Name: Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende a utilizar la plataforma iCRISPR para edición genómica en hPSC y su diferenciación hacia células pancreáticas. Este método permite estudiar el desarrollo pancreático humano y las bases moleculares de la diabetes in vitro.

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Este trabajo fue financiado en parte por el NIH / NIDDK (R01DK096239) y el estado de Nueva York Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ fue apoyada por la beca postdoctoral NYSTEM del Centro de Biología de Células Madre del Instituto Sloan Kettering.

<ol><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>González, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iCRISPR+Platform+for+Rapid%2C+Multiplexable%2C+and+Inducible+Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+of+Lineage+Determinants+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Reveals+Mechanisms+of+Pancreatic+Development+and+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).</li>
<li>Kotini, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+chromosomal+deletion+associated+with+myelodysplastic+syndromes+using+isogenic+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).</li>
<li>Carlson-Stevermer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Analysis+of+CRISPR-Cas9+Gene-Edited+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).</li>
<li>Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas-Mediated+Selection-free+Knockin+Strategy+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).</li>
<li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Interference+Efficiently+Induces+Specific+and+Reversible+Gene+Silencing+in+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+functional+glucagon-secreting+alpha-cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells.</a> Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+that+directs+differentiation+of+human+ESCs+into+the+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage.</a> Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Soh, C. L., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+Defined+Xeno-Free+E8+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium.</a> Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).</li>
<li>Kelly, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+markers+for+the+isolation+of+pancreatic+cell+types+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).</li>
<li>Musunuru, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+pluripotent+stem+cells+to+generate+human+cellular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models.</a> Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+correction+of+alpha1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+genome+editing+using+ssDNA+oligonucleotides+with+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases.</a> Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN+targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Gene-Corrected+Adult+Beta+Globin+Protein+in+Human+Erythrocytes+Differentiated+from+Patient+iPSCs+After+Genome+Editing+of+the+Sickle+Point+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Shi, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+hPSCs+Reveals+GATA6+Haploinsufficiency+and+a+Genetic+Interaction+with+GATA4+in+Human+Pancreatic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development.</a> Cell Stem Cell. , in press (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Consideraciones de tiempo para la generación de mutantes Líneas A pesar de los recientes enfoques basados ​​en sistemas / Cas CRISPR para la edición del genoma han dado lugar a una selección adecuada, una plataforma más eficaz y universal sería preferible que los análisis a gran escala de la función génica. La plataforma iCRISPR ofrece un método rápido y eficiente para introducir mutaciones en cualquier gen de interés 5, 9. En primer lugar, el método de síntesis gRNA basado en la PCR permite la producción de cientos de gRNAs en formato dispuestos en un día sin las etapas de clonación que consumen mucho tiempo. En segundo lugar, con la expresión inducible por doxiciclina Cas9 en iCas9 hPSCs, la etapa que implica la transfección gRNA requiere sólo una cantidad mínima de trabajo, y por lo tanto, múltiples gRNA experimentos de orientación puede llevarse a cabo al mismo tiempo. En tercer lugar, debido a la alta orientación eficiencias alcanzables con nuestro sistema, el análisis de ~ 24 - 48 colonias por gRNA transfectadas deben ser suffciente para establecer monoallelic múltiple y líneas mutantes bialélicos para un único gen, aunque las eficiencias varían en función del locus diana. Dado que es factible para una persona capacitada para recoger mecánicamente 384 colonias (placas de 4 x 96 pocillos) en una sola sesión, la cual debe tener ~ 4 h bajo un microscopio de disección, una persona capacitada puede esperar para generar líneas mutantes que afectan a 12 genes dentro de 12 meses. La generación de mutantes aerodinámico HPSC en poco tiempo permite el análisis sistemático de una gran variedad de factores de transcripción y / o componentes de la ruta de señalización que interactúan entre sí, la regulación del proceso de desarrollo 9. Además, eficiente focalización gen multiplexado también abre la puerta a la investigación de las interacciones genéticas subyacentes rasgos humanos complejos. Generación de modificaciones genéticas precisas La derivación de células iPS específicas para cada paciente de un tipo de células somáticas de fácil acceso<html> s y la diferenciación en tipos celulares relevantes de la enfermedad ofrecen una gran oportunidad para la validación funcional de las mutaciones asociadas a la enfermedad. Sin embargo, debido a la considerable variabilidad en el fondo genética entre los individuos, las comparaciones directas entre iPSCs de pacientes y de donantes sanos pueden no permitir a uno distinguir fenotipos de la enfermedad de los efectos de fondo. Por lo tanto, es necesario generar células iPS de control isogénicas mediante la corrección de la mutación de la enfermedad de nuevo a la secuencia de tipo salvaje o para introducir las mutaciones específicas para cada paciente en un fondo HPSC de tipo salvaje, tal como se propone por otros 25, 26. Además de las mutaciones (null) pérdida de la función, se puede ahora diseccionar más precisamente mecanismos de la enfermedad a través de la introducción de unos pacientes específicos de secuencia de las alteraciones en el locus endógeno en hPSCs, que incluye un paciente hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, o dominante negativo mutaciones. ntent &quot;&gt; modificación genética Precise emplea HDR para la reparación de DSB en presencia de una plantilla de reparación. Ya que es mucho menos eficiente que la reparación del ADN mediada por NHEJ, un plásmido donante que contiene la mutación específica del paciente, un casete de selección de drogas, y brazos de homología se ha utilizado previamente como la plantilla de reparación 2. Después de la selección de medicamentos y la verificación de la mutación específica del paciente, un segundo paso es generalmente necesario para eliminar el casete de selección de fármacos. Mientras que los más utilizados sistemas Cre-loxP y FLP-FRT dejan atrás secuencia residual en el locus endógeno, el uso de piggyBac transposón ha permitido la eliminación perfecta de la casete de selección de drogas 27. Más recientemente, las plantillas de ssDNA cortos también se han demostrado para apoyar HDR eficiente con endonucleasas de ADN de ingeniería 28. en comparación con un plásmido donante , ssDNA se puede sintetizar directamente y por lo tanto evita la etapa de clonación de tiempo. A continuación, tiene seren demostrado que, por co-transfección de gRNA y una plantilla de ssDNA para inducir la reparación de homología dirigida, iCRISPR se puede utilizar para introducir modificaciones de nucleótidos específicas con alta eficiencia. Esto es crítico para la disección no sólo el papel de nucleótidos esenciales dentro de los dominios funcionales de proteínas, sino también para el modelado de las mutaciones de enfermedades humanas y potencialmente corrección de estas mutaciones asociadas a la enfermedad para la intervención terapéutica. Debido al gran número de loci de susceptibilidad que están asociados cada uno con múltiples variantes de la secuencia, el modelado de enfermedades complejas y multigénicas como la diabetes ha sido un reto para los genetistas. Como la plataforma iCRISPR es permisiva para la rápida generación de una serie alélica o para la orientación del gen multiplexable, se puede facilitar la investigación de múltiples loci asociados a la enfermedad, ya sea individualmente o en combinación con fondos isogénicas. Orientación de Eficiencias y fuera de objetivo efectos Tenemos<html> encontrado una buena correlación entre los resultados del ensayo de RFLP T7E1 y y el número de líneas mutantes identificados por secuenciación. Esto pone de relieve la importancia de realizar estos ensayos en paralelo con el establecimiento de líneas clonales. Si bien las eficiencias de orientación alcanzado puede variar dependiendo de los loci genómico, en la mayoría de los experimentos de gen de la orientación individuales, 20-60% de los clones fueron encontrados con ambos alelos mutados (incluyendo dentro del marco y mutaciones frameshift) 9. En los casos en que se realizó la orientación gen multiplexado, triples clones mutantes bialélicos con 5 a 10% de eficiencia se obtuvieron 5. mediada por ssDNA HDR de varios genes también se realizaron para obtener alteraciones genéticas precisas, con la eficiencia de la obtención de homocigotos ronda en los clones que van de 1 - 10% 5. Trabajar con CRISPR / Cas en hPSCs, ninguna mutación en los sitios potenciales de fuera de objetivo que no comparten la misma secuencia diana gRNA aún no se han detectadolass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Secuenciación del genoma completo realizado en un estudio reciente también ha fallado en identificar mutaciones sustanciales fuera de objetivo en líneas clonales HPSC generada usando CRISPR / Cas 29. Sin embargo, para minimizar cualquier efecto potencial de confundir fenotipos introducidas por mutaciones en los sitios de efectos fuera de la meta, se sugiere para generar líneas mutantes independientes usando al menos dos gRNAs independientes dirigidas a diferentes secuencias dentro del mismo gen. fenotipos similares observados en múltiples líneas generadas usando diferentes gRNAs podría descartar principalmente la posibilidad de que el fenotipo viene de un efecto desviado. Alimentador dependiente frente al cultivo independiente y Orientación Los métodos tradicionales para el cultivo HPSC implican su mantenimiento y expansión de células alimentadoras en medios que contienen suero o suero de reemplazo que incluye animales prodpro-, tales como albúmina de suero bovino. células alimentadoras, suero, suero de recambio, y la albúmina todos contienen componentes complejos, no definidos y muestran una considerable variabilidad lote. La adaptación a la condición libre de alimentador y definido químicamente reduce significativamente los esfuerzos para el mantenimiento HPSC y, más importante, aumenta la consistencia de la diferenciación de los experimentos. En la actualidad, existen muy pocos estudios que describen los procedimientos de edición del genoma en hPSCs cultivadas en condiciones de cultivo completamente definidas 30. Hemos encontrado mayor eficiencia cuando la orientación CRISPR gRNA transfección y la deposición clonal se realizaron en condiciones libres de alimentador en comparación con las condiciones de cultivo de alimentación dependiente. Creemos que esto es debido al aumento de la supervivencia celular después de la transfección y la siembra de células individuales para la formación de colonias. Por otra parte, han sido previamente demostrado células alimentadoras para secuestrar los reactivos de transfección, lo que reduce la eficiencia de transfección. CombinatorioEdición genoma con diferenciación dirigida Protocolos de diferenciación anteriores han dado sólo una pequeña fracción de las células positivas para insulina, la mayoría de los cuales eran polyhormonal y se parecía a las células endocrinas fetales 23. El progreso reciente ha permitido la diferenciación de hPSCs en células más maduras sensibles a glucosa beta-como 16, 17, 19, 20. Podemos obtener de manera rutinaria las células del endodermo definitivo al menos el 75%, el 40% de las células beta-como sensibles a glucosa PDX1 + + Nkx6.1 progenitoras pancreáticas, y alrededor de 20% Nkx6.1 + + utilizando CPEP HUES8 hPSCs 9. Cuando se combina con el sistema de edición genoma iCRISPR, este protocolo de diferenciación más robusto ha facilitado el análisis de factores de transcripción que son cruciales para las etapas progenitoras pancreáticas endocrinas y de la diferenciación de páncreas. Esto haráEs posible, en futuros estudios, para examinar un gran número de genes candidatos enfermedad para la validación funcional y la investigación sobre los mecanismos que subyacen a la diabetes 9. Las aplicaciones futuras o llegar Nuestro sistema iCRISPR pueden facilitar la generación de las modificaciones que darán más complejas, tales como la creación de alelos reportero a través de la orientación de genes usando plantillas de ADN de gran donantes etiquetas de codificación de proteínas o reporteros fluorescentes 12 HDR-mediada. Hemos demostrado que, debido a la alta CRISPR orientación eficiencias logradas en el sistema, este proceso se puede realizar en hPSCs, sin la necesidad de una selección adicional de drogas 12. Por otra parte, el gen de multiplexado de direccionamiento puede ser utilizado para investigar las interacciones genéticas de la enfermedad humana compleja subyacente, como se muestra en nuestro estudio reciente, que creemos que es el primer ejemplo de este tipo de trabajo 31. iCRISPR también se puede utilizar para comprender el control de regulación de genes mediante la creación de deleciones tanto en los ARN no codificantes o en regiones reguladoras de genes, tales como promotores y potenciadores. Para generar eficientemente mutantes reguladores utilizando iCRISPR, gRNAs pueden ser diseñados para interrumpir el sitio de unión de una proteína de unión al ADN, incluyendo, pero no restringidos a la maquinaria transcripcional basal o un factor de transcripción específico de tejido. ssDNA HDR plantilla mediada también puede utilizarse para mutar los sitios específicos de unión a proteínas. Finalmente, prevemos que una optimización adicional permitiría el uso de la plataforma en iCRISPR hPSCs para análisis genéticos de rendimiento más altos de fenotipos de pluripotencia o fenotipos de la enfermedad cuando se combina con un protocolo de diferenciación in vitro. Estos estudios iCRISPR mediada podrá permitir que sea más rápida identificación de los genes y los estudios de su relevancia funcional asociados a la enfermedad candidatos.

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad tanto de auto-renovarse y dar lugar a todos los derivados de los tres linajes germinales embrionarias. Ellos proporcionan un recurso valioso para la terapia de reemplazo celular y la modelización de enfermedades, al servir como una plataforma única para recapitular los procesos celulares en un contexto de desarrollo humano. Son también una fuente de células para los análisis experimentales escalables y de alto rendimiento. Sin embargo, el progreso ha sido limitado debido a dos retos principales: la falta de herramientas de modificación genética eficientes y la dificultad para recapitular los pasos del desarrollo embrionario complejos en una placa de cultivo. La modificación genética es una herramienta indispensable para estudiar la función de genes en el desarrollo normal y la enfermedad. Sin embargo, mientras gen clásica estrategias selectivas mediante recombinación homóloga han demostrado ser una herramienta poderosa para diseccionar la función de genes en células madre embrionarias de ratón (mESCs) 1, este enfoqueha sido extremadamente ineficiente cuando se aplica a hPSCs 2, 3. La reciente adhesión a paso ligero de nucleasas programables, específicas del lugar de la naturaleza para uso en laboratorio, incluyendo nucleasas de dedos de zinc (ZFNs), transcripción activador de nucleasas efectoras (Talens) y los agrupados repeticiones palindrómicas cortas espaciadas regularmente (CRISPR) / CRISPR-asociado (Cas) sistemas 4, significa que la ingeniería del genoma se ha convertido en una tarea mucho más fácil en una amplia gama de organismos y líneas de células, incluso en hPSCs. Estas herramientas de edición gen se aprovechan del hecho de que las nucleasas quiméricas, tales como la endonucleasa de Cas9 pueden permitir una amplia gama de modificaciones genéticas mediante la inducción de roturas de doble cadena (DSBs) en lugares precisos, la activación de la maquinaria de reparación del ADN endógeno para activar o bien no homóloga terminar (NHEJ) o la reparación homología dirigida (HDR). Ambos mecanismos pueden ser explotados para la manipulación genética mediante la inducción de either inserción aleatoria y mutaciones de deleción (indeles; vía NHEJ), para crear mutaciones de desplazamiento del marco que anulan alelos de genes, o sustituciones de nucleótidos precisas (vía HDR), para recapitular las mutaciones de los pacientes para el modelado de la enfermedad humana o para corregir una mutación causante de la enfermedad para la terapia génica . CRISPR / ingeniería genómica mediada por Cas requiere dos componentes: la constante de Cas9 endonucleasa de ARN guiada necesaria para la escisión de ADN y un ARN CRISPR variable (crRNA) y dúplex de activación trans (tracrRNA) que especifica de reconocimiento de diana de ADN. El dúplex crRNA / tracrRNA se puede reemplazar con una sola guía de ARN quimérico (gRNA), que se han encontrado para trabajar más eficientemente 5, 6, 7. Mientras que el sistema / Cas9 CRISPR se ha adaptado para los organismos más experimentales y líneas celulares, la entrega y la expresión de Cas9 y gRNA varía significativamente y necesita ser optimizado aún más a Achivíspera de edición genoma eficiente en muchos sistemas, incluyendo hPSCs 8. Una plataforma genoma de edición eficiente, iCRISPR, se ha establecido en 5 hPSCs. En este sistema, un enfoque mediada por TALEN se ha utilizado para orientar ambos alelos del AAVS1 &quot;transgén puerto seguro locus&quot; en trans, un alelo con un transactivador inverso controlado por tetraciclina (M2rtTA) y la otra con un elemento de respuesta de tetraciclina (TRE ) que dirige la expresión de Cas9 (iCas9) en los hPSCs. En líneas clonales establecidas (iCas9 hPSCs), Cas9 es altamente expresado con el tratamiento doxiciclina. Mientras tanto, debido a su pequeño tamaño (100 nt), gRNAs individuales o múltiples se pueden entregar fácilmente en iCas9 hPSCs con alta eficiencia y pueden dirigir Cas9 para la escisión específica del sitio, lo que permite eficiente interrupción de genes mediada por NHEJ, así como mediada por HDR modificaciones de nucleótidos precisas en presencia de plantillas de donantes cortas de ADN de cadena sencilla (ssDNA). El sistema puede ser iCRISPRutilizado con éxito para generar un panel de líneas HPSC que imitan la enfermedad con bialélicas (homocigotas o heterocigotas compuestas) o mutaciones heterocigotas de pérdida de función en los genes de desarrollo importantes 5, 9. Aunque varios grupos han informado de edición génica eficaz usando CRISPR / Cas en hPSCs, el éxito sigue siendo limitada a un pequeño número de laboratorios tecnológicamente adeptos. La plataforma iCRISPR ofrece una solución eficiente y simple para la edición gen rutina por investigadores de diferentes niveles de habilidad, y que ya ha sido utilizado en una serie de estudios publicados por nuestro grupo y otros 9, 10, 11, 12. Este enfoque también se ha ampliado al silenciamiento inducible basado en la expresión de dCas9-KRAB 13. Junto con los avances en la tecno-edición genomalogía, mejoras significativas también se han logrado en HPSC mantenimiento y diferenciación dirigida. Las condiciones de cultivo para hPSCs han evolucionado a partir de las condiciones medias del ratón irradiado de fibroblastos embrionarios (IMEF) alimentador dependiente de condiciones libres de alimentador de los componentes de la matriz extracelular definidos, ya partir de formulaciones de medios complejos de constitución química definida 14. Estas mejoras han reducido la variabilidad en hPSCs debido a las diferencias de lote a lote en la preparación de los componentes de recambio y suero nocaut IMEF, y por lo tanto proporcionar un entorno más reproducible para la diferenciación HPSC. Mientras tanto, un mejor conocimiento de las vías que regulan el desarrollo embrionario humano, así como los descubrimientos de exámenes de drogas de alto rendimiento de señalización, se han llevado a mejorar los protocolos de diferenciación 15, 16, 17, 18. Estos protocolos se asemejan más en vivo pasos de desarrollo y generar tipos celulares que recapitular estrechamente sus homólogos en vivo. Para la diferenciación HPSC en el linaje de páncreas, protocolos iniciales imitaban el desarrollo de páncreas principios relativamente bien, pero finalmente generada células ß polyhormonal que eran de fenotipos fetales inmaduros y respondieron mal a la estimulación de la glucosa. Los avances recientes 16, 17, 19, 20 han permitido la generación de las células beta pancreáticas-como sensibles a glucosa, lo que nos permitirá investigar los acontecimientos posteriores, tales como la formación y la maduración de las células ß más monohormonal. A continuación, detallamos la aplicación de las líneas del genoma modificado para el estudio del desarrollo de páncreas mediante la combinación del sistema de iCRISPR con la plataforma basada en HPSC in vitro diferenciación hacia pancr respuesta a la glucosacélulas ß-como eatic. Este acoplamiento de potentes herramientas de edición genoma con un protocolo mejorado la diferenciación HPSC no sólo ofrece la velocidad y la escala necesaria para satisfacer la creciente demanda de la validación de la causalidad de la enfermedad, sino que también permite manipulaciones genéticas sofisticadas para realizar nuevas investigaciones mecanicistas en el control transcripcional que subyacen el desarrollo normal y la enfermedad 9 .

<table><tbody><tr><td>Medio químicamente definido (E8)</td>Medio basal <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 y suplemento Essential 8 incluidos</td></tr>: <tr><td>Forma humana recombinante truncada de vitronectina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibidor Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de disociación (enzima TrypLE Select)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, sin origen animal, enzima recombinante</td></tr><tr><td>G418 Sulfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Genética Antibiótico selectivo</td></tr><tr><td>Clorhidrato de puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Puromicina Antibiótico selectivo</td></tr><tr><td>ADN polimerasa (Herculasa II Fusión)</td><td>Agilent Technologies</td><td>600679</td><td>kit de PCR</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transcripción kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit de limpieza de transcripción</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Hicalato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>medio sérico reducido</td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de tejidos</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Kit de extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Roche 3115879001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>BLAR medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Hecho a medida con una formulación publicada (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>Suplemento de L-glutamina (GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biological Laboratories</td><td>7500855</td><td>Sin ácidos grasos</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Inhibidor de GSK-3</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Vitamina C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Inhibidor de erizo</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Ácido retinoico</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>Inhibidor de BMP</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Wnt antagonista&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>Activador PKC</td></tr><tr><td>3,3',5-Triyodo-L-tironina (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>ALX-270-445</td><td>Inhibidor de ALK5 II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD Millipore</td><td>565789</td><td>Inhibidor de la gamma secretasa XX, inhibidor de la señalización NOTCH</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acetilcisteína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>Análogo de la vitamina E</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>Receptor de tirosina quinasa AXL inhibidor</td></tr><tr><td>24 mm Transwell con inserto</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Sistema de Electroporación</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Cubetas de Electroporación</td><td>Bio-Rad 1652081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonucleasa I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Tampón 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Oligonucleótido largo Eton</td><td>Bioscience o IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anticuerpo FOXA2</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>anticuerpo CXCR4-APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 anticuerpo</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anticuerpo NKX2.2</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>anticuerpo NEUROD1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo de insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo de péptido C</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo glucagón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1.000</td></tr></tbody></table>

genoma edición y diferenciación dirigida de hpscs para interrogar determinantes linaje en el desarrollo humano de páncreas

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogar a la función de genes en auto-renovación o diferenciación de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) ofrece una plataforma valiosa para comprender el desarrollo humano y la disección de los mecanismos de la enfermedad en un plato. Para sacar provecho de esta aplicación potencial requiere herramientas de edición de genoma eficientes para generar mutantes HPSC en los genes asociados a la enfermedad, así como los protocolos de diferenciación in vitro HPSC para producir tipos de células relevantes de la enfermedad que recapitular estrechamente sus homólogos en vivo. Una plataforma de edición de genoma eficiente para hPSCs llamado iCRISPR se ha desarrollado a través de la focalización mediada por TALEN de un casete de expresión en el locus Cas9 AAVS1. Aquí, se describen los protocolos para la generación de líneas inducibles Cas9 HPSC utilizando células cultivadas en un medio químicamente definido y una condición libre de alimentador. Los procedimientos detallados para utilizar el sistema iCRISPR para la eliminación de genes o alteraciones genéticas precisas en hPSCs, ya sea a través de nen homóloga extremo de unión (NHEJ) o a través de alteraciones de nucleótidos precisas utilizando una plantilla de reparación de homología dirigida (HDR), respectivamente, están incluidos. Estos procedimientos técnicos incluyen descripciones del diseño, la producción y la transfección de ARN guía CRISPR (gRNAs); la medición de la tasa de mutación CRISPR por ensayos T7E1 o RFLP; y la creación y validación de líneas mutantes clonales. Por último, los procedimientos para la diferenciación de crónica HPSC en células beta pancreáticas-como sensibles a glucosa al imitar en el desarrollo embrionario del páncreas vivo. La combinación de la tecnología iCRISPR con la diferenciación dirigida HPSC permite el estudio sistemático de la función de genes para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo de la diabetes y las enfermedades del páncreas.

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Este protocolo demuestra cómo establecer la plataforma iCRISPR para la edición rápida del genoma en CPH humanas y cómo incorporar líneas con genoma editado mediante diferenciación pancreática dirigida de CPH para estudiar el desarrollo y las enfermedades pancreáticas humanas. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo pancreático humano, como el control genético del desarrollo pancreático normal y la base molecular de la diabetes. La principal ventaja de estas técnicas es que nos permiten modificar eficientemente genes de interés en CPH y utilizar estas líneas celulares modificadas para estudios del desarrollo y las enfermedades pancreáticas humanas in vitro.Cultive las cPSC humanas en condiciones químicamente definidas y libres de células alimentadoras sobre placas recubiertas con vitronectina humana truncada. El día anterior a la electrotransferencia, agregue 10 micromolar de inhibidor de ROCK durante el cambio de medio. El día de la electrotransferencia, prepare con anticipación placas de 10 centímetros recubiertas con vitronectina.A continuación, retire el medio de cultivo de las células, lávelas una vez con PBS sin calcio ni magnesio y trate luego las células con el reactivo de disociación 1X a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres minutos. A continuación, aspire el reactivo de disociación antes de que las células se hayan desprendido y agregue 10,5 mililitros de medio completo. Utilice pipeteo suave para formar una suspensión de células individuales antes de transferirlas a tubos de centrífuga.Realice un recuento celular en 500 microlitros de suspensión celular utilizando un contador celular automatizado. Luego, centrifugue las hPSC a 200 × g durante cinco minutos. Re suspenda las células en PBS frío a 12,5 × 10⁶ células por mililitro y alícuota en volúmenes de 800 microlitros.Agregue los plásmidos a cada suspensión de 800 microlitros de hPSC y mezcle bien. Transfiera la mezcla a una cubeta de electroforesis de 0,4 centímetros y mantenga en hielo durante aproximadamente cinco minutos. Electroforesis las células utilizando un sistema de electroforesis a 250 voltios y 500 microfaradios.Es fundamental utilizar hPSCs sanas y en proliferación para la edición del genoma. Después de la electrotransferencia, transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros con cinco mililitros de medio completo precalentado y luego haga el pellet de las células. Re-suspenda las células en 10 mililitros de medio completo con 10 micromolar de inhibidor de ROCK, y siembre una vez 10 a la sexta, 2,5 veces 10 a la sexta y cinco veces 10 a la sexta células de cada electrotransferencia en placas recubiertas con vitronectina, de modo que al menos una de las placas tenga colonias suficientes de células individuales para su selección.Cultive las células a 37 grados Celsius. En el día dos, inicie la selección con neomicina agregando medio que contenga 500 microgramos por mililitro de sulfato de G418. En el día seis, inicie la selección con puromicina agregando medio que contenga un microgramo por mililitro de clorhidrato de puromicina.Entre los días 10 y 12, las colonias de células individuales de hPSC alcanzarán de uno a dos milímetros de diámetro. En este momento, seleccione 12 a 24 colonias bajo un microscopio estereoscópico. Desagregue mecánicamente las colonias de hPSC en fragmentos pequeños utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros y transfiera las células directamente a placas de 24 pocillos recubiertas con vitronectina.24 horas antes de la transfección con ARN guía, trate las iPSC iCas9 con dos microgramos por mililitro de doxiciclina. El día de la transfección, prepare placas de 24 pozos recubiertas con vitronectina y disocie las células iCas9 en células individuales utilizando el reactivo de disociación 1X como antes. A continuación, haga un pellet de las células a 200 × g durante cinco minutos y resuspenda las células a 0,5 × 10⁶ células por mililitro en medio completo suplementado con dos microgramos por mililitro de doxiciclina y 10 micromolar de inhibidor de ROCK.Plaque 500 microlitros de las células resuspendidas en pozos individuales de la placa de 24 pozos. Para cada ARN guía, prepare las siguientes mezclas de transfección. Mezcla A, 50 microlitros de medio con suero reducido más un microlitro de ARN guía.Mezcle B, 50 microlitros de medio con suero reducido más tres microlitros de reactivo de transfección. Combine la mezcla A y B para obtener una mezcla final de 100 microlitros e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Añada 50 microlitros de la mezcla a las células en los pocillos duplicados de la placa de 24 pocillos y mezcle bien.Después de cuatro días, extraiga ADN genómico, amplifique por PCR las regiones diana que flanquean las secuencias de ARN guía y estime la eficiencia de edición mediante digestión con T7E1. Inicie la diferenciación de las líneas de CEP-h cuando las células hayan alcanzado una confluencia del 80 % dos días después de la siembra. Añada el medio del día cero de diferenciación y luego cambie los medios diariamente utilizando las fórmulas mostradas aquí.El día 10, examine mediante tinción de inmunofluorescencia los marcadores del progenitor pancreático tardío PP2, PDX1 y NKX6.1 en un subconjunto de las células. A continuación, continúe con el cultivo en interfase aire-líquido tratando primero las células PP2 con un inhibidor de ROCK de 10 micromolar durante cuatro horas. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, disocie las células como antes.Minimice la duración del tratamiento con el reactivo de disociación para maximizar la supervivencia celular durante la siembra en la etapa de diferenciación en interfaz aire-líquido. Aspire el reactivo de disociación antes de que las células se desprendan. A continuación, agregue 10 mililitros de medio boo-lah a la placa y disperse las células PP2 en células individuales pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.Recoger la suspensión de células individuales. Contar el número de células y centrifugar para obtener el sedimento celular. Después de resuspender el sedimento celular en medio de diferenciación S5, colocar de cinco a diez microlitros de células por punto sobre un filtro de inserto tipo transwell.Añada el medio S5 al fondo de cada inserto de transbien y incube con cambios de medio hasta que los marcadores endocrinos pancreáticos sean detectables mediante tinción inmunofluorescente. Esta figura muestra la unión de extremos no homóloga mediada por iCRISPR en células madre pluripotentes humanas. La interrupción génica es altamente eficiente, ya que no se requiere ningún proceso de selección, y se puede lograr fácilmente entre un 20 % y un 50 % de mutantes bialélicos.Para realizar alteraciones genéticas eficientes y precisas, los ARN guía se coprecipitan junto con un donador de ADN de cadena sencilla que porta la alteración de secuencia específica, mostrada en rojo. A menudo, para evitar nuevos cortes en los alelos modificados, se recomienda incluir una mutación silenciosa en la secuencia PAM, mostrada aquí en verde. Con este sistema, puede lograrse aproximadamente un 10 % de clones que portan la modificación del genoma mediada por reparación dirigida por homología deseada, sin alteraciones adicionales en ambos alelos.Una vez dominado, se necesitan menos de dos meses para establecer una nueva línea de iPSC con iCas9. Después de eso, se pueden generar varias líneas de colonias mutantes de iPSC en uno o dos meses. Tras la generación de líneas mutantes genéticas de iPSC, la diferenciación escalonada in vitro de las líneas celulares mutantes en células beta pancreáticas permite estudiar los pasos específicos del desarrollo afectados por estas mutaciones, lo que permitirá una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de las enfermedades.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El estudio actual describe un enfoque de diferenciación dirigida en la inducción de diferenciación pancreática de células madre embrionarias humanas. De gran importancia es la constatación de que las células endoteliales de co-cultivo de maduración media de las células madre embrionarias derivan en células progenitoras pancreáticas de insulina que expresan.

Células endoteliales Co-cultura media la maduración de embriones humanos de células madre a las células productoras de insulina del páncreas en un enfoque de diferenciación dirigida

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D

La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en grupos de islotes productores de insulina

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprende a utilizar la plataforma iCRISPR para edición genómica en hPSC y su diferenciación hacia células pancreáticas. Este método permite estudiar el desarrollo pancreático humano y las bases moleculares de la diabetes in vitro.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

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