Name: La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a identificar subconjuntos de linfocitos T en aorta, riñón y ganglios linfáticos de ratón mediante tinción intracelular y citometría de flujo en modelos de hipertensión inducida por angiotensina II.

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Este trabajo fue apoyado por un premio de la Asociación Americana del Corazón Fellowship (16POST29950007) a FL, una beca de formación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH T32 HL069765) de DAC, un premio de la Asociación de Becarios Americana del Corazón (14POST20420025) para MA Saleh, y un NIH premio K08 (HL121671) a los HSH. El MSM también es apoyado por una beca de investigación de Gilead Sciences, Inc.

Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Vanderbilt ha aprobado los procedimientos descritos en el presente documento. Los ratones se encierran y se cuidan de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academies Press. Revisada en 2010). 1. Aislamiento del Drenaje aórtica ganglios linfáticos, riñón y aorta de los ratones <ol><li> La eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2. Pulverizar el pecho con un 70% de etanol y abrir con cuidado la piel y la pared torácica con unas tijeras para exponer el corazón. </li><li> Para la perfusión de la vasculatura, realizar una pequeña incisión en la aurícula derecha e inyectar de manera constante al menos 10 ml de PBS frío (aproximadamente 1 ml / seg) en el vértice del ventrículo izquierdo usando una aguja de 21 o 23 G. Perfundir hasta que todos los órganos han blanqueado. El corazón se blanquea en primer lugar. El blanqueo del hígado indica que la perfusión ha sido bien realizado. </li><li> El uso de pequeñas pinzas y tijeras finas, con suavidad cortar y sacar los intestinos,estómago, el bazo, el páncreas y el hígado para visualizar mejor la aorta. NOTA: Este paso tiene que ser hecho con mucha precisión como daños en el tracto gastrointestinal puede inducir la contaminación. </li><li> Cortar y retirar cada pulmón con unas tijeras. Enjuague la cavidad torácica con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una jeringa sin aguja. Eliminar el exceso de sangre y el líquido con una gasa estéril. </li><li> Extraer los ganglios linfáticos que drenan la aorta abdominal utilizando unas pinzas de disección finas. Asegúrese de no romper la cápsula. Eliminar la grasa que queda en la superficie de cada uno de los ganglios linfáticos con el fórceps de disección. Cortar los dos riñones con unas tijeras finas. </li><li> Diseccionar toda la aorta (aorta torácica y abdominal) con finas, tijeras curvas. Comenzar a nivel del corazón y diseccionar cuidadosamente lejos del esófago y las vértebras hasta el nivel de la bifurcación ilíaca asegurándose de mantener la grasa perivascular que rodea unido a la aorta. NOTA: Además la disección de la aorta a remocinco estructuras circundantes se pueden hacer con un microscopio. En concreto, eliminar las ramas arteriales (arterias carótidas, las arterias subclavias, celiaco, mesentéricas, renales y las arterias) y los ganglios linfáticos. Mantenga una capa consistente de la grasa perivascular alrededor de cada aorta ya que este es un sitio donde muchas células inflamatorias residen en el entorno de la hipertensión. Coloque cada tejido en tubos separados que contienen PBS frío. </li></ol> 2. Generación de suspensiones de células individuales de cada tejido <ol><li> Los riñones NOTA: El riñón puede disociarse en una única suspensión de células mediante la combinación de disociación mecánica además de la digestión enzimática. <ol><li> Preparar la solución de digestión de riñón mediante la adición de colagenasa D (2 mg / ml) y ADNasa I (100 mg / ml) a RPMI 1640 (suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS)). Preparar 10 ml por muestra de riñón. </li><li> El uso de fórceps para transferir los dos riñones en un tubo de disociación que contiene 10 ml de riñón digerirsolución de iones. </li><li> Realizar la disociación mecánica utilizando un dispositivo disociador semi-automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Después de disociación mecánica, separar el tubo del dispositivo y realizar la digestión enzimática. Se incuban las muestras durante 20 minutos a 37 ºC bajo rotación continua. Inmediatamente detener la digestión enzimática mediante la adición de frío medio RPMI 1640 suplementado con 5% de FBS. </li><li> Transferir la solución con la pipeta en un tubo cónico de 50 ml después de la filtración a través de un filtro de 40 micras. Tease el tejido restante aparte pulsando con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Sedimentar las células (500 xg, 8 min, 4 ° C). </li><li> Resuspender el sedimento en 3 ml de 36% de medio de centrifugación en gradiente de densidad. Transferir la suspensión en un tubo cónico de 15 ml. añadir con cuidado 3 ml de 72% de medios de centrifugación en gradiente de densidad por debajo de la suspensión celular 3 ml de 36% sin ninguna interrupción. Se centrifuga (1.000 xg sin freno, 20 min, 4 ° C). &lt;/ Li&gt; <li> Las células inmunes se encuentran en la interfaz. Eliminar la capa superior de color amarillento que contiene restos celulares y luego llevar el volumen hasta 15 ml utilizando PBS frío. Agitar bien para la descomposición del gradiente. Girar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C) y resuspender el precipitado en 3 ml de RPMI con 5% de FBS. Contar el número de células vivas en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano. </li></ol></li><li> La aorta <ol><li> Preparar la solución de digestión aorta mediante la adición de colagenasa A (1 mg / ml), colagenasa B (1 mg / ml), y la DNasa I (100 mg / ml) a RPMI 1640 (suplementado con 5% de FBS). </li><li> Usando unas pinzas finas, la transferencia de la aorta en un tubo de 2 ml que contiene 1 ml de solución de digestión aorta. Picar toda la aorta trozos muy pequeños con tijeras finas en la solución de digestión 1 ml. Mantener en hielo. Se incuban las muestras durante 30 minutos a 37 ° C bajo rotación continua. </li><li> Transferir la solución a una placa de cultivo de tejidos y detener el Enzymadigestión tic añadiendo 5 veces el volumen de RPMI frío con 5% de FBS. </li><li> Transferir la solución con la pipeta en un tubo cónico de 50 ml después de la filtración a través de un filtro de 40 micras. Tease el tejido restante aparte en una sola suspensión celular presionando con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Enjuague el filtro y sedimentar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C). </li><li> Lavar el sedimento por adición de 10 ml de RPMI con 5% de FBS. Girar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C) y resuspender el precipitado en 3 ml de RPMI con 5% de FBS. Contar el número de células vivas en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano. </li></ol></li><li> Los aórtica ganglios linfáticos de drenaje <ol><li> Colocar un colador de 40 micras en una placa de cultivo de tejido (60 mm x 15 mm). Coloque los ganglios linfáticos en el filtro y se burlan de ellos separados en una sola suspensión celular presionando con el émbolo de una jeringa de 1 ml. Lavar el filtro con 2 ml de RPMI con 5% de FBS. Recoger las células en el plato. </li><li> Transferirlas células en un tubo Falcon de 15 ml y sedimentar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspender el precipitado en 500 l de RPMI con 5% de FBS. Contar el número de células vivas en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano. </li></ol></li></ol> 3. La estimulación ex vivo para la detección de citoquinas por citometría de flujo <ol><li> Preparar los medios de cultivo de células: RPMI con FBS al 5%, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 50 mM β-mercaptoetanol y 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Centrifugar cada suspensión de células obtenida a partir de los nodos de riñón, la aorta y los ganglios (300 xg, 8 min, 4 ºC). Resuspender cada sedimento con los medios de cultivo celular a una concentración de 1 x 10 6 células por ml. </li><li> Estimular las células mediante la adición de 2 l de cóctel de la activación de las células (que contiene de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), el ionóforo de calcio ionomicina, y el inhibidor de Golgi Brefeldina A) por cada 1 ml de cultivo celular. NOTA: La concentración finals de cada componente son: 81 nM de PMA, 1,33 M de ionomicina y 5 mg / ml de Brefeldina A. El tratamiento con PMA y ionomicina activa las células para producir citocinas. Las citoquinas son proteínas secretadas que deben ser atrapadas en las células para ser detectado. Brefeldina A causa de la acumulación de las proteínas secretadas normalmente en el aparato de Golgi y retículo endoplasmático. Por lo tanto, la técnica descrita aquí aumenta la detectabilidad de los linfocitos productoras de citoquinas por citometría de flujo. </li><li> Plate 1 a 2 millones de células en un 12 pocillos (de aorta o riñón), o 24 pocillos (ganglios linfáticos) placas de baja adherencia. Colocar la placa en un incubador de CO2 humidificado 37 ° C durante 3 horas. NOTA: El número de células cultivadas en placas puede ser menor en los ganglios linfáticos de los ratones de control. Además, el tiempo de estimulación tiene que ser determinado empíricamente para cada población celular y de citoquinas estudiadas. En el caso de las células T aisladas de la aorta, riñón o de los ganglios linfáticos, se recomienda la estimulación de 3 a 4 horas. A la estimulación ya wenfermo no aumentar la secreción de citoquinas y la inducirá una regulación a la baja adicional de varios marcadores de superficie de células T tales como CD3, CD4 y CD8. (Tenga en cuenta que incluso una estimulación 3-4 hr inducirá alguna regulación a la baja de estos marcadores.) </li></ol> La tinción 4. Superficie <ol><li> Transferencia de las células en un tubo de poliestireno de FACS y se centrifuga (300 xg, 8 min, 4 ° C). Lavar las células dos veces con tampón FACS (Ca 2 + y Mg + PBS libre que contiene 4% de FBS y 2 mM EDTA) y dividir la suspensión celular en partes iguales en diferentes tubos de FACS basado en el número de paneles de anticuerpos deseados y el número de tubos de control necesarias ( vea abajo). </li><li> Para realizar la compensación para cada panel, se preparan tubos de control sin teñir y tubos manchados individuales para cada tipo de tejido y el panel de anticuerpos. Además, preparar los tubos de control de fluorescencia menos uno (FMO) para cada panel de anticuerpo mediante la adición de todos menos uno de los anticuerpos. </li><li> Ajustar el volumen de cada tubo a 2 ml con FACSBuffer. Centrifugar la suspensión celular (300 xg, 8 min, 4 ° C), eliminar los receptores de sobrenadante y el bloque de Fc mediante la incubación de las células con 0,5 mg de anticuerpos anti-CD16 / CD32 por millón de células por 10 min en hielo. NOTA: CD16 es baja afinidad del receptor Fc de IgG III (FCR III) y CD32 es FcR II. CD16 / CD32 se expresa en granulocitos, mastocitos, monocitos / macrófagos, células asesinas naturales, células B, células dendríticas y algunas células T maduras activadas. </li><li> Realizar tinción de viabilidad: Lavar las células con PBS 1x, centrifugar (300 x g, 8 min, 4 ° C) y se vuelve a suspender en 1.000 l de PBS 1x. Añadir 1 l de un medio de contraste (tinción de viabilidad) amino-reactivo de células impermeable. Incubar durante 15 minutos a 4 ° C protegido de la luz. </li><li> Durante la incubación, preparar el cóctel de anticuerpos (por tinción de la superficie) en un volumen apropiado de tampón de FACS. Lavar las células dos veces con 1-2 ml de tampón FACS, de centrifugación (300 xg, 8 min, 4 ° C) y volver a suspender cada sedimento con 100 lde la mezcla de anticuerpos. Incubar durante 30 minutos a 4 ° C protegido de la luz. NOTA: Para cada citometría de flujo de anticuerpos, es útil para determinar la cantidad óptima de anticuerpo necesaria mediante la realización de una curva de titulación de la dosis. </li><li> Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón de FACS y sedimentar las células (300 xg, 8 min, 4 ° C). </li></ol> 5. La fijación, permeabilización y tinción intracelular <ol><li> Realizar la tinción intracelular con un kit de fijación y permeabilización que contiene tampones apropiados, siguiendo las instrucciones del fabricante. Fijar y permeabilizar las células mediante resuspensión en el tampón apropiado. Incubar las muestras durante 40 minutos a 4 ° C protegido de la luz. </li><li> Añadir 1 ml de 1x permeabilización y el tampón de lavado directamente a las células fijadas y permeabilizadas. Se centrifuga (500 x g, 8 min, 4 ° C) y eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 2 ml de tampón de lavado 1x. </li><li> Preparar las mezclas de antibodies (por tinción intracelular solamente) en un volumen apropiado de tampón de lavado 1x (por lo general 100 l por tubo). NOTA: Como se describió anteriormente, la concentración de anticuerpos óptima debe determinarse para cada anticuerpo en el panel. Por ejemplo, para los anticuerpos de IL-17A o IL-17F, se utiliza un factor de dilución de una y media, pero para los anticuerpos de IFN y T-bet, se utiliza un factor de dilución de 1: 100. </li><li> Centrifugar las células (500 xg, 8 min, 4 ° C) y volver a suspender cada sedimento con 100 l de la mezcla de anticuerpos. Incubar durante 40 minutos a 4 ° C protegido de la luz. </li><li> Lavar las células dos veces con 2 ml de tampón de lavado 1x y sedimentar las células (500 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspender el precipitado con 300 l de tampón de lavado 1x y analizar en un citómetro de flujo con filtros adecuados. </li><li> Para la cuantificación del número total de células por muestra de tejido, el uso contar bolas. Antes de la adquisición, añadir el volumen / número recomendado de cuenta granos a cada tubo. </li></ol> 6. Compensación, apertura de puerta, normalización, y consejos <ol><li> Compensación y gating <ol><li> tubos de control sin teñir y manchadas solo plazo de compensación para ajustar el solapamiento espectral. NOTA: El uso de bolas de compensación en lugar de controles de compensación basados ​​en células es necesaria en los casos en que está presente en niveles tan bajos que la compensación utilizando células será difícil el antígeno de interés o una población de células en una muestra. También hay que resaltar, al utilizar colorantes en tándem, es aconsejable preparar compensaciones para cada experimento ya que los tintes tándem varían de lote a lote, y con cada día. </li><li> Ejecutar la fluorescencia menos uno controles (FMOs) para todos los fluoróforos en el panel cuando se inicia un nuevo experimento multicolor. NOTA: Los controles FMO son muestras que contienen todos los anticuerpos en el panel a excepción de una. Estos controles permiten una discriminación precisa de positivo frente a las señales negativas para el anticuerpo omitido Adjus adecuadamentet las puertas. Estos controles son particularmente importantes cuando los niveles de expresión son bajos o cuando la separación de la población objetivo es pobre (por ejemplo, cuando la diana es una citoquina o factor de transcripción). Aunque no siempre es necesario, en algunos casos, controles de isotipo se pueden preferir en lugar de FMO controla, ya que proporcionan una compensación adecuada para el isotipo de anticuerpo y el conjugado fluoróforo sin la especificidad del antígeno. </li><li> Configurar la puerta principal: ajuste dispersión hacia adelante de la zona (FSC-A) y dispersión lateral en la zona (SSC-A) de tensión con el fin de detectar la población de leucocitos. </li><li> Excluir las células muertas. NOTA: La mancha viabilidad reacciona con aminas libres presentes tanto en la superficie y el interior de las células. En contraste con las células vivas, las células muertas (con membranas comprometidas) permiten que el medio de contraste para entrar en el citoplasma, el aumento de la cantidad de etiquetado de proteínas. Por lo tanto, las células muertas serán más brillantes que las células vivas que permiten la discriminación fácil. Puerta en el vivoCélulas. NOTA: La viabilidad de las suspensiones de células a partir de la aorta y el riñón puede ser menor que la viabilidad de las suspensiones de células de los ganglios linfáticos debido a la etapa de digestión adicional. </li><li> Terreno Área Avanzada de dispersión (FSC-A) [eje Y] y dispersión frontal Altura (FSC-H) [eje x]. Singletes aparecen como una diagonal en este gráfico de puntos. Puerta en esta diagonal para excluir dobletes. Se representa la CSS-A [eje Y] y CD45 [eje x]. </li><li> La población CD45 + leucocitos pueden ser fácilmente identificados. Puerta en esta población. poblaciones siguientes pueden ser identificados a partir de esta población. </li></ol></li><li> La normalización de los recuentos de células <ol><li> contar bolas tienen características que resultan en baja SSC FSC y alta. Por ejemplo, si 50.000 perlas se añadieron en 300 l de la suspensión de células individuales, la ecuación para el cálculo del número absoluto de cualquier tipo de célula dar por tubo es el siguiente: Número de celdas ptubo er = (50000 / número de cuentas contadas por el citómetro de flujo) x número de células contadas. Usando este cálculo, el número absoluto de cualquier tipo de célula dado por tubo se puede determinar. Basado en el número de tubos fueron generados a partir de cada órgano, el número de células por órgano se puede calcular. NOTA: Mantenga todas las células y reactivos a 4 ° C durante el protocolo. Evitar el vórtice vigoroso, ya que puede dañar las células. Utilice fuerzas mínimas para sedimentar las células. Evitar hacer burbujas en el tubo de FACS, ya que puede precipitar la muerte celular. No deje que los gránulos se secan en cualquier momento. </li></ol></li></ol>

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MSM es apoyado por una beca de Gilead Sciences cardiovasculares.

El protocolo descrito en este documento se ha optimizado para identificar adecuadamente los subconjuntos de células T presentes en los riñones, la aorta y los ganglios linfáticos murinos. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para examinar otros subconjuntos de células inmunitarias, como los linfocitos B y las células inmunitarias innatas, y se puede modificar para incluir otros tipos de tejidos. El paso de digestión es crítico y debe modificarse y optimizarse para cada tejido9. Un paso de digestión prolo...

La evidencia reciente demuestra que el sistema inmune adaptativo, en particular los linfocitos T, juegan un papel crítico en el desarrollo de varias enfermedades cardiovasculares 1,2,3,4,5. Por ejemplo, en el modelo de la hipertensión inducida por la angiotensina II, una acumulación de células T en los vasos y los riñones de ratones se ha descrito 6. La acumulación vascular es predominantemente en la adventicia y la grasa perivascular. En el riñón, las células T se acumulan tanto en la médula y la corteza renal. Dependiendo de qué subconjunto está involucrado, estas células T dan lugar a diferentes citoquinas que pueden afectar la función vascular y renal y conducir al desarrollo de la patología (revisado por McMaster et al. 6). Los linfocitos T auxiliares CD4 + se pueden dividir en varios subconjuntos: las células T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, las células T reguladoras (Treg), y T helper folicular (TFH) en base a sus funciones y cito firmakines 7. Del mismo modo, las células CD8 + T citotóxicos se pueden clasificar como Tc1, Tc2, TC17 o TC9 8. También hay células T negativas dobles (es decir, células que no expresan el CD4 o CD8 marcadores de células T). Un subconjunto de estas células poseen una gamma delta del receptor de células T alternativa (en lugar de los receptores alfa y beta clásicas) y por lo tanto se conocen como células T gamma delta. El análisis de múltiples parámetros mediante citometría de flujo de marcador de superficie, citoquinas y factores de transcripción constituye el mejor enfoque para identificar estas células. Aunque este método se usa ampliamente en el campo de la inmunología, es menos bien descrito en órganos sólidos y en el contexto de las enfermedades cardiovasculares. Históricamente, la identificación de los linfocitos en los tejidos se limitó a inmunohistoquímica o enfoques de RT-PCR. Aunque inmunohistoquímica e inmunofluorescencia son poderosos métodos para determinar la distribución tisular de un antígeno de interest, son inadecuados para identificar fenotípicamente los subconjuntos implicados. Además, mientras que el análisis RT-PCR es útil para detectar la expresión de ARNm de antígenos, citoquinas o factores de transcripción, que no permite la detección de múltiples proteínas simultáneamente a nivel de células individuales. El advenimiento de la citometría de flujo, especialmente cuando se combina con la tinción intracelular para detectar citoquinas y factores de transcripción, proporciona a los investigadores con una técnica poderosa que permite la identificación y cuantificación en el nivel de células individuales de subconjuntos de células inmunes en órganos sólidos. Hemos optimizado un ensayo de tinción intracelular para identificar mediante citometría de flujo las principales subconjuntos de células T presentes dentro de riñón murino, aorta y aorta ganglios linfáticos de drenaje en un modelo de hipertensión inducida por la angiotensina II. La optimización de cada etapa: la digestión de tejidos, la activación ex vivo, la permeabilización, y la superficie y resultados de la tinción intracelular en una altamente reensayo producible que se puede aplicar a otros modelos de enfermedades cardiovasculares y renales.

<table><tbody><tr><td>Colagenasa D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE 10104159001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medio 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin calcio y magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Para centrifugación en gradiente de densidad</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade; Tubo C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo disociador GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Utilice el programa SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Cóctel de activación celular (con Brefeldin A)</td><td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>diluido 1:100</td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO kit de tinción de células muertas violetas fijables</td><td>Life Technologies</td><td>L34955</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de tampones de factores de transcripción</td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 cuentas eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (clon 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (clon 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (clon TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (clon 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (clon GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (clon 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (clon 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma; FITC (clon XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

la tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Ahora es bien sabido que los linfocitos T desempeñan un papel crítico en el desarrollo de varias enfermedades cardiovasculares1,2,3,4,5. Por ejemplo, estudios de nuestro grupo han demostrado que la hipertensión se asocia a una acumulación excesiva de células T en los vasos y en el riñón durante el desarrollo de la hipertensión experimental6. Una vez en estos tejidos, las células T producen varias citocinas que afectan tanto a la función vascular como a la renal, lo que conduce a la vasoconstricción y a la retención de sodio y agua1,2. Para comprender completamente cómo las células T causan enfermedades cardiovasculares y renales, es importante poder identificar y cuantificar los subconjuntos específicos de células T presentes en estos tejidos. Los subconjuntos de linfocitos T se definen por una combinación de marcadores de superficie, las citocinas que secretan y los factores de transcripción que expresan. La complejidad de la población de linfocitos T hace que la citometría de flujo y la tinción intracelular sean una técnica invaluable para diseccionar los fenotipos de los linfocitos presentes en los tejidos. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para identificar los marcadores de superficie e intracelulares (citocinas y factores de transcripción) en células T aisladas de ganglios linfáticos murinos de riñón, aorta y drenaje aórtico en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Se describen en detalle los siguientes pasos: aislamiento de los tejidos, generación de las suspensiones unicelulares, estimulación ex vivo, fijación, permeabilización y tinción. Además, se discuten varios principios fundamentales de los análisis de citometría de flujo, incluida la elección de los controles adecuados y las estrategias de compuerta adecuadas.

El protocolo descrito permite la identificación de marcadores de superficie e intracelulares en células T aisladas de riñón murino, la aorta y aórtica ganglios linfáticos que drenan en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Los resultados representativos se presentan a continuación. La Figura 1 demuestra la estrategia de gating utilizado para identificar la población de células T en una sola s...

Este artículo proporciona una metodología detallada para identificar y cuantificar los subconjuntos de linfocitos T funcionales presentes dentro de riñón murino, la aorta y los ganglios linfáticos mediante tinción intracelular y citometría de flujo. El modelo de hipertensión inducida por angiotensina II fue elegido para explicar, paso a paso, los procedimientos y los principios fundamentales de la citometría de flujo y tinción intracelular.

La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

El objetivo general de este protocolo es obtener suspensiones de células individuales a partir de la aorta murina, el riñón y los ganglios linfáticos para cuantificar y caracterizar las células inmunitarias en un modelo de hipertensión inducida por angiotensina II. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades cardiovasculares, como cuáles dos subpoblaciones de linocitos promueven el desarrollo de la hipertensión. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación y cuantificación de subpoblaciones de células inmunitarias en órganos sólidos a nivel de célula individual.Antes de comenzar el procedimiento, desinfecte el pecho del ratón con etanol al 70 %. Luego, use tijeras para abrir cuidadosamente la piel y la pared torácica y exponer el corazón. Para perfundir la vasculatura, realice una pequeña incisión en la aurícula derecha e inyecte de forma constante al menos 10 mililitros de PBS frío a una velocidad de aproximadamente un mililitro por segundo en el ápice del ventrículo izquierdo.Cuando todos los órganos hayan palidecido, utilice pinzas finas para diseccionar los ganglios linfáticos drenados por la aorta abdominal, teniendo cuidado de no romper las cápsulas. Bajo un microscopio de disección, retire los dos riñones con tijeras finas. Luego, use tijeras curvas finas para diseccionar toda la aorta torácica y abdominal, comenzando en el corazón y terminando en la bifurcación ilíaca, teniendo cuidado de mantener la grasa perivascular circundante adherida a la aorta.A continuación, transfiera los riñones a un tubo de disociación que contenga 10 mililitros de solución de digestión para riñón y utilice un disociador semiautomático para desagregar mecánicamente el tejido renal según las instrucciones del fabricante. Al finalizar la disociación, incube las muestras a 37 grados Celsius bajo rotación continua. Después de 20 minutos, detenga inmediatamente la digestión enzimática con medio RPMI 1640 frío suplementado con 5% de FBS y filtre la suspensión tisular resultante a través de un filtro de 40 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros.Utilice el émbolo de una jeringa de un mililitro para separar el tejido restante. Luego, haga un pellet de las células mediante centrifugación. Re_suspenda el pellet en tres mililitros de medio de gradiente de densidad al 36% y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros.Coloque cuidadosamente tres mililitros de medio de gradiente de densidad al 72 % debajo de las células, teniendo cuidado de no perturbar las capas, y separe las células mediante centrifugación. Las células inmunitarias se ubicarán en la interfase. Retire la capa superior de color amarillento que contiene los restos celulares y luego aumente el volumen hasta 15 mililitros utilizando PBS frío.Agite bien para romper el gradiente y luego lave las células mediante centrifugación. Para aislar las células inmunitarias aórticas, transfiera la aorta a un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de solución de digestión de aorta recién preparada sobre hielo y use tijeras finas para picar toda la aorta en trozos pequeños. A continuación, incube los fragmentos a 37 grados Celsius durante 30 minutos con rotación continua.Al finalizar la digestión, agregue RPMI frío suplementado con 5 % de FBS en un volumen cinco veces mayor que el de la solución de digestión y filtre la suspensión tisular resultante a través de un tamiz de 40 micrones. Luego, recopile la suspensión de células individuales mediante centrifugación y resuspenda el sedimento en RPMI fresco con FBS. Para obtener una suspensión de células individuales a partir de los ganglios linfáticos drenados por la aorta, transfiera los ganglios linfáticos a un tamiz de 40 micrones colocado en una placa de cultivo tisular de 60 por 15 milímetros y utilice el émbolo de una jeringa de un mililitro para desagregar el tejido.Luego, enjuague el colador con dos mililitros de RPMI más FBS y transfiera las células liberadas a un tubo cónico de 15 mililitros. Para estimular las células, primero ajuste cada suspensión celular a una concentración de un multiplicado por 10 a la sexta células por mililitro en medio de cultivo celular. A continuación, agregue dos microlitros del cóctel de activación celular a cada grupo de células por cada mililitro de medio.A continuación, transfiera de una a dos veces 10 a la sexta células aórticas o renales por pocillo a una placa de 12 pocillos y de una a dos veces 10 a la sexta células de ganglio linfático por pocillo a una placa de 24 pocillos. Coloque las placas en un incubador de dióxido de carbono humedecido a 37 grados Celsius durante tres horas. Luego, transfiera las células a los tubos de citometría de flujo de poliestireno correspondientes y haga un pellet de las células mediante centrifugación.Después de lavar las células dos veces con tampón FACS fresco bajo las mismas condiciones de centrifugación, bloquee e inhiba la unión superficial no específica con bloqueador de FC y lave las células en PBS. Reuspenda los pellet en un mililitro de PBS fresco y tiña las células con un microlitro de un colorante de viabilidad reactivo con aminas impermeable a las células durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, protegido de la luz. Al final de la incubación, lave las células dos veces más con uno a dos mililitros de tampón FACS y re suspenda los pellet en 100 microlitros del cóctel adecuado de anticuerpos para tinción de superficie celular.Después de 30 minutos a cuatro grados Celsius y protegidas de la luz, lave las células dos veces más con dos mililitros de tampón FACS fresco, y fije y permeabilice las células con un kit de fijación y permeabilización según las instrucciones del fabricante. A continuación, marque las células con la mezcla de anticuerpos intracelulares de interés y vuelva a lavar las células en tampón FACS. Para el análisis citométrico de flujo de la producción intracelular de citocinas estimuladas, primero ejecute los tubos de control sin teñir y con tinción simple para ajustar la superposición espectral, seguidos por los controles de menos una fluorescencia para cada fluoróforo en el panel.Una vez establecidos los parámetros básicos del análisis de fluorescencia, utilice un gráfico de área de dispersión directa frente a dispersión lateral para definir la compuerta principal para la detección de la población de leucocitos, seguido de una compuerta para excluir las células muertas según su falta de expresión del marcador de viabilidad. Represente el área de dispersión directa frente a la altura de dispersión directa y establezca una compuerta para excluir los dobletes. Los leucocitos pueden entonces identificarse por su expresión de CD45.Para determinar la presencia de linfocitos T productores de IL-17A o IL-17F en el riñón o la aorta de ratón, se pueden preparar suspensiones simples de células como se acaba de demostrar para el análisis de control de fluorescencia menos uno de cada citocina. Como era de esperar, muy pocas células son positivas para IL-17A o IL-17F en los controles de fluorescencia menos uno, lo que permite discriminar con precisión las señales positivas frente a las negativas y ajustar adecuadamente las compuertas para la identificación de células positivas para IL-17A o IL-17F en las muestras experimentales. La tinción intracelular representativa de linfocitos T aislados del riñón y de la aorta de ratones silvestres infusionados con vehículo o angiotensina II revela la presencia de un subconjunto de linfocitos T que expresan IL-17A o IL-17F en ambos tejidos.Además, la tinción intracelular de linfocitos T de los ganglios linfáticos drenantes de la aorta demuestra que los linfocitos T positivos para CD8 expresan interferón gamma y T-bet tras la estimulación con angiotensina II. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en seis a nueve horas, dependiendo del número de tejidos que se procesen. Durante la realización de este procedimiento, es importante trabajar de forma rápida y eficiente para minimizar la muerte celular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una suspensión de células individuales a partir del riñón murino, la aorta y los ganglios linfáticos, y cómo caracterizar y cuantificar subpoblaciones de células inmunitarias procedentes de estos órganos. Esta técnica permite a las fisiologías cardiovascular y renal explorar los cambios en las poblaciones de células inmunitarias que podrían contribuir a la hipertensión y otras enfermedades proinflamatorias.

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este trabajo presenta una citometría de flujo basado en el método para investigar la composición inmunológica de aortas. El documento también muestra una técnica adicional que permite examinar los alrededores y adventicia pared de los vasos por separado. Este método abre la posibilidad de realizar análisis fenotípico de los leucocitos aórtica y aplicar varios ensayos inmunológicos para los estudios de la aterosclerosis.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

La función de las células vasculares depende de la actividad de los mensajeros intracelulares.  Aquí se describe un método de imagen ex vivo de dos fotones que permite la medición de los niveles intracelulares de calcio y óxido nítrico en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos en células endoteliales y musculares lisas individuales de una aorta aislada.

De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada

Los monocitos son importantes mediadores de la Arteriogénesis en el contexto de la enfermedad arterial periférica. Utilizando una matriz similar a la membrana del sótano y microscopia intravital, este protocolo investiga monocito recalada y relacionados con el tumor angiogénesis después de la inyección de monocitos en el modelo murino de la ligadura de la arteria femoral.

Microscopia intravital de monocito autoguiado hacia el blanco y la angiogénesis tumorales en un modelo murino de la enfermedad Arterial periférica

Este manuscrito describe el uso de ratones transgénicos reportero y vías de administración diferentes de colorantes fluorescentes en angiotensina II-hipertensión inducida por usando microscopia intravital video de vasos sanguíneos para evaluar la activación de células inmunes y sus capacidad de rollo y se adhieren al endotelio.

Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

El objetivo de este protocolo es identificar las poblaciones de células endoteliales linfáticas dentro del hígado usando marcadores descritos. Utilizamos colagenasa IV y DNasa y un picado suave del tejido, combinado con citometría de flujo, para identificar una población diferente de células endoteliales linfáticas.

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Proponemos un protocolo estandarizado para caracterizar la composición celular de etapa tardía las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos de disección animal, tejido inclusión, seccionamiento, tinción y análisis de las arterias braquiocefálicas de atheroprone músculo liso células linaje seguimiento ratones.

Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones

Aquí, describimos un protocolo de citometría de flujo detallado y reproducible para identificar subconjuntos de monocitos/macrofagos y células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial, utilizando un modelo quirúrgico establecido de osteoartritis murina.

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8+ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células TRM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Aquí, presentamos protocolos optimizados de limpieza de tejidos para obtener imágenes de la aorta murina en tres dimensiones (3D). Delineamos procedimientos de última generación para la inmunotinción, el aclaramiento óptico y la obtención de imágenes con la intención de definir la proximidad anatómica del sistema nervioso periférico con las placas ateroscleróticas y la adventicia en la aterosclerosis.

Imágenes tridimensionales de los tejidos aórticos en la aterosclerosis

Aprende a identificar subconjuntos de linfocitos T en aorta, riñón y ganglios linfáticos de ratón mediante tinción intracelular y citometría de flujo en modelos de hipertensión inducida por angiotensina II.

La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión (Video) | JoVE Journal

La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión

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