La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

El objetivo general de este protocolo es obtener suspensiones unicelulares de la aorta, el riñón y los ganglios linfáticos murinos para cuantificar y caracterizar las células inmunitarias en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades cardiovasculares, como qué dos subconjuntos de linfocitos promueven el desarrollo de la hipertensión. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación y cuantificación de subconjuntos de células inmunitarias en órganos sólidos a nivel de una sola célula.

Antes de comenzar el procedimiento, desinfecte el pecho del ratón con etanol al 70%. Luego, use unas tijeras para abrir cuidadosamente la piel y la pared torácica para exponer el corazón. Para perfundir la vasculatura, haga una pequeña incisión en la aurícula derecha e inyecte constantemente al menos 10 mililitros de PBS frío a una velocidad de aproximadamente un mililitro por segundo en el ápice del ventrículo izquierdo.

Cuando todos los órganos se hayan blanqueado, use pinzas de disección fina para extirpar los ganglios linfáticos que drenan la aorta abdominal, teniendo cuidado de no romper las cápsulas. Bajo un microscopio de disección, extirpe los dos riñones con unas tijeras finas. A continuación, utilice unas tijeras curvas finas para diseccionar toda la aorta torácica y abdominal, empezando por el corazón y terminando en la bifurcación ilíaca, teniendo cuidado de mantener la grasa perivascular circundante unida a la aorta.

A continuación, transfiera los riñones a un tubo de disociación que contenga 10 mililitros de solución de digestión renal y utilice un disociador semiautomático para desagregar mecánicamente el tejido renal de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al final de la disociación, incubar las muestras a 37 grados centígrados en rotación continua. Después de 20 minutos, detenga inmediatamente la digestión enzimática con medio frío RPMI 1640 suplementado con 5% de FBS y filtre la suspensión de tejido resultante a través de un colador de 40 micras en un tubo cónico de 50 mililitros.

Use el émbolo de una jeringa de un mililitro para separar el tejido restante. A continuación, peletice las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de medio con gradiente de densidad del 36% y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros.

Coloque suavemente tres mililitros de medio con gradiente de densidad del 72% debajo de las células, teniendo cuidado de no perturbar las capas, y separe las células por centrifugación. Las células inmunitarias se ubicarán en la interfaz. Retire la capa amarillenta superior que contiene los desechos celulares y luego suba el volumen a 15 mililitros usando PBS frío.

Agitar bien para romper el gradiente y luego lavar las células por centrifugación. Para aislar las células inmunitarias aórticas, transfiera la aorta a un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de solución de digestión de aorta recién preparada en hielo y use unas tijeras finas para picar toda la aorta en pedazos finos. Luego incuba los fragmentos a 37 grados centígrados durante 30 minutos de rotación continua.

Al final de la digestión, agregue RPMI frío suplementado con 5% de FBS a cinco veces el volumen de la solución de digestión y filtre la suspensión de tejido resultante a través de un colador de 40 micras. A continuación, recoja la suspensión unicelular por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en RPMI fresco con FBS. Para generar una suspensión unicelular a partir de los ganglios linfáticos que drenan la aorta, transfiera los ganglios linfáticos a un colador de 40 micras en una placa de cultivo de tejidos de 60 por 15 milímetros y use un émbolo de jeringa de un mililitro para disgregar el tejido.

A continuación, enjuague el filtro con dos mililitros de RPMI más FBS y transfiera las células liberadas a un tubo cónico de 15 mililitros. Para estimular las células, primero ajuste cada suspensión celular a una concentración de una por 10 a la sexta célula por mililitro en el medio de cultivo celular. A continuación, añada dos microlitros del cóctel de activación celular a cada grupo de células por cada mililitro de medio.

A continuación, transfiera una o dos veces 10 a la sexta célula aórtica o renal por pocillo a una placa de 12 pocillos y una o dos veces 10 a la sexta célula linfática por pocillo a una placa de 24 pocillos. Coloque las placas en una incubadora de dióxido de carbono humidificado a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, transfiera las células a los tubos de poliestireno FACS correspondientes y granule las células por centrifugación.

Después de lavar las celdas dos veces con tampón FACS nuevo en las mismas condiciones de centrífuga, bloquee la unión de superficies no específicas con el bloque FC y lave las celdas en PBS. Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de PBS fresco y tiña las células con un microlitro de una tinción de viabilidad reactiva a aminas impermeable a la célula durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, protegida de la luz. Al final de la incubación, lave las células dos veces más en uno o dos mililitros de tampón FACS y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de tinción de superficie celular adecuado.

Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados y protegidas de la luz, lavar las células dos veces más en dos mililitros de tampón FACS fresco, y fijar y permeabilizar las células con un kit de fijación y permeabilización según las instrucciones del fabricante. A continuación, etiquete las células con el cóctel de anticuerpos intracelulares de interés y vuelva a lavar las células en tampón FACS. Para el análisis de citometría de flujo de la producción de citocinas intracelulares estimuladas, primero ejecute los tubos de control sin tinción y con una sola tinción para ajustar la superposición espectral, seguido de los controles de fluorescencia menos uno para cada fluoróforo en el panel.

Cuando se hayan establecido los parámetros básicos del análisis de fluorescencia, utilice un gráfico de área de dispersión hacia adelante para establecer la puerta principal para la detección de la población de leucocitos, seguido de una compuerta para excluir las células muertas de acuerdo con su falta de expresión de tinción de viabilidad. Represente el área de dispersión hacia adelante contra la altura de dispersión hacia adelante y la puerta para excluir los dobletes. Los leucocitos pueden ser identificados por su expresión de CD45.

Para determinar la presencia de células T productoras de IL-17A o IL-17F en el riñón o la aorta murinos, se pueden preparar suspensiones unicelulares como se acaba de demostrar para el análisis de control de fluorescencia menos uno de cada citocina. Como era de esperar, muy pocas células son positivas para IL-17A o IL-17F en los controles de fluorescencia menos uno, lo que permite la discriminación precisa de señales positivas frente a negativas para ajustar adecuadamente las puertas para la identificación de células positivas para IL-17A o IL-17F en las muestras experimentales. La tinción intracelular representativa de las células T aisladas del riñón y la aorta de ratones de tipo salvaje infundidos con vehículo o angiotensina II revela la presencia de un subconjunto de células T que expresan IL-17A o IL-17F dentro de ambos tejidos.

Además, la tinción intracelular de las células T de los ganglios linfáticos que drenan la aorta demuestra que las células T CD8 positivas expresan interferón gamma y T-bet después de la estimulación con angiotensina II. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis a nueve horas, dependiendo del número de tejidos que se procesen. Al realizar este procedimiento, es importante trabajar de manera rápida y eficiente para minimizar la muerte celular.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar suspensión de una sola célula a partir del riñón, la aorta y los ganglios linfáticos murinos y caracterizar y cuantificar subconjuntos de células inmunitarias de estos órganos. Esta técnica permite a las fisiologías cardiovascular y renal explorar los cambios en las poblaciones de células inmunitarias que pueden contribuir a la hipertensión y otras enfermedades proinflamatorias.