Name: La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1 + Progenitores pancreáticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a diferenciar células madre pluripotentes humanas en progenitores pancreáticos NKX6.1+ mediante un protocolo de cuatro etapas. Este método genera altos porcentajes de células progenitoras para estudiar el desarrollo pancreático humano in vitro y avanzar en investigaciones sobre diabetes.

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Este manuscrito fue financiada por la Fundación General de Toronto y Occidental y el Premio de Graduados Red de Salud Banting y Best Diabetes Centro-Universidad.

1. Preparación de Soluciones y Medios NOTA: Preparar todos los medios para el cultivo de células en un ambiente estéril. Los medios de comunicación tiene que ser realizada y utilizada inmediatamente. Detalles de reactivos se proporcionan en la Tabla de Materiales. <ol><li> medio de diferenciación <ol><li> Preparar Día 0 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 2 mM CHIR 99021, 100 ng / ml de activina A, 10 4 M MTG. </li><li> Preparar Día 1-2 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 100 ng / ml de activina A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml de bFGF, ácido 50 mg / ml ascórbico. </li><li> Preparar Día 3-5 Diferenciación Medio: Medio RPMI con 1% de glutamina, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 M Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Preparar Día 6-7 Diferenciación Medio: DMEM con 1% de glutamina, 1% B27, 50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 M SANT-1, 2 M ácido retinoico, 50 ng / ml NOGGIN. NOTA: retinoicoEl ácido debe añadirse a los medios de comunicación y los medios última debe protegerse de la luz para evitar la degradación oxidativa 15. </li><li> Preparar Día 8-12 Diferenciación Medio: DMEM con 1% de glutamina, 1% B27, 50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF, mM Nicotinamida 10. </li></ol></li><li> Preparar tampón de FACS: 10% de FBS en PBS, menos calcio y magnesio. </li></ol> Diferenciación 2. HESC NOTA: HESC se descongelan, a pases y se expandió en fibroblastos embrionarios de ratón irradiado en presencia de un medio de comunicación basado en KOSR suplementado con bFGF 16. Células madre embrionarias humanas están listos para la diferenciación cuando las células alcanzan 80-95% de confluencia. En este momento las colonias deben ser grandes con bordes definidos y un &#39;en forma de cúpula &quot;estructura (Figura 1A). Todo cultivo celular se realiza en de fondo plano, placas tratadas de cultivo de tejidos recubiertos con 0,1% de gelatina. Típicamente, las células se cultivan en 6 oplacas de 12 pocillos, en volúmenes de medios de 2 ml o 1 ml, respectivamente. <ol><li> En el día 0, comienza la diferenciación mediante la sustitución de los medios de comunicación basada en KOSR con el Día 0 Diferenciación de Medios. </li><li> En los días 1 y 2, agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de la monocapa antes de aspirar. Reemplazar con el Día 1-2 Diferenciación de Medios. </li><li> El día 3, las células de la cosecha para citometría de flujo. Si las células expresan más de un 90% CXCR4 + / CD117 +, continúe en el paso 2.4. </li><li> En los días 3 y 5, agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de la monocapa antes de la aspiración. Reemplazar con el Día 3-5 Diferenciación de Medios. </li><li> En los días 6 y 7, reemplace con el Día 6-7 Diferenciación de Medios. </li><li> En los días 8, 10 y 12, reemplace con el Día 8-12 Diferenciación de Medios. </li><li> En el día 13, las células de la cosecha para citometría de flujo para determinar PDX1 y expresión NKX6-1. </li></ol> 3. Las células de cosecha para el análisis de citometría de flujo <ol><li> Disociar las células consolución de tripsina comercial 1x según el protocolo del fabricante y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Eliminar la solución de tripsina comercial y resuspender las células individuales en 1.000 l de tampón FACS con 30 l de DNasa I. </li><li> celdas de filtración usando un filtro de células de malla de nylon de 35 micras y transferir a un tubo de microcentrífuga. </li><li> centrifugar las células a 455 xg durante 5 min. Preparar células para la tinción en vivo o fijo. </li></ol> 4. La tinción para citometría de flujo <ol><li> El flujo de preparación para la tinción en vivo en el día 3 <ol><li> Resuspender las células en 1.000 l de tampón FACS. Transferencia de 200 l (aproximadamente 1-3 x 10 5 células) en dos pocillos de una placa de 96 pocillos (para ambas muestras no teñidas y manchadas). </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Mancha con anticuerpos primarios conjugados, CXCR4: APC y CD117: PE (ver Tabla) M ateriales para 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz. </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Volver a suspender las muestras en 100 l de tampón FACS. </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Resuspender cada muestra y la transferencia en un volumen total de 300 a 500 l de tampón FACS a 1 ml microtubos de ensayo o tubos de 5 ml de fondo redondo. </li><li> Las muestras se ejecutan en el citómetro de flujo 17. Si las muestras no pueden ejecutarse de inmediato, se almacena a 4 ° C al abrigo de la luz. </li></ol></li><li> Flujo preparación para la tinción fija en día 13 <ol><li> Resuspender el sedimento celular en solución de fijación / permeabilización comercial durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la muestra a 455 xg durante 5 min. Volver a suspender en 400 l solución de Perm / Wash. </li><li> Transferir 200 l de la muestra (aproximadamente 0,5-1 x 10 6 células) a two pocillos de una placa de 96 pocillos (para el control de IgG y PDX1 tinción / NKX6-1). Centrifugar a 931 xg durante 2 min. </li><li> Volver a suspender los sedimentos celulares en 100 l solución de Perm / Wash contiene anti-PDX1 y anticuerpos anti-NKX6-1 de control primario o isotipo (véase la Tabla de Materiales). Incubar toda la noche a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. Volver a suspender las muestras en 100 l solución de Perm / Wash. </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Volver a suspender las muestras en 100 l de Perm / Wash que contienen anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 hora protegido de la luz. </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Volver a suspender las muestras en 100 l de Perm Solución / lavado. </li><li> Centrifugar la placa a 931 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. </li><li> Repscoma paso 4.2.9 y 4.2.10. </li><li> Resuspender cada muestra y la transferencia en un volumen total de 300 a 500 l de tampón FACS a 1 ml microtubos de ensayo o tubos de 5 ml de fondo redondo. </li><li> Las muestras se ejecutan en el citómetro de flujo 17. Si las muestras no pueden ejecutarse de inmediato, se almacena a 4 ° C al abrigo de la luz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
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<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
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<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Generar con éxito NKX6-1 + progenitores pancreáticos de hPSCs in vitro se basa en el uso de cultivos de alta calidad de hPSCs y diferenciación dirigida que implican la regulación precisa de determinadas vías de señalización que regulan etapas de desarrollo clave durante el desarrollo de páncreas. Aunque este protocolo se puede utilizar para inducir la expresión robusta de NKX6-1 través de una variedad de líneas de HPSC como se muestra previamente 3, para asegurar la generación...

La prevalencia de la diabetes está en aumento y según la Asociación Canadiense de Diabetes, se estima que más de 11 millones de personas en Canadá son diabéticos o prediabéticos, con 5-10% de estas personas que tienen diabetes tipo 1 (DM1) 1. T1D es una enfermedad autoinmune que se produce por la destrucción de las células beta productoras de insulina que se encuentran dentro de los islotes de Langerhans. En la actualidad, las personas que viven con diabetes tipo 1 requieren fuentes exógenas de la insulina 2. A pesar de los avances en la terapia con insulina, los pacientes T1D siguen teniendo dificultades para regular sus niveles de glucosa en sangre y continúan sufriendo tanto hipoglucemia y la hiperglucemia. Una forma prometedora de tratamiento para restaurar la normoglucemia en T1D es el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs), que podrían utilizarse para generar un suministro ilimitado de células productoras de ß tanto in vivo como in vitro 3 insulina, <shasta class = &quot;xref&quot;&gt; 4, 5, 6, 7. La diferenciación de hESCs a ß-como las células podrían hacer posible el estudio de la diabetes in vitro, lo que permite la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la diabetes tipo 2 y proporcionar células para el trasplante en pacientes T1D. El intento más exitoso en la generación de células productoras de insulina a partir de hESCs in vitro es de recapitular los eventos embrionarias que se producen durante el desarrollo de páncreas 4, 5. Esta consiste en la manipulación de distintas vías de señalización para modelar con precisión las etapas clave del páncreas en desarrollo. Desarrollo pancreático comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se caracteriza por la expresión de CXCR4 y CD117 (c-KIT) 8, 9. La regulación precisa de DefinitSe requiere organización endodermo ive para la formación del tubo intestinal, que a continuación se somete anterior-a-posterior patrón y-ventral dorsal. El dorsal y las yemas de páncreas ventral emergen de la región del intestino anterior posterior que expresa el gen homeobox pancreática y duodenal (Pdx1), que es necesaria para el desarrollo de páncreas 10. El dorsal y ventral brotes se fusionan para formar el páncreas, que luego se somete a una amplia remodelación epitelial y expansión 11. Compromiso con el endocrino y exocrino linaje va acompañada de la generación de células progenitoras multipotentes (PSM) que expresan, entre otros, los factores de transcripción Pdx1, Nkx6.1 y Ptf1a 12, 13. PSM que se convertirán en células endocrinas y ductales continúan expresando Nkx6-1 la vez que disminuye la expresión Ptf1a. Contrariamente a esto, las células exocrinas del linaje perderán expression de Nkx6-1 y mantener la expresión Ptf1a 12. El factor de transcripción Nkx6-1 tiene un papel clave en el desarrollo de páncreas, particularmente durante la diferenciación de las células progenitoras endocrinas a las células ß. Como se ha descrito anteriormente, la supresión de los resultados en la formación de Nkx6-1 deteriorada de las células beta durante el desarrollo de páncreas 14. Por lo tanto, la generación de células beta productoras de insulina tanto in vitro como in vivo requiere la inducción eficiente de Nkx6-1. Recientemente hemos desarrollado un protocolo para generar eficientemente PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos de hPSCs. Estos progenitores pancreáticos derivados de HPSC generan células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes 3. El protocolo de diferenciación se puede dividir en 4 etapas características de: 1) la inducción endodermo definitivo, 2) el patrón posterior intestino anterior, 3) la especificación de páncreas y 4) la inducción NKX6-1. A continuación se realiza una descripción detallada de cada paso de la diferenciación dirigida.

<table><tbody><tr><td><fuerte>medios y citoquinas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activina A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td> Life <td>Technologies</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Tampón Perm/Wash, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medio 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), rojo fenol</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Anticuerpos para citometría de flujo (diluciones de trabajo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugado (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Cabra IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Ratón de control de isotipo IgG&nbsp;</td><td>Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc.&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Control de isotipo Cabra IgG</td><td>R& D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2.000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

la diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitores pancreáticas

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Las células madre pluripotentes tienen la capacidad de auto renovarse y diferenciarse a múltiples linajes, por lo que una fuente atractiva para la generación de células progenitoras pancreáticas que se puede utilizar para el estudio de y el tratamiento futuro de la diabetes. En este artículo se describe un protocolo de diferenciación de cuatro etapas diseñado para generar células pancreáticas progenitoras a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs). Este protocolo se puede aplicar a una serie de líneas de células madre pluripotentes humano (HPSC). El enfoque adoptado para generar células progenitoras pancreáticas es diferenciar hESCs para modelar con precisión las etapas clave del desarrollo de páncreas. Esto comienza con la inducción de la endodermo definitivo, que se consigue cultivando las células en presencia de activina A, factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y CHIR990210. Una mayor diferenciación y el patrón con el factor de crecimiento de fibroblastos 10 (FGF10) y Dorsomorphin genera células se asemejan al intestino anterior posterior. La adición de RetinOico, NOGGIN, SANT-1 y FGF10 diferencia a las células del intestino anterior posterior en las células propias del endodermo pancreático. Finalmente, la combinación de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), nicotinamida y NOGGIN conduce a la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 células. La citometría de flujo se realiza para confirmar la expresión de marcadores específicos en las etapas clave del desarrollo de páncreas. Los + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos PDX1 al final de la etapa 4 son capaces de generar células beta maduras en el trasplante dentro ratones inmunodeficientes y pueden diferenciarse además para generar células productoras de insulina in vitro. Por lo tanto, la generación eficiente de PDX1 + / + NKX6-1 progenitores pancreáticos, como se demuestra en este protocolo, es de gran importancia, ya que proporciona una plataforma para estudiar el desarrollo de páncreas humano in vitro y proporciona una fuente de células con el potencial de diferenciarse de células ß que podrían eVentually ser utilizado para el tratamiento de la diabetes.

Generación eficiente de progenitores pancreáticos se basa en el buen crecimiento y mantenimiento de las células no diferenciadas, seguido de la adición precisa de moléculas de señalización específicas durante el protocolo de diferenciación, como se ilustra en el esquema de la Figura 1A. En el día 0, las células no diferenciadas deben ser 80 a 95% de confluencia y colonias deben tener bordes definidos (Figura 1A). En la etapa 1, los medios de comunicación...

Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

El objetivo general de este procedimiento es generar de manera eficiente precursores pancreáticos que expresen NKX6.1 a partir de células madre pluripotentes humanas in vitro, diferenciando las células a través de cuatro etapas clave del desarrollo pancreático. Al diferenciar células madre pluripotentes humanas a través de cuatro etapas clave del desarrollo pancreático, este protocolo proporciona un modelo para estudiar el desarrollo del páncreas humano in vitro. La principal ventaja de esta técnica frente a los protocolos existentes es que somos capaces de generar altos porcentajes de células precursoras pancreáticas positivas para NKX6.1 utilizando diversas líneas de células madre pluripotentes humanas.Dado que los progenitores pancreáticos tienen la capacidad de generar células similares a las beta productoras de insulina, esta técnica nos brindará la oportunidad de desarrollar células para el tratamiento de la diabetes, para el descubrimiento de fármacos y para la modelización de enfermedades. En el día cero, inicie la diferenciación reemplazando el medio con sustituto sérico KnockOut por el medio de diferenciación del día cero. Luego, en los días uno y dos, agite suavemente la placa para eliminar cualquier célula muerta de la monocapa antes de aspirar el medio.Posteriormente, sustitúyalo por el medio de diferenciación de día uno a dos. En el día tres, recolecte las células para citometría de flujo. Si las células expresan más del 90 % de CXCR4 y CD117, se ha alcanzado la eficiencia.Luego, agite suavemente la placa para eliminar cualquier célula muerta de la monocapa antes de la aspiración y sustitúyala por medio de diferenciación de día tres a cinco. Es importante asegurar una inducción eficiente del endodermo definitivo para el día tres mediante citometría de flujo. Si el porcentaje de células que expresan tanto CXCR4 como CD117 es inferior al 90 %, es probable que la diferenciación hacia precursores pancreáticos se vea comprometida.Los días seis y siete, reemplace el medio con el medio de diferenciación de los días seis a siete. Los días ocho, 10 y 12, reemplace el medio con el medio de diferenciación de los días ocho a 12. Luego, el día 13, recolecte las células para citometría de flujo con el fin de determinar la expresión de PDX1 y NKX6.1.Para recolectar las células para el análisis por citometría de flujo, separe las células con una solución comercial de tripsina siguiendo el protocolo del fabricante e incube las células a 37 grados Celsius durante tres minutos. Después de tres minutos, retire la solución de tripsina y vuelva a suspender las células individuales en 1.000 microlitros de tampón fax con 30 microlitros de DNA One. A continuación, filtre las células utilizando un filtro celular de malla de nailon de 35 micrómetros y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga.Centrifugue las células a 455 veces g durante cinco minutos antes de prepararlas para la tinción viva o fijada. Ahora, re-suspenda las células en 1,000 microlitros de tampón fax. Transfiera 200 microlitros a dos pocillos de una placa de 96 pocillos para las muestras no teñidas y teñidas.Posteriormente, centrifugue la placa a 931 ×g durante dos minutos, luego elimine el sobrenadante invirtiendo la placa, tiña las células con el anticuerpo conjugado primario en un volumen final de 100 µL durante 30 minutos a temperatura ambiente y protéjalas de la luz. A continuación, centrifugue la placa a 931 ×g durante dos minutos, transcurridos los dos minutos, elimine el sobrenadante invirtiendo la placa. Después de eso, re-suspenda las muestras en 100 µL de tampón fax.Luego, centrifugue la placa a 931 ×g durante dos minutos. Y elimine el sobrenadante invirtiendo la placa. A continuación, re-suspenda las muestras en 300 a 500 microlitros de tampón fax, transfiéralas a los tubos microtest de un mililitro o a los tubos redondos de fondo de cinco mililitros y analice las muestras en el citómetro de flujo.Si las muestras no se pueden analizar inmediatamente, almacénelas a cuatro grados Celsius y protéjalas de la luz. En este procedimiento, re-suspenda el botón celular en solución comercial de fijación y permeabilización durante 24 horas a cuatro grados Celsius. Después de 24 horas, centrifugue la muestra a 455 ×g durante cinco minutos, luego re-suspenda el sedimento en 400 microlitros de solución comercial de lavado permeabilizante.A continuación, transfiera 200 microlitros de la muestra a dos pocillos de una placa de 96 pocillos para el control de IGG y la tinción de PDX1 y NKX6.1, y centrifugue la placa a 931 ×g durante dos minutos. Luego, re-suspenda los pellet celulares en 100 microlitros de solución de permeabilización y lavado comercial que contenga los anticuerpos primarios anti-PDX1 y anti-NKX6.1 o los controles isotópicos. Incube toda la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, centrifugar la placa a 931 veces g durante dos minutos, eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa y volver a suspender las muestras en 100 microlitros de la solución comercial de permeabilización y lavado. A continuación, centrifugar la placa a 931 veces g durante dos minutos. Eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa.Luego, volver a suspender las muestras en 100 microlitros de solución de permeabilización y lavado que contenga anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora, protegiendo de la luz. Después de una hora, centrifugar la placa a 931 ×g durante dos minutos, luego eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa; a continuación, volver a suspender las muestras en 100 microlitros de solución comercial de permeabilización y lavado, centrifugar la placa a 931 ×g durante dos minutos, y eliminar el sobrenadante invirtiendo la placa. Luego, volver a suspender la muestra en 100 microlitros de solución comercial de permeabilización y lavado y centrifugar la placa a 931 ×g durante dos minutos nuevamente antes de eliminar el sobrenadante.A continuación, re-suspenda las muestras en 300 a 500 microlitros de tampón de fax y transfiéralas a tubos de ensayo separados de un mililitro o a tubos redondos de fondo de cinco mililitros para realizar citometría de flujo. Aquí se muestra un esquema de la inducción de progenitores pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas, que indica el día de diferenciación, la etapa del desarrollo, el medio base y las citocinas añadidas en cada etapa. Y aquí se presentan las imágenes de contraste de fase en las etapas clave de la diferenciación pancreática.Las células H1 se diferenciaron según el protocolo de diferenciación en cuatro etapas mostrado. Con células madre embrionarias humanas indiferenciadas en el día cero, endodermo definitivo en la etapa uno, intestino posterior cuatro en la etapa dos, endodermo pancreático en la etapa tres y progenitores pancreáticos de endodermo positivos para NKX6.1 en la etapa cuatro. Esta figura muestra los histogramas representativos de citometría de flujo del día tres para la tinción con anticuerpos CXCR4 PE y CD117 APC.Aquí está la muestra sin teñir y aquí está la muestra teñida. Y esta figura muestra los gráficos representativos de citometría de flujo del día 13 para células progenitoras pancreáticas derivadas de la etapa cuatro que expresan NKX61 y PDX1. Este es el control de IGG y esta es la muestra teñida.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 13 días. Sin embargo, esto puede variar según la línea celular utilizada. Al intentar este procedimiento, es importante probar todos los agentes debido a la variabilidad entre lotes.Después de seguir el procedimiento, las células progenitoras pancreáticas positivas para NKX6.1 pueden diferenciarse aún más en células similares a beta productoras de insulina utilizando otros protocolos publicados. Esto proporciona una plataforma para estudiar la maduración y el desarrollo de las células beta in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diferenciar eficientemente células madre pluripotentes humanas hacia progenitores pancreáticos, llevando a las células a través de cuatro etapas clave del desarrollo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra la generación de células progenitoras neurales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) transgénicas y no transgénicas. Las hPSCs se diferencian en células progenitoras neurales utilizando un medio de diferenciación neuronal. Mientras que en las células no transgénicas se induce la diferenciación utilizando moléculas pequeñas, las hPSC transgénicas se diferencian mediante la adición de un antibiótico que induce el promotor de un factor de transcripción...

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas transgénicas y no transgénicas en células progenitoras neurales

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