Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Este protocolo demuestra cómo establecer la plataforma iCRISPR para la edición rápida del genoma en hPSCs, y cómo incorporar líneas editadas del genoma con diferenciación pancreática dirigida por hPSCs para estudiar el desarrollo y la enfermedad pancreática humana. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo pancreático humano, como el control genético del desarrollo pancreático normal y las bases moleculares de la diabetes. La principal ventaja de estas técnicas es que nos permiten modificar de forma eficiente genes de interés en hPSCs y utilizar estas líneas celulares modificadas para estudios de desarrollo y enfermedad pancreática humana in vitro.

Cultivo de hPSCs en condiciones químicamente definidas y libres de alimentadores en placas truncadas recubiertas de vitronectina humana. El día antes de la electroporación, agregue 10 inhibidores micromolares de ROCK durante el cambio de medio. El día de la electroporación, prepare platos de 10 centímetros recubiertos de vitronectina con anticipación.

Luego retire el medio de cultivo de las células, lave una vez con PBS sin calcio y magnesio, luego trate las células con reactivo de disociación 1X a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres minutos. A continuación, aspire el reactivo de disociación antes de que las células se hayan desprendido y agregue 10,5 mililitros de medio completo. Utilice un pipeteo suave para formar una suspensión unicelular antes de transferirla a los tubos de centrífuga.

Realice un recuento de células en 500 microlitros de suspensión celular utilizando un contador de células automatizado. A continuación, granule las hPSC a 200 veces G durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células en PBS frío a 12,5 veces 10 a la sexta célula por mililitro, y alícuota en volúmenes de 800 microlitros.

Agregue los plásmidos en cada suspensión de hPSC de 800 microlitros y mezcle bien. Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,4 centímetros y manténgala en hielo durante aproximadamente cinco minutos. Electroporar las celdas utilizando un sistema de electroporación a 250 voltios y 500 microfaradios.

Es fundamental utilizar hPSC sanas y proliferantes para la edición del genoma. Después de la electroporación, transfiera las celdas a un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de medio completo precalentado y luego granule las celdas. Vuelva a suspender las células en 10 mililitros de medio completo con 10 micromolares inhibidor de ROCK, y coloque una placa una vez 10 a la sexta, 2,5 veces 10 a la sexta y cinco veces 10 a la sexta células de cada electroporación en placas recubiertas de vitronectina, de modo que al menos una de las placas tenga suficientes colonias unicelulares para la recolección.

Cultive las células a 37 grados centígrados. En el segundo día, comience la selección de neomicina agregando un medio que contenga 500 microgramos por mililitro de sulfato G418. Al sexto día, comience la selección de puromicina agregando un medio que contenga un microgramo por mililitro de diclorhidrato de puromicina.

En los días 10 a 12, las colonias unicelulares de hPSC alcanzarán de uno a dos milímetros de diámetro. En este punto, elija de 12 a 24 colonias bajo un microscopio estereoscópico. Desagregue mecánicamente las colonias de hPSC en trozos pequeños con una punta de pipeta de 200 microlitros y transfiera las células directamente a placas de 24 pocillos recubiertas de vitronectina.

24 horas antes de la transfección del ARN guía, tratar las hPSC iCas9 con dos microgramos por mililitro de doxiciclina. El día de la transfección, prepare placas de 24 pocillos recubiertas de vitronectina y disocie las células iCas9 en células individuales utilizando el reactivo de disociación 1X como antes. A continuación, granule las células a 200 veces G durante cinco minutos y vuelva a suspender las células a 0,5 veces 10 a la sexta células por mililitro en medio completo suplementado con dos microgramos por mililitro de doxiciclina y 10 micromolares de inhibidor de ROCK.

Coloque 500 microlitros de las células resuspendidas en pocillos individuales de la placa de 24 pocillos. Para cada ARN guía, realice las siguientes mezclas de transfección. Mezcla A, 50 microlitros de medio sérico reducido más un microlitro de ARN guía.

Mezcla B, 50 microlitros de medio sérico reducido más tres microlitros de reactivo de transfección. Combine las mezclas A y B para hacer una mezcla de 100 microlitros e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Agregue 50 microlitros de la mezcla a las celdas en los pocillos duplicados de la placa de 24 pocillos y mezcle bien.

Después de cuatro días, extraiga el ADN genómico, amplifique la PCR las regiones objetivo que flanquean las secuencias de orientación del ARN guía y estime la eficiencia de edición mediante la digestión T7E1. Comenzar la diferenciación de las líneas de hPSC cuando las células hayan alcanzado el 80% de confluencia dos días después de la siembra. Agregue el medio de diferenciación día cero y luego cambie el medio diariamente usando las fórmulas que se muestran aquí.

El día 10, examine los marcadores PP2 del progenitor pancreático posterior, PDX1 y NKX6.1, mediante tinción inmunofluorescente de un subconjunto de las células. A continuación, se procede al cultivo de la interfaz aire-líquido tratando primero las células PP2 con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares durante cuatro horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, disociar las células como antes.

Minimice la duración del tratamiento con reactivos de disociación para maximizar la supervivencia celular para la siembra en la etapa de diferenciación de la interfaz aire-líquido. Aspire el reactivo de disociación antes de que las células se hayan desprendido. A continuación, añada 10 mililitros de medio boo-lah a la placa y disperse las células PP2 en células individuales pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.

Recoge la suspensión de una sola celda. Cuente el número de celdas y granule las celdas. Después de resuspender el pellet de células en el medio de diferenciación S5, detecte de cinco a 10 microlitros de células por punto en un filtro de inserción transwell.

Agregue el medio S5 a la parte inferior de cada inserto transpocillo e incube con cambios de medio hasta que los marcadores endocrinos pancreáticos sean detectables mediante tinción inmunofluorescente. Esta figura muestra la unión de extremos no homólogos mediada por iCRISPR en hPSC. La eliminación de genes es altamente eficiente, ya que no implica ningún proceso de selección y se pueden lograr fácilmente mutantes bialélicos del 20% al 50%.

Para alteraciones genéticas eficientes y precisas, los ARN guía se cotransfectan con un donante de ADN monocatenario portador de la alteración de secuencia específica, que se muestra en rojo. A menudo, para evitar el recorte en alelos modificados, se recomienda incluir una mutación silenciosa en la secuencia PAM, que se muestra aquí en verde. Con este sistema, se puede lograr aproximadamente el 10% de los clones portadores de la modificación del genoma mediada por reparación dirigida por homología deseada, sin alteraciones adicionales en ambos alelos.

Una vez dominado, se tarda menos de dos meses en establecer una nueva línea iCas9 hPSC. Después de eso, se puede generar una variedad de líneas de colonias mutantes de hPSC en uno o dos meses. Tras la generación de líneas genéticas mutantes de hPSC, la diferenciación escalonada in vitro de las líneas celulares mutantes en células pancreáticas tipo beta nos permite estudiar las etapas específicas del desarrollo afectadas por estas mutaciones, lo que permitirá una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad.