Una Cámara personalizable para medir la migración celular

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una forma sencilla de estudiar los efectos de los agentes quimiotácticos y quimiórepulsivos en la migración celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de interacción celular, como los efectos de diferentes factores de crecimiento en la cicatrización de heridas. La principal ventaja de esta técnica es que es fácilmente personalizable para diferentes aplicaciones y fácil de usar para investigadores de todos los niveles.

Aniqa Chowdhury, estudiante de pregrado, y Tyler Harvey, estudiante de posgrado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para empezar, crea un archivo CAD con la forma deseada del microcanal. Ajuste el ancho y la longitud del canal para lograr el gradiente requerido.

Aquí, cuadrados de 2,254 centímetros están conectados por un canal de 0,127 centímetros de ancho. A continuación, obtenga una pieza de acrílico que tenga el grosor deseado para crear la profundidad adecuada del microcanal. Un ancho de lámina acrílica de aproximadamente un dieciseisavo de pulgada es ideal, ya que las láminas más gruesas son difíciles de cortar y las láminas muy delgadas pueden romperse o deformarse durante el proceso.

Importe el archivo CAD en un aparato de corte por láser y coloque la pieza acrílica en la superficie de corte. Luego corte la cámara, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque el recorte acrílico en forma de barra recién cortado en una pequeña placa de Petri y cúbrala hasta que la necesite.

En un recipiente de pesaje, agregue diez partes de una base de elastómero, con una parte del agente de curado y revuelva con una micropipeta durante cinco minutos. Transfiera la mezcla a una cámara de vacío y tire de una aspiradora durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas en el PDMS. Cuando termine, apague la aspiradora y retire el bote de pesaje.

Vierta el PDMS desgasificado encima de un recorte acrílico en forma de barra en una pequeña placa de Petri. Asegúrese de que el PDMS cubra completamente el inserto. Deje que el PDMS se cure durante al menos 18 horas a temperatura ambiente, luego corte con cuidado el PDMS alrededor de la pieza acrílica con un bisturí y retire el inserto.

En un gabinete de cultivo celular estándar, coloque la cámara de microcanales en una placa de Petri, con la característica hacia arriba y cúbrala completamente con etanol al 70%. Luego cierre el capó y encienda la luz ultravioleta. Exponga la cámara a la luz ultravioleta durante una o dos horas.

Después de la exposición, abra la campana de flujo laminar y espere 15 minutos para que la campana de flujo restablezca el flujo. A continuación, retire el etanol al 70% y lave las cámaras dos veces con PBS estéril. Use un mililitro de PBS para cada lavado.

Después del lavado final, retire el PBS y deje que las cámaras se sequen durante la noche sin las tapas. Coseche el tipo de celda que se va a probar y agregue 100 microlitros de la suspensión de celda a 400 microlitros de azul de tripano al 0,4% y mezcle suavemente. Aplique 100 microlitros de esta solución al hemocitómetro llenando suavemente ambas cámaras debajo del cubreobjetos de vidrio.

Use un microscopio con un objetivo de 10x para enfocar la rejilla del hemocitómetro. A continuación, utilice un contador manual para contar las células vivas y no sostenidas dentro de los cuatro conjuntos de 16 cuadrados del hemocitómetro. Divida el número total de células por cuatro y multiplique este número por 50.000 para obtener el número de células por mililitro de suspensión celular.

Con base en este cálculo, agregue 2500 celdas y 100 microlitros de medio a un pocillo en cada cámara. Deje que las células permanezcan en la cámara durante 60 minutos y luego agregue medios adicionales. Para comenzar, agregue agarosa al agua y caliente la solución en un microondas durante un minuto, o hasta que la agarosa se haya disuelto por completo y la solución esté clara.

Deje que la solución se enfríe durante 15 a 30 segundos antes de verterla en una placa de Petri. Para eliminar las burbujas, coloque la placa de Petri en una cámara de vacío y deje que la agarosa se solidifique mientras está bajo el vacío durante 30 minutos. Una vez solidificado, corte un cubo de agarosa de dos milímetros por dos milímetros con un bisturí de la placa de Petri.

Sumerja completamente el cubo en una solución que contenga la concentración deseada del factor táctico de quimioterapia y remoje el bloque de agarosa durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, coloque el bloque de agarosa que contiene el factor táctico de quimioterapia en el extremo más alejado de la cámara del microcanal. Utilice un marcador, como microperlas de poliestireno o un defecto microscópico en la cámara.

Para identificar la ubicación inicial relativa de las celdas. Utilice el software de imágenes para tomar imágenes de lapso de tiempo del frente de la célula en movimiento cada hora durante 12 horas. La serie de imágenes que se muestran aquí documenta el movimiento de un frente celular a través del canal en respuesta a un gradiente de suero fetal bovino colocado en el extremo opuesto del canal.

La distancia de migración se midió en función de la distancia del frente de crecimiento a un defecto microscópico en el dispositivo. A partir de estas mediciones, se encontró que la velocidad promedio del frente celular era de 13,4 micrómetros por hora. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro horas, con 18 horas adicionales de tiempo de espera para que el PDMS se cure, y 12 horas adicionales para las imágenes de lapso de tiempo.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que investigadores de diferentes niveles de habilidad, incluidos estudiantes de pregrado con poca experiencia en laboratorio, exploraran fácilmente la cicatrización de heridas y la migración celular in vitro. Al intentar este procedimiento, es importante recordar retirar con cuidado el inserto acrílico del molde de PDMS para garantizar la producción exitosa de una cámara de microcanal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir una cámara de microcanal simple para estudiar la migración celular en respuesta a diferentes señales químicas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden estudiar otras señales, como múltiples gradientes químicos solubles, sustratos, fluidos y campos eléctricos para estudiar el efecto que tienen en la migración celular. No olvide que trabajar con cortadoras láser puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como obtener la capacitación adecuada y usar equipo de protección personal mientras se realiza este procedimiento.