Name: Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprende el método SPLASH para mapear interacciones RNA-RNA en vivo a nivel genómico usando psoralen biotinilado. Esta técnica de alto rendimiento permite estudiar la dinámica del interactoma en levaduras, bacterias y células humanas.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wan y al laboratorio de Nagarajan por las discusiones informativas. N.Nagarajan es apoyado por el financiamiento de A * STAR. Y.Wan cuenta con el apoyo financiero de A * STAR y Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí, describimos en detalle el flujo de trabajo experimental y computacional para SPLASH, un método que nos permite identificar par-wise RNA interacciones en un genoma de ancho manera. Hemos utilizado exitosamente SPLASH en bacterias, levaduras y cultivos humanos y anticipamos que la estrategia puede ser ampliamente aplicada a diversos organismos bajo diferentes estados celulares. Uno de los pasos críticos en el protocolo es comenzar con al menos 20 μg de ARN reticulado para tener material adecuado para los procesos po...

Estudiar cómo las macromoléculas se pliegan e interactúan entre sí es la clave para entender la regulación genética en la célula. Aunque se ha centrado mucho esfuerzo en la última década en la comprensión de cómo el ADN y las proteínas contribuyen a la regulación de genes, se sabe relativamente menos sobre la regulación post-transcripcional de la expresión génica. El ARN lleva información tanto en su secuencia lineal como en su estructura secundaria y terciaria 1 . Su capacidad de base de pares con sí mismo y con otros es importante para su función in vivo . Los recientes avances en el sondaje de la estructura secundaria de ARN de alto rendimiento han proporcionado información valiosa sobre las ubicaciones de las regiones de doble y única hebra en el transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer información sobre los compañeros de interacción de emparejamiento sigue siendo en gran parte falta. Para determinar qué secuencia de ARN está interactuando con otra región de ARN en el transcriptoma, necesitamos información global de pares. Mapear las interacciones de ARN en pares de una manera global e imparcial ha sido tradicionalmente un desafío importante. Mientras que los enfoques anteriores, tales como CLASH 9 , hiCLIP 10 y RAP 11 , se utilizan para identificar las interacciones de ARN a gran escala, estas técnicas típicamente mapa de ARN base de emparejamiento de un subconjunto de ARN que interactúan con una proteína particular o especies de ARN. Los desarrollos recientes en el estudio de las interacciones globales de ARN incluyen el método RPL 12 , que no estabiliza las interacciones de ARN in vivo y, por tanto, sólo puede capturar un subconjunto de interacciones in vivo . Para superar estos desafíos, nosotros y otros desarrollamos estrategias genéticamenteP ARN interactomas in vivo , utilizando versiones modificadas del reticulador psoraleno 13 , 14 , 15 . En este protocolo, se describen los detalles para realizar S equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido Hybridos (SPLASH), que utiliza biotinylated psoraleno a la cruz de enlace de base RNAs in vivo , seguido por la ligación de proximidad y de alto rendimiento de secuenciación a Identificar ARN base de apareamiento asociados genoma en todo ( Figura 1 ] [ 15] . En este manuscrito, describimos los pasos para realizar SPLASH utilizando cultivos de células adherentes, en este caso las células HeLa. El mismo protocolo puede adaptarse fácilmente a las células de mamífero en suspensión ya las células de levadura y bacterias. En resumen, las células HeLa se tratan con psoraleno biotinilado y se irradian a 365 nm para reticular los pares de bases de ARN que interactúan in vivo. A continuación, los ARN se extraen de las células, se fragmentan y se enriquecen para reticular regiones usando esferas de estreptavidina. Los fragmentos de ARN que interactúan se ligan entonces juntos usando ligación de proximidad y se convierten en una biblioteca de cDNA para secuenciación profunda. Tras la secuenciación, los ARN quiméricos se asignan en el transcriptoma / genoma para identificar las regiones que interactúan con ARN que están emparejadas entre sí. Hemos utilizado exitosamente SPLASH para identificar miles de interacciones de ARN in vivo en levaduras y diferentes células humanas, incluyendo el emparejamiento de ARN intramolecular e intermolecular en diversas clases de ARNs, tales como snoRNAs, lncRNAs y mRNAs, para vislumbrar la organización estructural y los patrones de interacción De ARN en la célula.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus Escalera de ADN</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td></td></tr> escalera de <tr><td>ADN 10 bp Escalera de ADN</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015 Escalera de</td><td>ADN</td></tr><tr><td>20% solución SDS</td><td>Primera BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Solución de acetato de sodio</td><td>First BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp; &nbsp;</td><td>Necesario para la precipitación de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Solución de acrilamida al 40%/Bis, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Componente de gel de urea</td></tr><tr><td>Kit de tampón Ambion</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio, grado molecular&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>Componente de gel de urea TBE</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck</td><td>1.02445.1000</td><td>Extracción</td></tr><tr><td>de ARN ADN ligasa monocatenario</td><td>Epicentro</td><td>CL9025K</td><td>CircLigasa II ssDNA Ligasa</td></tr><tr><td>Filtros de tubo de centrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td>Costar Spin-X Filtros de tubo</td></tr><tr><td>D5628-1G DIGITONINA CRISTALINA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Para el tratamiento celular</td></tr><tr><td>Transiluminador de lector oscuro&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transiluminador</td> de <td>luz azul Transiluminador</td></tr> de <tr><td>gel de ADN Tinte de carga (6x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Requerido para la electroporación de gel</td></tr><tr><td>de agarosa Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Para el cultivo de células Hela</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas de estreptavidina</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Estreptavidina C1&nbsp;</td></tr><tr><td>Soporte magnético para 15&nbsp; Tubos mL</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Soporte magnético para 15&nbsp; Tubos mL</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Psoraleno biotinilado</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Bombilla UV de 365 nm</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Componentes del medio Hela</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>Componente en el tampón de hibridación</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>Bombilla UV de 254 nm</td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Necesario para la precipitación de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Espectrofotómetro Nanodrop 2000</td><td>para la cuantificación de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasasa&nbsp;</td><td>Primera BASE</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Componentes del medio Hela</td></tr><tr><td>ADN polimerasa de alta fidelidad (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion con tampón HF (2x)</td></tr><tr><td>Juego de imprimaciones 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>Imprimaciones de PCR</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de ADN</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>Kit de extracción de gel QIAquick</td></tr><tr><td>Kit de cuantificación fluorométrica</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td></tr> kit <tr><td>de limpieza de ARN</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Columna de membrana de sílice</td></tr><tr><td>Inhibidor de la rnasa</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>Síntesis de primera cadena SuperScript III</td></tr><tr><td>Tinción de gel de ácido nucleico</td> SuperMix <td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Enzima de reparación de extremos</td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzima para ligadura de proximidad</td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 2, truncada KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzima para ligadura de adaptadores</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Componente de gel de urea</td></tr><tr><td>Tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; Reactivo para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>Urea</td><td>First BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>Transiluminador UV</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Para la visualización de bandas</td></tr><tr><td>Xileno Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Limpieza de ADN</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Concentrador de ADN Zymo-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Lista de software necesario</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC software</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>SeqPrep software</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>software BWA</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>software SAMTOOLS</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ software</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>STAR software</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py script PYTHON</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py script PYTHON</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk Script</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Buffer composition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 M acetato</td><td></td><td></td><td></td> de sodio</tr><tr><td>< tampón >lisis fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td> Agregue siempre Superase-in fresco antes de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>usar, excepto cuando lave las perlas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><tampón >Proteinasa K&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Tampón de hibridación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% formamida (almacenar en la oscuridad a 4 & grados; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Agregue siempre Superase-in fresco antes de usar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><tampón de lavado fuerte>2x SSC</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaCl y citrato de sodio (SSC) (diluido a partir de 20x caldo de Invitrogen SSC)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>2x tampón de fragmentación de ARN</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>2x Carga de ARN Colorante</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Formamida</td> 0,02% SDS 0,02% azul de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> bromofenol <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01% Xileno Cianol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' Secuencia del adaptador de ARN: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT secuencia de cebadores: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

mapeo de las interacciones rna-arn a nivel mundial usando psoralen biotinilado

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Saber cómo interactúan los ARN con ellos mismos y con otros es clave para entender la regulación de genes basada en ARN en la célula. Aunque se ha demostrado que los ejemplos de interacciones ARN-ARN, tales como las interacciones ARNm-ARNm, regulan la expresión génica, se desconoce hasta qué punto se producen las interacciones ARN en la célula. Los métodos anteriores para estudiar las interacciones de ARN se han centrado principalmente en subconjuntos de ARN que están interactuando con una proteína particular o especies de ARN. Aquí, detallamos un método llamado S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a todo el genoma de captura de ARN interacciones in vivo de manera imparcial. SPLASH utiliza reticulación in vivo , ligación de proximidad y secuenciación de alto rendimiento para identificar socios de unión de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares a nivel mundial. SPLASH puede aplicarse a diferentes organismos, incluyendo bacterias, levaduras y células humanas,S diversas condiciones celulares para facilitar la comprensión de la dinámica de la organización del ARN en diversos contextos celulares. Todo el protocolo SPLASH experimental tarda aproximadamente 5 días en completarse y el flujo de trabajo computacional tarda aproximadamente 7 días en completarse.

La figura 1 muestra el esquema del flujo de trabajo SPLASH. Tras la adición de psoraleno biotinilado en presencia de 0,01% de digitonina y reticulación UV, se extrae el ARN total de las células y se realiza una transferencia de puntos para asegurar que la reticulación del biotinilado al ARN se ha producido de manera eficiente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controles positivos para titular la cantid...

Aquí, se detalla el método de S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH), que permite el genoma de la cartografía de todo el intramolecular y intermolecular RNA-ARN interacciones in vivo . SPLASH puede ser aplicado para estudiar interactones de ARN de organismos incluyendo levaduras, bacterias y seres humanos.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

El objetivo general de este video es describir el método de secuenciación de híbridos ligados y seleccionados con entrecruzamiento por psoraleno, o SPLASH, mediante el cual se mapean de manera genómica las interacciones por pares de ARN-ARN in vivo. Esta técnica es un método sencillo y de alto rendimiento para mapear interacciones de ARN in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica de ARN, como cómo interactúan entre sí diferentes regiones a lo largo de una sola cadena de ARN o entre diferentes cadenas de ARN.Aunque este método puede proporcionar información sobre células de levadura y humanas, también puede aplicarse a estudios en otros organismos modernos, incluyendo bacterias y membranas en células. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando deseábamos encontrar una manera de mapear interacciones moleculares. Tenga en cuenta que el siguiente procedimiento contiene varios puntos de interrupción.En estos momentos, el experimento puede pausarse brevemente o indefinidamente. Los detalles se pueden encontrar en el texto adjunto. Comience este procedimiento lavando las células HeLa dos veces con cinco mililitros de PBS.Coloque el

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Transcripciones de ARN están sujetas a numerosas normas posttranscriptional que está mediada por una multitud de trans-acción ARN-proteínas de unión (prácticas comerciales restrictivas). Aquí presentamos un método generalizable para identificar con precisión y en una escala de transcriptoma en todo los sitios de unión a ARN de las prácticas comerciales restrictivas.

PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Un protocolo detallado para la aplicación de la haga clic en ayuda de química RNA interactoma estrategia de captura (CARIC) para identificar proteínas de enlace de codificación de ambas y los RNAs se presenta.

Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia

Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.

Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Aquí, presentamos un método in vitro optimizado para descubrir, cuantificar y validar interactores de proteínas de secuencias específicas de ARN, utilizando extracto de proteína total de células humanas, perlas de estreptavidina recubiertas con ARN biotinilado y análisis de espectrometría de masas.

Un análisis extraíble cuantitativo optimizado de proteínas de unión al ARN utilizando ARN biotinilado corto

Aprende el método SPLASH para mapear interacciones RNA-RNA en vivo a nivel genómico usando psoralen biotinilado. Esta técnica de alto rendimiento permite estudiar la dinámica del interactoma en levaduras, bacterias y células humanas.

Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

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