Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

El objetivo general de este vídeo es describir el método de secuenciación de híbridos ligados y seleccionados reticulados con psoraleno o SPLASH en el que las interacciones ARN-ARN in vivo por pares se mapean en todo el genoma. Esta técnica es un método simple y de alto rendimiento para mapear la interacción del ARN in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica del ARN, como por ejemplo, cómo interactúan entre sí las diferentes regiones a lo largo de una sola cadena de ARN o entre diferentes cadenas de ARN.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la levadura y las células humanas, también se puede aplicar a estudios en otros organismos modernos, incluidas las bacterias y la membrana en las células. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando quisimos encontrar una forma de mapear la interacción molecular. Tenga en cuenta que el siguiente procedimiento contiene varios puntos de parada.

En estos momentos, el experimento puede detenerse brevemente o indefinidamente. Los detalles se pueden encontrar en el texto adjunto. Comience este procedimiento lavando las células HeLa dos veces con cinco mililitros de PBS.

Coloque el plato verticalmente durante un minuto para escurrir completamente el exceso de PBS. A continuación, agregue un mililitro de PBS que contenga 200 micromolares de psoraleno biotinilado y 0,01% de digitonina que aumenta la permeabilidad celular. Tenga cuidado de agregar la solución de manera uniforme sobre la superficie de las celdas.

Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, retire la tapa del plato y colóquelo en hielo dentro de un reticulante UV a tres centímetros de la bombilla UV. Irradiar con UV de 365 nanómetros durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, retire la placa del reticulante y luego aísle el fragmento y precipite el ARN de las células HeLa de acuerdo con las instrucciones del documento adjunto. Cargue la escalera desnaturalizada y las muestras de ARN en un gel cuadrado de 8,6 centímetros con 6%TBE-urea. Tamaño fraccionado por electroforesis a 180 voltios durante 40 minutos.

Tiñir el gel con 10 mililitros de tampón TBE que contenga una dilución 1:10.000 de tinción de gel de ácido nucleico durante cinco minutos en la oscuridad. Mientras el gel se mancha, usa una aguja de calibre 24 para perforar un tubo de microfuga limpio de 0,6 mililitros en la parte inferior. Colócalo en un tubo de microfuga de dos mililitros.

Con un transiluminador, visualice las bandas en el gel post-teñido y corte una rodaja de gel correspondiente a 90 a 110 nucleótidos. Transfiera la rebanada de gel al tubo de microfuga perforado de 0,6 mililitros en el tubo de microfuga de dos mililitros. La selección del tamaño nos permite establecer la longitud mínima de los fragmentos quiméricos y distinguir entre productos ligados y productos no ligados más adelante.

Centrifugar las rodajas de gel a 12.000 veces g a temperatura ambiente durante dos minutos para triturar la rodaja de gel y recogerla en el tubo de microfuga de dos mililitros. Después del centrifugado, deseche el tubo de microfuga vacío de 0,6 mililitros. A la loncha de gel triturada, agregue 700 microlitros de tampón de elución.

Incubar a cuatro grados centígrados durante la noche con rotación constante para permitir la difusión de las muestras en el tampón. Transfiera las rodajas de gel y el tampón de elución a un filtro de tubo de centrífuga y centrifugue a 20.000 veces g durante 20 minutos. Después del centrifugado, las rodajas de gel quedarán atrapadas en el compartimento superior del filtro, lo que puede desecharse.

Precipitar y cuantificar el ARN tal y como se describe en el documento adjunto. Congele rápidamente y almacene el ARN a menos 80 grados Celsius en nitrógeno líquido hasta que se use. Para enriquecer las regiones de reticulación de ARN, comience agregando 100 microlitros de tampón de lisis que contenga inhibidor de ARNasa para lavar las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en un tubo de microfuga.

A un tubo de centrífuga cónico de 15 mililitros, agregue dos mililitros de tampón de hibridación recién preparado, un mililitro de tampón de lisis suplementado, 1,5 microgramos de ARN fraccionado de tamaño y 100 microlitros de perlas resuspendidas. Agita el tubo suavemente. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos con rotación de extremo a extremo.

Después de la incubación, lave las perlas cinco veces con tampón de lavado precalentado. Al final del quinto lavado, coloque el tubo de microfuga que contiene las perlas en el soporte magnético durante un minuto y luego retire el tampón de lavado. Agregue un mililitro de tampón de polinucleótido quinasa T4 frío a las perlas lavadas.

Incubar las perlas durante cinco minutos a cuatro grados centígrados con rotación de extremo a extremo. Coloque el tubo de microfuga que contiene las perlas en la tira magnética. Después de un minuto, retire suavemente el tampón.

Repita este paso para un total de dos lavados y retire el tampón después del último lavado. A continuación, siga las instrucciones del documento adjunto para convertir los cinco extremos primos y tres primos para que sean compatibles con la ligadura y realice la ligadura de proximidad. Después de un lavado, agregue 100 microlitros de tampón PK de ARN a las perlas y vuelva a suspenderlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Caliente las muestras a 95 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque de calor. A continuación, enfríe la muestra en hielo durante un minuto. Añadir 500 microlitros de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio a la muestra.

Mezcle en vórtice vigorosamente durante 10 segundos. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, use un kit para precipitar, limpiar y recuperar el ARN, asegúrese de que se conserven incluso los ARN pequeños.

Eluir el ARN en 100 microlitros de agua libre de nucleasas. Transfiera 100 microlitros de las muestras eluidas a un pocillo de una placa de 24 pocillos en nice. Manteniendo la muestra en hielo, la radiación UV la irradia a 254 nanómetros durante cinco minutos.

Transfiera la muestra reticulada inversa a un tubo de microfuga limpio. Agregue 10 microlitros de acetato de sodio, un microlitro de glucógeno y 300 microlitros de etanol al 100%. Precipite el ARN a menos 20 grados centígrados durante al menos una hora.

Para recuperar el ARN, centrifugar el ARN precipitado a 20.000 veces g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, retire el sobrenadante y agregue un mililitro de etanol frío al 70% para lavar la bolita de ARN. Centrifugar el pellet lavado a 20.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Retire el tampón de lavado y agregue 4,25 microlitros de agua libre de nucleasas para resuspender el ARN. Transfiera el ARN a un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Por último, transcriba inversamente, circularice y amplifique el ADNc de acuerdo con las instrucciones del documento adjunto.

Este esquema muestra el flujo de trabajo de SPLASH. Tras la adición de psoraleno biotinilado en presencia de 0,01% de digitonina y reticulación UV, se extrae el ARN total de las células y se realiza una transferencia de puntos para garantizar que la reticulación sea eficiente. A continuación, se utilizan oligonucleótidos biotinilados de 20 bases como controles positivos para valorar la cantidad de psoraleno biotinilado que se debe añadir a las células, de modo que aproximadamente una de cada 150 bases esté reticulada.

A continuación, se realiza la amplificación por PCR a pequeña escala utilizando un número creciente de ciclos de PCR para determinar el número mínimo de ciclos necesarios para la secuenciación profunda. En un proceso eficiente de preparación de bibliotecas, una biblioteca de secuenciación de ADNc se puede amplificar a partir de una entrada de ARN seleccionada de 1,5 microgramos en menos de 15 ciclos de amplificación por PCR. A continuación, la biblioteca se secuencia utilizando dos lecturas de 150 pares de bases en una máquina de secuenciación alta.

A continuación, las lecturas de secuenciación se procesan de acuerdo con la canalización computacional. El resultado final es una lista de interacciones quiméricas filtradas que incluye interacciones ARN-ARN intramoleculares e intermoleculares en el transcriptoma. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la incorporación de psoraleno biotinilado cuando se usa SPLASH en nuevos organismos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN exploraran las interacciones del ARN en diversos organismos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer una biblioteca de secuenciación que capture las interacciones de ARN por pares globalmente en la célula.