se sublima después de cada experimento y modificar el tiempo de sublimación en consecuencia para la diapositiva. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran el papel de los lípidos de membrana, como los gangliósidos, después de una lesión cerebral, la enfermedad de ner-jone y el proceso natural de envejecimiento.
Este método puede proporcionar información sobre la abundancia y la distribución anatómica de los lípidos en el cerebro, también se puede aplicar a otros sistemas, incluidos los tejidos fuera del cerebro, e incluso a modelos de plantas e insectos. Trabajar con raíces dañadas puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como guantes, máscaras y protección para los ojos al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo de sublimación para la detección de gangliósidos en tejido cerebral de rata mediante Espectrometría de Masas con Ionización por Desorción Láser Asistida por Matriz (MALDI). El método tiene como objetivo mejorar la comprensión de la distribución y función de los gangliósidos en condiciones cerebrales tanto sanas como patológicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurobiología
- Espectrometría de masas
- Bioquímica
Antecedentes
- Los gangliósidos desempeñan un papel crucial en la función cerebral.
- Comprender su distribución puede proporcionar información sobre enfermedades neurológicas.
- La espectrometría de masas con imagen MALDI es una herramienta poderosa para el análisis de lípidos.
- La preparación de la muestra es fundamental para obtener resultados de imagen de alta calidad.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para la detección de gangliósidos.
- Facilitar imágenes de alta calidad de especies lipídicas.
- Explorar las funciones de los gangliósidos en la salud y la enfermedad.
Métodos Utilizados
- Extracción de tejido cerebral de rata.
- Preparación de secciones de tejido utilizando un criostato.
- Aplicación de la técnica de sublimación para la preparación de muestras.
- Uso de la Espectrometría de Masas con Ionización por Desorción Láser Asistida por Matriz (MALDI) para el análisis.
Resultados principales
- Detección exitosa de gangliósidos en tejido cerebral.
- Obtención de imágenes de alta calidad de las distribuciones de lípidos.
- Protocolo adaptable para diversas especies de lípidos.
- Información sobre los roles de los gangliósidos en neurobiología proporcionada.
Conclusiones
- El protocolo de sublimación es efectivo para el análisis de gangliósidos.
- Este método puede impulsar la investigación en neurobiología.
- Estudios posteriores pueden basarse en estos hallazgos para explorar la patología cerebral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo de sublimación permite la detección de alta fidelidad de gangliósidos en tejido cerebral de rata mediante IMS MALDI, abordando una necesidad crítica en neurobiología para el análisis espacialmente resuelto de lípidos. Al minimizar la deslocalización del analito y asegurar un depósito homogéneo de la matriz, el método respalda la reducción mecanicista de riesgos en estudios de validación de objetivos que involucran vías de señalización lipídica de membrana. El enfoque proporciona confianza predictiva para el descubrimiento de biomarcadores y la modelización preclínica de afecciones neurodegenerativas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de señalización mediadas por gangliósidos en tejido cerebral sano y enfermo.
- Valor operativo: Proporciona una preparación reproducible de muestras para una detección consistente de lípidos en diferentes cohortes experimentales.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de objetivos mediante la correlación de la distribución de gangliósidos con regiones neuroanatómicas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera espectros de masas cuantitativos en el rango de 1000–2000 m/z para la identificación de especies de gangliósidos.
- Valor operativo: Proporciona un recubrimiento homogéneo de la matriz mediante sublimación, reduciendo la variabilidad en la intensidad de la señal MALDI.
- Valor científico: Produce imágenes moleculares con resolución anatómica adecuadas para la estandarización de ensayos y la detección de biomarcadores.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Facilita la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante la visualización de alteraciones de gangliósidos en la patología cerebral.
- Valor operativo: El protocolo adaptable permite una transición fluida desde el descubrimiento hasta los flujos de trabajo de perfilado lipídico preclínico.
- Valor científico: Apoya la desviación mecanicista de terapéuticas dirigidas a lípidos mediante la visualización directa en tejidos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba temprana de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, posibilitando específicamente flujos de trabajo centrados en lípidos en neurobiología.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los roles de los gangliósidos en la función neuronal y la patología mediante imágenes directas de tejidos.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante la deposición estandarizada de matriz con mínima deslocalización para una detección fiable de lípidos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (abundancia iónica, relaciones m/z) para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica mediante el mapeo de la distribución de gangliósidos en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la obtención de imágenes de lípidos aplicable en múltiples programas de enfermedades del SNC.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en estudios de interacción con objetivos lipídicos y modulación de vías metabólicas.
- Valor operativo: Estandarización y reproducibilidad de la preparación de muestras para IMS por MALDI de analitos lipídicos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos al reducir la ambigüedad biológica en mecanismos mediados por lípidos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos a gangliósidos basada en datos de expresión espacial.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la sección con criostato y técnicas de sublimación basadas en vacío.
- Depende de instrumentación especializada, incluidos baño de arena, trampa fría y sistemas de bomba de vacío.
- Necesita la estandarización entre equipos en cuanto al momento de deposición de la matriz y los procedimientos de manejo de tejidos.
- Implica consideraciones de adaptación para tejidos distintos del cerebral, debido a la composición lipídica y al grosor variables.
- Limitación práctica: El tiempo de sublimación debe ajustarse empíricamente para cada portaobjetos para asegurar una cobertura suficiente de la matriz.
